本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組用于羊源性實時熒光PCR檢測的特異性引物和探針。

背景技術(shù)：

羊肉包括綿羊肉和山羊肉，因其具有天然的滋補(bǔ)功效，長期以來都受到廣大消費(fèi)者的青睞。隨著市場流通的日益發(fā)達(dá)，羊肉經(jīng)過冷凍、加工后再出售已成為現(xiàn)代市場營銷的主要手段，但是羊肉一般經(jīng)過冷凍，特別是經(jīng)過加工后的熟羊肉通過感官檢查已很難區(qū)分真?zhèn)危驗橐恍┎环ㄉ特溤诟哳~利潤的驅(qū)使下，在肉制品的生產(chǎn)和銷售中利用鴨肉或豬肉以假充真、以次充好，這引起了廣大消費(fèi)者的強(qiáng)烈憤慨。這不僅僅涉及到經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)等問題，更直接影響著消費(fèi)者的健康，尤其是對某些食物過敏的消費(fèi)者。此外，還會涉及到宗教信仰的問題，如在清真食品中摻雜進(jìn)豬肉等。

目前許多國家已頒布法令禁止將羊源性成分作為蛋白質(zhì)添加到飼料中。為避免此類事件的發(fā)生，人們開始用多種方法檢測肉骨粉中的羊源性成分，其中主要包括顯微鏡檢法、近紅外光鏡法、ELISA法和PCR方法。但隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，我們發(fā)現(xiàn)，科學(xué)研究中普遍使用的實時熒光定量PCR方法和普通PCR相比，在羊源性的檢測工作中無論是在操作簡便性還是反應(yīng)靈敏度方面都具有更大的優(yōu)勢。

實時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。在試驗中使用了探針檢測，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)合成的新鏈移動到探針結(jié)合位置時，Taq酶將探針切斷，探針的完整性遭到破壞，熒光報告基團(tuán)的熒光信號被釋放出來。模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，同時伴有一個熒光信號的釋放。產(chǎn)物與熒光信號產(chǎn)生一對一的對應(yīng)關(guān)系，隨著產(chǎn)物的增加，熒光信號不斷增強(qiáng)，從而對整個PCR反應(yīng)過程進(jìn)行實時和動態(tài)的監(jiān)測分析。

本發(fā)明根據(jù)羊特異性線粒體DNA片段，設(shè)計合成一對引物，利用引物建立一種運(yùn)用PCR技術(shù)鑒定真假羊肉的方法，并對大量市售羊肉制品進(jìn)行羊源性成分檢測，為保護(hù)廣大消費(fèi)者的利益和進(jìn)一步落實食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度提供了技術(shù)保障，也更好地為食品監(jiān)管部門提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于設(shè)計一組羊源性特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應(yīng)用于動物飼料和羊肉中羊源性成分檢測的快速、靈敏、特異性好的熒光定量PCR檢測的方法。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，將羊源性DNA的cytb基因種內(nèi)保守片段插入到載體pMD18-T中，獲得含有cytb基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)羊源性cytb的基因片段編碼基因序列設(shè)計并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進(jìn)行評估。

本發(fā)明的第一個目的是提供了一組用于羊源性實時熒光PCR檢測的特異性引物和探針，所述特異性引物和探針的核苷酸序列為（1）或（2）中的一種：

（1）、上游引物：5'- TTTGCGACAATAGCCACAGC -3'

下游引物：5'- ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT -3'

探針：5'- TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA -3'

所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.3；

（2）、與（1）所述序列互補(bǔ)的序列。

作為優(yōu)選，所述探針的5’端熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

本發(fā)明的第二個目的是提供羊源性的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒為羊源性的定性或定量檢測試劑盒；所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物和探針；

作為優(yōu)選，所述定量檢測試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為：將羊源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含有羊源性保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品；所述羊源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2；

作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述羊源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列為模板，使用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的：

上游引物：5'- CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA -3'

下游引物：5'- AATGGTGTAATAAGGGTGGAA -3'；

作為優(yōu)選，所述PCR擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃ 10min。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述特異性引物和探針在制備定性或定量檢測羊源性的試劑盒中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述應(yīng)用是分別以標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品DNA為模板，利用特異性引物和探針進(jìn)行實時熒光定量PCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值判定結(jié)果。

