本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體地涉及一種改進的ARMS引物結構(在本發(fā)明以下內容中簡稱為Super-ARMS)及其使用方法。
背景技術：
：ARMS技術是一種在PCR基礎上發(fā)展起來用于檢測DNA點突變的新方法，突變擴增系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)又稱等位基因特異性擴增法(allelespecificamplification,ASA)，是Newton等首先建立用來檢測已知突變的方法。其依據(jù)的基本原理是：TaqDNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，因此對于3′末端錯配的引物，以低于正常末端配對引物的速度延伸，當錯配堿基的數(shù)目達到一定程度或者條件達到一定的嚴謹程度時，3′末端堿基則因磷酸二酯鍵形成困難而不能延伸，反應終止，也就得不到特異長度的擴增片段，從而表明模板DNA沒有與引物3′末端相應的突變；如果PCR結果能得到特異長度的擴增片段，表明模板DNA上具有與引物3′末端相應的突變。然而，現(xiàn)有的ARMS引物對有些突變的區(qū)分能力有限，檢測靈敏度受限，因此，該技術在檢測靈敏度等方面有待提高。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種在改進的ARMS引物結構(Super-ARMS)，以解決現(xiàn)有技術中存在的上述問題。本發(fā)明提供的技術方案如下：一種改進的ARMS引物結構(Super-ARMS)，其特征在于,包括：正向特異引物，它包括如下三部分：1)第一序列，其長度為15-40個堿基，3′末端第1位堿基為突變位置，3′末端第2-4位有一錯配堿基，其余堿基和待測序列互補；2)第二序列，其長度為6-20個堿基，其和第一序列互補；3)spacer,其連接第一序列的5′末端和第二序列的3′末端；反向通用引物，其長度為15-40個堿基，和待測序列的另一條鏈互補；其中，所述的反向通用引物的Tm值比正向引物的第一序列的Tm值低3-8℃。本發(fā)明改進的ARMS引物結構(Super-ARMS)，在通常情況或合適條件下(例如室溫)，正向引物的第一序列和第二序列結合成為雙鏈；當引物結構與靶序列識別并雜交時，雙鏈結合的部分被打開，兩者之間以Spacer連接，引物與靶序列結合而獲得DNA延伸能力。在本發(fā)明中，所述的待測序列可以是野生型基因序列或是突變型基因序列。也即，第一序列堿基可以是與野生型基因序列完全互補，而與突變型不匹配；也可以是與突變型互補而與野生型不匹配。作為優(yōu)選，堿基的錯配類型，如果3′端是“強”錯配(A/G或C/T)則需要引入“弱”的錯配(C/A或G/T)或不需引入錯配即可阻斷3′端的擴增，反之亦然；同樣，當3′端是“中度”錯配(A/A、C/C、G/G或T/T)則需要引入“中度”的錯配。作為優(yōu)選，第一序列長度為18-30個堿基。作為優(yōu)選，第二序列長度為8-16個堿基。作為優(yōu)選，spacer可以選自C18，C3，C6，C12等中的一種。非自然核苷酸的使用：任何非自然核苷酸，如LNA、PNA，均可以在引物的任何位置使用。本發(fā)明提供了一種改進的ARMS引物結構(Super-ARMS)，本發(fā)明改進的引物結構可以用于實時PCR中特異靶序列的擴增檢測。目前引物適用的實時PCR儀器包括：AppliedBiosystems(ABI)公司的7300、7500、7700、7900、Stepone、SteponePlus，Bio-Rad公司的CFX96、IQCycler,Roche公司的LightCycler2.0、LightCycler480，Qiagen公司的Rotor-GeneQ，Stratagene公司的Mx3000P和Mx3005P等等。本發(fā)明的又一技術方案為：一種改進的ARMS-PCR體系，它包括前述的改進的ARMS引物結構(Super-ARMS)。作為優(yōu)選，該改進的ARMS-PCR體系還包括熒光探針。作為優(yōu)選，改進的ARMS-PCR體系，還包括Block引物,其長度為15-50bp。在合適退火溫度下，Block引物與野生型模板優(yōu)先結合從而阻斷ARMS引物與野生型模板的結合，而ARMS引物可以與突變靶序列結合，并通過PCR反應將突變模板DNA進行富集放大后從而提高檢測靈敏度。作為優(yōu)選，Block引物長度為25-45bp，在Block引物的3′末端進行-NH2修飾封閉，Block引物與野生型模板完全匹配，與ARMS引物5′末端等長，突變位點位于Block引物3′末端的第0-5個堿基位置處。除了-NH2修飾，還可采用磷酸化、雙脫氧堿基修飾等。本發(fā)明的再一技術方案為：一種AMRS-PCR方法，在PCR過程中，它采用了前述的一種改進的ARMS引物結構(Super-ARMS)。作為優(yōu)選，該方法還包括前述的Block引物。作為優(yōu)選，該方法還還包括使用熒光探針。本發(fā)明的熒光探針類型不限，可以采用現(xiàn)有的各種結構，例如：直鏈探針，莖環(huán)結構探針等。