作為優(yōu)選，所述實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。

本發(fā)明的第四個目的是提供羊源性的實時熒光定量PCR檢測方法，所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實施對象，步驟如下：

（1）制備標(biāo)準(zhǔn)品：將羊源性保守基因片段插入到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得含有羊源性保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品；所述羊源性保守基因片段為序列表中SEQ ID No.2；

（2）使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體系進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增；

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；

（4）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行羊源性的快速定量檢測。

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述羊源性保守基因片段是通過以下引物擴(kuò)增得到的：

上游引物為5'- CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA -3'；

下游引物為5'- AATGGTGTAATAAGGGTGGAA -3'；

作為優(yōu)選，PCR擴(kuò)增所述羊源性保守基因片段的條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃ 10min；

作為優(yōu)選，步驟（2）中所述引物和探針的用量均為1.6μl；

作為優(yōu)選，步驟（2）中所述實時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。

本發(fā)明的第五個目的是提供羊源性的定性PCR檢測方法，所述檢測方法不以有生命的人體或動物體為直接實施對象，步驟如下：

（1）使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增；

（2）通過待測樣品的Ct值對羊源性進(jìn)行定性檢測：當(dāng)Ct值小于38時，為陽性；否則，為陰性；

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述引物和探針的用量均為1.6μl；

作為優(yōu)選，步驟（1）中所述實時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。

本發(fā)明提供用于對羊源性進(jìn)行定性、定量檢測的引物和探針，通過提取待檢測樣品的DNA結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確定量待測動物飼料和羊肉中羊源性含量的目的。本發(fā)明所提供的引物和探針可對動物飼料和羊肉的羊源性含量進(jìn)行定性、定量分析，對判斷動物飼料和羊肉中羊源性含量具有重要意義，本發(fā)明將在食品檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為引物和探針體系優(yōu)化實驗結(jié)果；其中，a代表引物為1.6μl，探針為1.6 μl；b代表引物為1.0μl，探針為1.6 μl；c代表引物為1.0μl，探針為0.8 μl；d代表引物為2.0μl，探針為0.8 μl；e代表引物為1.6μl，探針為0.8 μl；f代表引物為2.0μl，探針為1.0 μl；g代表引物為1.0μl，探針為0.8 μl；h代表引物為1.0μl，探針為1.0 μl；i代表引物為2.0μl，探針為1.6 μl；

圖2為靈敏度實驗結(jié)果；其中，a代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁷copies/ml、b代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁶copies/ml、c代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁵copies/ml、d代表質(zhì)粒濃度為1.00×10⁴copies/ml、e代表質(zhì)粒濃度為1.00×10³copies/ml、f代表質(zhì)粒濃度為1.00×10²copies/ml和陰性對照；

圖3為特異性實驗結(jié)果；其中，出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為羊，未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為豬、牛、狗、魚、雞、鴨、鵝、兔、驢、蛙、鼠、陰性對照。

圖4為羊源性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及具體實施方案對本發(fā)明做更詳細(xì)闡述。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

實施例1 cytb基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備

要建立實時熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含高度保守、特異的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。動物線粒體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)保守、熱穩(wěn)定性好、不易降解的結(jié)構(gòu)特點和母系遺傳、拷貝數(shù)多、進(jìn)化速度快、不發(fā)生重組的遺傳特點，其中線粒體細(xì)胞色素b（cytb）基因序列最為保守型。cytb基因檢測羊源性，有較高的敏感性和特異性。本發(fā)明主要采用PCR技術(shù)擴(kuò)增羊源性cytb基因，利用基因重組技術(shù)將其連接到質(zhì)粒載體pMD18-T中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMD18-T-sheepcytb，并進(jìn)行相應(yīng)的PCR鑒定和測序鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標(biāo)準(zhǔn)品，為下一步的方法及評估奠定基礎(chǔ)。

一、模板DNA的制備

1.提取羊肝臟組織基因組DNA，用作cytb基因PCR擴(kuò)增的模板；提取基因組DNA的試劑盒為細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）采購自百泰克生物技術(shù)有限公司；

（1）取1.5g新鮮羊肝臟組織用液氮研磨成粉末，加到5ml離心管中，加入4ml SE緩沖液，混勻，4500 r/mim離心15min；

（2）吸取上清，4℃ 12000 r/min離心20min，棄上清，收集沉淀；

（3）加入400μl Buffer Digestion，震蕩混勻。65℃水浴1-3h至細(xì)胞完全裂解 （注意：1、水浴過程中，每10分鐘顛倒混勻一次，可促進(jìn)樣品裂解?；旌弦鹤兂吻逋该鳛榱呀馔耆Ｈ缛芤何醋兂吻?，說明細(xì)胞裂解不徹底，應(yīng)當(dāng)延長水浴時間，否則將可能降低DNA的得率或?qū)е绿崛〉腄NA不純。2、如需得到無RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室溫放置2-5分鐘）加入200μl Buffer PA，充分顛倒混勻，置于-20℃冰箱放置5min；

（4）4℃ 10000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管中；

（5）加入等體積的異丙醇，顛倒5-8次使之充分混勻-20℃，放置20min；

（6）4℃ 10000rpm離心10分鐘，棄上清；

（7）加入1ml預(yù)冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃ 10000rpm離心2分鐘，棄上清；

（8）開蓋室溫倒置10-20min，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。得到的DNA用30-50μl純凈水溶解；

（9）提取的DNA可進(jìn)行下一步實驗或－20℃保存。

2. 動物飼料中羊源DNA的提取

（1）稱取0.5-2g肉骨粉樣品于10ml離心管中，加入適量含10% SDS (采購自百泰克生物技術(shù)有限公司)和10μg/ml蛋白酶K（蛋白酶K采購自百泰克生物技術(shù)有限公司）的裂解液，37℃保溫過夜；

裂解液的配方為：7M Urea(60. 06) 4.2042 g

2M thiourea(76.12) 1.5224 g

100mM DTT 0.1543 g

4% CHAPS 0.4 g

0.5mM EDTA 0.00146 g

40Mm Tris 0.0485 g

2%(v/v) NP-40 0.2 ml

1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml

5mM PMSF用前加 0.00871 g

2%pharmalyte 0.2ml；

（2）2000g離心5min。取離心上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）(采購自大連寶生生物技術(shù)有限公司)混勻，靜置5min；

（3）8000g離心5min。取離心上清液加0.65倍體積的異丙醇（異丙醇含量≥99%采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），混勻，12000g 4℃離心10min；

（4）棄上清液，加500μL 70%冰乙醇（采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；

（5）12000g 4℃離心5min。取沉淀，吹干。加50μL TE或ddH₂O溶解白色沉淀，此即為DNA提取物。

二、cytb基因片段的PCR擴(kuò)增

1、引物的設(shè)計與合成

本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中羊cytb全序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對分析，選取適合設(shè)計引物和探針的保守片段序列為靶目標(biāo)，應(yīng)用Primer express 3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計了一組實時熒光定量PCR引物和探針以及一組相關(guān)序列的外圍引物。

本發(fā)明選取的擴(kuò)增序列如下：

該外圍引物序列如下：

上游引物：sheepcytb328F：5'-CTAGAAACATGAAACATCGGAGTA -3'

下游引物：sheepcytb678R：5'-AATGGTGTAATAAGGGTGGAA-3'

擴(kuò)增片段大小為：351bp。

2、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

以DNA為模板，以上述外圍引物sheepcytb328F / sheepcytb678R為擴(kuò)增引物，采用下述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：

10×PCR buffer 5μl

dNTP（2.5μM） 2μl

引物F（10μM） 2μl

引物R（10μM） 2μl

模板 2.4μl

Taq酶（5U） 1.6μl

ddH₂O 35μl

總體積 50μl。

其中引物采用sheepcytb328F / sheepcytb678R，Taq酶采用北京百泰克Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR擴(kuò)增儀為北京百泰克iCycling系列96梯度PCR儀。

擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件：

94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃ 10min，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，檢測PCR產(chǎn)物大小，然后采用Axygen公司生產(chǎn)的DNA凝膠回收試劑盒純化回收剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