熒光探針的熒光劑和淬滅劑類型也不限，包括：FAM、HEX、VIC、ROX、BHQ、TAMRA等本發(fā)明的優(yōu)點如下：采用本發(fā)明的Super-ARMS引物結構，能夠顯著減少非特異性擴增，提高特異性。由于該Super-ARMS引物結構提高了突變型與野生型之間的區(qū)分能力，使得反應體系擴增效率可通過諸多因素進行調整，因此檢測靈敏度可高至1拷貝/μL。附圖說明圖1為本發(fā)明結構的引物結構示意圖；圖2為為本發(fā)明的原理示意圖；圖3為Block存在時的反應示意圖；圖4為實施例1Super-ARMS引物的溶解曲線；圖5為實施例1ARMS引物與Super-ARMS引物的對比(上圖-ARMS引物，下圖-Super-ARMS引物)圖6為實施例1Super-ARMS引物的靈敏度考察結果圖；圖7為實施例2Super-ARMS引物的溶解曲線圖8為實施例2ARMS引物與Super-ARMS引物的對比(上圖-ARMS引物，下圖-Super-ARMS引物)圖9為實施例2中Super-ARMS引物的靈敏度考察圖。圖10為實施例3Super-ARMS引物的溶解曲線圖11為為實施例2ARMS引物與Super-ARMS引物的對比(上圖-ARMS引物，下圖-Super-ARMS引物)圖12為實施例3中Super-ARMS引物的靈敏度考察圖。具體實施方式實施例1：Super-ARMS引物用于EGFR基因T790M突變的檢測為考察Super-ARMS引物對實時PCR體系特異性和靈敏度的影響，故設計1對針對EGFR基因T790M突變的特異引物，擴增片段長度為105bp。PCR模板為細胞系基因組DNA。反應液配方：物料濃度用量(μL)H2O純化水42.345PCR緩沖液10×8MgCl225mM13.6dNTPs25mM0.8特異上游引物F100μM0.03特異下游引物R100μM0.03特異探針100μM0.08Blcok引物100μM0.04內控引物F100μM0.025內控引物R100μM0.025內控探針100μM0.025總體積/65操作步驟：每管試劑按60μL反應液和0.4μL混合酶的比例，從反應液管中取出相應體積的反應液，按比例加入相應體積的混合酶，振蕩混勻15秒，快速離心15秒，以每管65.4μL的量分裝到PCR反應管中，分別加入需要檢測的樣品15μL，然后小心蓋上PCR管蓋，快速離心數(shù)秒。將PCR反應管放置于實時PCR儀器中。實時PCR反應在StratageneMx3000PTM實時PCR儀上進行。第一階段：95℃10分鐘，1個循環(huán)；第二階段：95℃40秒，64℃40秒，72℃30秒，15個循環(huán)；第三階段：93℃40秒，60℃45秒，72℃30秒，28個循環(huán)；其中，上游引物為：5′--spacer-TCACCTCCACCGTGCARCTCATCTT-3′，下游引物為：5′-AGTTGAGCAGGTACTGGGAG-3′，Block：5′-TCACCTCCACCGTGCARCTCATCAC-3′-NH2Spacer為SpacerC18Y代表混合堿基C+TR代表混合堿基A+G特異探針為FAM-5′-AGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3′-BHQ1內控引物F為5′-TCCAGGAGGTGGCTGGTTAT-3′內控引物R為5′-CATATTTCCTCTGATGATCTGCAGGTT-3′內控探針為HEX-5′-CTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGC-3′-BHQ1結果的判定方法為：細胞系和質粒的Ct值越小，表明其擴增效率越高；細胞系或質粒與非特異性擴增之間的ΔCt差值越大，表明特異性越好。對比例普通ARMS上游引物：5′-TCACCTCCACCGTGCARCTCATCTT-3′下游引物：5′-TTGAGCAGGTACTGGGAGCCAAT-3′，其它條件與操作等，都和實施例1相同結果如下：圖1顯示的是依據(jù)本發(fā)明方法設計的Super-ARMS引物用染料進行二級結構分析的融解曲線實驗結果，結果表明，該引物的Tm值在68℃左右。使用對比例中的普通ARMS引物和Super-ARMS引物對質粒和細胞系樣本進行檢測，由圖2可見，Super-ARMS引物擴增效率和特異性均比普通ARMS引物更優(yōu)，使用普通ARMS引物ΔCt值約為3，使用Super-ARMS引物ΔCt值可達到7。由圖3結果來看，Super-ARMS引物對T790M陽性細胞系(H1975)的檢測靈敏度可低至1拷貝/μL。實施例2：Super-ARMS引物用于KRAS基因G12D突變的檢測為考察Super-ARMS引物對實時PCR體系特異性和靈敏度的影響，故設計1對針對KRAS基因G12D突變的特異引物，擴增片段長度為145bp。PCR模板為細胞系基因組DNA。反應液配方：物料濃度用量(μL)H2O純化水38.438PCR緩沖液10×8MgCl225mM17.1dNTPs25mM1內控引物F100μM0.04內控引物R100μM0.04內控探針100μM0.04特異上游引物F100μM0.1特異下游引物R100μM0.1特異探針100μM0.092Block引物100μM0.05總體積65操作步驟：每管試劑按60μL反應液和0.4μL混合酶的比例，從反應液管中取出相應體積的反應液，按比例加入相應體積的混合酶，振蕩混勻15秒，快速離心15秒，以每管65.4μL的量分裝到PCR反應管中，分別加入需要檢測的樣品15μL，然后小心蓋上PCR管蓋，快速離心數(shù)秒。