三、重組質(zhì)粒pMD18-T-sheepcytb的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

1、連接反應(yīng)：將上述純化得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T（大連寶生物公司）進(jìn)行連接，采用如下連接體系進(jìn)行配制：

pMD18-T vector 1μL

回收DNA 2μL

SolutionⅠ 5μL

ddH₂O 2μL

總體積 10μL。

配制完成后置于16℃進(jìn)行過夜連接反應(yīng)。

2、pMD18-T-sheepcytb質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定

（1）從-70℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰盒上使其自然解凍；

（2）取連接產(chǎn)物10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘；

（3）42℃水浴中熱休克90秒，熱休克后立即置冰上冷卻2min；

（4）向1.5ml EP管中加入預(yù)冷的400μl的LB液體培養(yǎng)基（不含氨芐青霉素）混勻后，37℃ 200轉(zhuǎn)/分輕搖培養(yǎng)1h；

（5）將上述培養(yǎng)液搖勻后取100ul涂布于含100mg/ml Amp、24mg/ml IPTG、20mg/ml X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜；

（6）次日觀察，從平板上挑取白色單克隆菌落于100μL LB液體培養(yǎng)基（含100mg/ml氨芐青霉素）的PCR管中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時。吸取2μL作為模板進(jìn)行PCR鑒定，剩余的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)搖；

（7）用載體通用引物RV-M/M13-47擴(kuò)增上述稀釋菌液，PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，通過檢測PCR產(chǎn)物大小鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

引物RV-M/M13-47序列如下：

引物 RV-M: 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’

引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR反應(yīng)體系如下：

10×PCR buffer 2.5μL

dNTP（2.5μM） 0.5μL

引物F（10μM） 0.5μL

引物R（10μM） 0.5μL

模板 2μL

Taq 酶（5U） 0.5μL

ddH₂O 18.5μL

總體積 25μL。

擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃ 10min。

（8）采用Axygen公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒，測定濃度和純度，同時吸取一部分純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。

四、標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量

1、將步驟三得到的含有重組質(zhì)粒pMD18-T-sheepcytb的大腸桿菌DH5α100μL轉(zhuǎn)種于5mL的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 200rpm過夜搖培；

2、取1ml培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)種于30ml LB液體培養(yǎng)基，200rpm 增菌培養(yǎng)2-3小時，然后采用Axygen公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取質(zhì)粒；

3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可見分光光度計（ND5000）對提取的質(zhì)粒進(jìn)行測定，測定A₂₆₀、A₂₈₀，根據(jù)A₂₆₀/A₂₈₀判斷質(zhì)粒的純度。

4、質(zhì)粒pMD18-T-sheepcytb濃度（拷貝數(shù)）計算

（1）質(zhì)粒的分子量=3043bp×660（每對堿基的平均分子量）

（2）測得質(zhì)粒濃度為100.23ng/μl，質(zhì)粒純度A₂₆₀/A₂₈₀=1.94，A₂₆₀/A₂₃₀=2.01。因在進(jìn)行實時熒光定量PCR時，需要以“拷貝數(shù)”為單位，因此需要將單位轉(zhuǎn)換成copies/ml。

質(zhì)粒 copies/ml=阿伏伽德羅常數(shù)×質(zhì)粒摩爾數(shù)

其中阿伏伽德羅常數(shù)=6.02×10²³copies/mol。

因此提取的質(zhì)粒濃度copies/ml=100.23×10^-9g/ml×6.02×10²³copies/mol÷（3043bp×660g/bp·mol）=3.0×10¹⁰copies/m0l

10μl質(zhì)粒+20μl的無菌水就得到濃度為1.00×10¹⁰copies/ml的質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋就可得到一系列濃度的質(zhì)粒，作為系列標(biāo)準(zhǔn)品，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2 實時熒光定量PCR羊源性方法的建立

一、特異性引物和探針的設(shè)計與合成

以上述選取的羊的cytb基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用Primer express 3軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計了一組實時熒光定量PCR引物和探針。

作為本發(fā)明的核心，一組用于羊源性實時熒光PCR檢測的引物和探針核苷酸序列如下：

上游引物：sheepcytb361F：5’-TTTGCGACAATAGCCACAGC-3’

下游引物：sheepcytb512R: 5’-ATCGGGTGAGGGTAGCTTTGT-3’

探針：sheepcytb415P: 5’-TCATTCTGAGGAGCAACAGTTATTACCAA-3’

該引物和探針擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列為：

探針5’端的熒光報告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

二、待測樣本的制備

1、羊肉中羊源DNA的制備

羊肉中的羊源DNA提取采取的是羊肝臟部位，具體見實施例1步驟一“模板DNA的制備”，提取羊肝臟組織基因組DNA，用作cytb基因PCR擴(kuò)增的模板。

2、動物飼料中羊源DNA的提取

1.稱取0.5-2g肉骨粉樣品于10ml離心管中，加入適量含10%SDS(采購自百泰克生物技術(shù)有限公司)和10μg/ml蛋白酶K（蛋白酶K采購自百泰克生物技術(shù)有限公司）的裂解液，37℃保溫過夜；

2.2000g離心5min。取離心上清液，加等體積酚/氯仿/異戊醇（三者的體積比為25/24/1）(采購自大連寶生生物技術(shù)有限公司)混勻，靜置5min；

3.8000g離心5min。取離心上清液加0.65倍體積的異丙醇（異丙醇含量≥99%，采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），混勻，12000g 4℃離心10min；

4.棄上清液，加500μL 70%冰乙醇（采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；

5.12000g 4℃離心5min。取沉淀，吹干。加50μL TE或ddH2O溶解白色沉淀，此即為DNA提取物。

三、實時熒光定量PCR條件優(yōu)化

以濃度為1.00×10⁶copies/ml的陽性質(zhì)粒為模板，采用百泰克公司生產(chǎn)的2×real-time PCR Premixture（probe）實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實驗，實驗采用的實時熒光定量PCR儀為蘇州百源基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ASA-9600實時熒光定量PCR儀。反應(yīng)體系采用20μl 體系，其中引物和探針的量采用表1組合進(jìn)行反應(yīng)。

表1 PCR反應(yīng)體系中引物和探針不同用量

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。結(jié)果參照圖1，數(shù)據(jù)顯示20μl 體系時，引物（5μM）和探針（5μM）分別加入1.6μl，Ct值最小，熒光信號最強(qiáng)。

四、方法評估

1、靈敏度實驗

將實施例1制備得到的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實驗，選取濃度為1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作為梯度模板。反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.6μl

Primer R（5μM） 1.6μl

Probe（5μM） 1.6μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。根據(jù)儀器所檢測到的熒光信號經(jīng)軟件處理獲得熒光曲線，觀察熒光曲線的信號，結(jié)果參照圖2，數(shù)據(jù)顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度達(dá)到1.00×10³copies/ml時依然有熒光信號，但質(zhì)粒濃度達(dá)到1.00×10²copies/ml時未檢測到熒光信號，因此該方法的靈敏度為1.00×10³copies/ml。

由圖1和圖2還可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線光滑。

2、特異性實驗

為了證實本發(fā)明對羊源性檢測的特異性，我們選取了常見的11種動物做特異性實驗，選取的動物包括：豬、牛、狗、魚、雞、鴨、鵝、兔、驢、蛙、鼠。

該特異性試驗包括用上述樣本的基因組DNA為模板進(jìn)行的試驗。反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.5μl

Primer R（5μM） 1.5μl

Probe（5μM） 1.5μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。根據(jù)儀器所檢測到的熒光信號經(jīng)軟件處理獲得熒光曲線，觀察熒光曲線的信號，分析特異性。結(jié)果參考圖3，具體結(jié)果僅羊組織檢測為陽性，其余動物均為陰性，表明本發(fā)明具有很好的特異性。檢測結(jié)果如表2所示。

表2 特異性實驗檢測結(jié)果

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)得到羊源性的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為待測樣品定量測定的參照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果參考圖4。由圖4可知，Ct值和拷貝數(shù)呈較好的線性關(guān)系；以模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，標(biāo)準(zhǔn)曲線原始方程為y=a+bx，本次標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=43.10-3.46x，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合實時熒光PCR定量的要求。

4、待測樣品的定量檢測

以待測樣品DNA和標(biāo)準(zhǔn)品的DNA為模板，用羊的特異性引物，以相同的體系同時進(jìn)行羊cytb的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.6μl

Primer R（5μM） 1.6μl

Probe（5μM） 1.6μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行動物飼料、植物油和羊肉中羊源性的快速定量檢測。

5、待測樣品的定性檢測

以待測樣品DNA為模板，用羊的特異性引物，對待測樣品DNA進(jìn)行羊cytb的基因片段的熒光定量PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系如下：

2×premix 10μl

Primer F（5μM） 1.6μl

Primer R（5μM） 1.6μl

Probe（5μM） 1.6μl

模板 2μl

ddH₂O補(bǔ)至 20μl。

反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2分鐘，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。通過待測樣品的Ct值對動物飼料、植物油和羊肉中中羊源性進(jìn)行定性判斷：當(dāng)Ct值小于38時，為陽性；否則，為陰性。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 蘇州百源基因技術(shù)有限公司

<120> 一組用于羊源性的實時熒光PCR檢測的特異性引物和探針

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatcaaca tccgaaaaac ccacccacta ataaaaattg taaacaacgc attcattgat 60

ctcccagctc catcaaatat ttcatcatga tgaaactttg gctctctcct aggcatttgc 120

ttaattttac agattctaac aggcctattc ctagcaatac actatacacc tgacacaaca 180

acagcattct cctctgtaac ccacatttgc cgagacgtaa actatggctg aattatccga 240

tatatacacg caaacggggc atcaatattt tttatctgcc tatttatgca tgtaggacga 300

ggcctatact atggatcata taccttccta gaaacatgaa acatcggagt aatcctccta 360

tttgcgacaa tagccacagc attcataggc tatgttttac catgaggaca aatatcattc 420

tgaggagcaa cagttattac caacctcctt tcagcaattc catatattgg cacaaaccta 480

gtcgaatgaa tctggggagg attctcagta gacaaagcta ccctcacccg atttttcgcc 540

tttcacttta ttttcccatt catcatcgca gccctcgcca tagttcacct actcttcctc 600

cacgaaacag gatccaacaa ccccacagga attccatcgg acacagataa aattcccttc 660

cacccttatt acaccattaa agacatccta ggtgctatcc tactaatcct catcctcatg 720

ctactagtac tattcacgcc tgacttactc ggagacccag acaactacac cccagcaaac 780

ccacttaaca ctccccctca catcaaacct gaatgatact tcctatttgc gtacgcaatc 840

ttacgatcaa tccctaataa actaggagga gtcctcgccc taatcctctc aatcctagtc 900

ctagtaatta tacccctcct ccatacatca aagcaacgga gcataatatt ccgaccaatc 960

agtcaatgta tattctgaat cctagtagcc gacctattaa cactcacatg aattggaggc 1020

cagccagttg aacaccccta catcattatt ggacaactag catctattat atatttcctt 1080

atcattctag tcataatacc agtagctagc atcatcgaaa acaacctcct aaaatgaaga 1140

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctagaaacat gaaacatcgg agtaatcctc ctatttgcga caatagccac agcattcata 60

ggctatgttt taccatgagg acaaatatca ttctgaggag caacagttat taccaacctc 120

ctttcagcaa ttccatatat tggcacaaac ctagtcgaat gaatctgggg aggattctca 180

gtagacaaag ctaccctcac ccgatttttc gcctttcact ttattttccc attcatcatc 240

gcagccctcg ccatagttca cctactcttc ctccacgaaa caggatccaa caaccccaca 300

ggaattccat cggacacaga taaaattccc ttccaccctt attacaccat t 351

<210> 3

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttgcgacaa tagccacagc attcataggc tatgttttac catgaggaca aatatcattc 60

tgaggagcaa cagttattac caacctcctt tcagcaattc catatattgg cacaaaccta 120

gtcgaatgaa tctggggagg attctcagta gacaaagcta ccctcacccg at 172