將PCR反應管放置于實時PCR儀器中。實時PCR反應在StratageneMx3000PTM實時PCR儀上進行。第一階段：95℃10分鐘，1個循環(huán)；第二階段：95℃40秒，64℃40秒，72℃30秒，15個循環(huán)；第三階段：93℃40秒，60℃45秒，72℃30秒，30個循環(huán)；上游引物5′--spacer-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCA-3′，下游引物為：5′-TGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATT-3′，Block：5′-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG-3′-NH2特異探針為FAM-5′-AGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA-3′-BHQ1內控引物F為5′-TCTCGGCCTCCCAAGGTGTT-3′內控引物R為5′-TCCACACAGCAGCAAGTGATAGT-3′內控探針為HEX-5′-TAGGTGCCTAGCCCATGGTGCC-3′-BHQ1對比例普通ARMS上游引物：5′-TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCA-3′下游引物：5′-TCCTGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATTTAC-3′，其它條件與操作等，都和實施例2相同結果如下：圖4顯示的是依據(jù)本發(fā)明方法設計的Super-ARMS引物用染料進行二級結構分析的融解曲線實驗結果，結果表明，該引物的Tm值在67℃左右。圖5結果所示，普通ARMS引物和Super-ARMS引物對同樣的樣本進行檢測，Super-ARMS引物擴增效率和特異性均比普通ARMS引物更優(yōu)。由圖6結果來看，Super-ARMS引物對G12D陽性細胞系(LS174T)的檢測靈敏度可低至1拷貝/μL。實施例3：Super-ARMS引物用于NRAS基因Q61K突變的檢測為考察Super-ARMS引物對實時PCR體系特異性和靈敏度的影響，故設計1對針對NRAS基因Q61K突變的特異引物，擴增片段長度為98bp。PCR模板為細胞系基因組DNA。反應液配方：物料濃度用量(μL)H2O純化水23.225PCR緩沖液10×5MgCl225mM11dNTPs25mM0.5內控引物F100μM0.03內控引物R100μM0.03內控探針100μM0.03特異上游引物F100μM0.05特異下游引物R100μM0.05特異探針100μM0.045Block引物100μM0.04總體積40操作步驟：每管試劑按40μL反應液和0.6μL混合酶的比例，從反應液管中取出相應體積的反應液，按比例加入相應體積的混合酶，振蕩混勻15秒，快速離心15秒，以每管40.6μL的量分裝到PCR反應管中，分別加入需要檢測的樣品10μL，然后小心蓋上PCR管蓋，快速離心數(shù)秒。將PCR反應管放置于實時PCR儀器中。實時PCR反應在StratageneMx3000PTM實時PCR儀上進行。第一階段：95℃10分鐘，1個循環(huán)；第二階段：95℃40秒，64℃40秒，72℃30秒，15個循環(huán)；第三階段：93℃40秒，60℃45秒，72℃30秒，30個循環(huán)；上游引物為：5′-AGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT-3′，下游引物5′--spacer-GTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTGT-3′，Block：5′-GTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTGTC-3′-NH2特異探針為FAM-5′-CCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAACAGG-3′-BHQ1內控引物F為5′-TCATTGCACCAGTAACTCCAGC-3′內控引物R為5′-CTGAGTTTTCCAGTCATGGTAAAGG-3′內控探針為HEX-5′-CTGACCTCTTCTTTCCTTGCAGGGCTA-3′-BHQ1對比例上游引物：5′-CCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT-3′，普通ARMS下游引物：5′-GTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTGT-3′其它條件與操作等，都和實施例3相同結果如下：圖7顯示的是依據(jù)本發(fā)明方法設計的Super-ARMS引物用染料進行二級結構分析的融解曲線實驗結果，結果表明，該引物的Tm值在66℃左右。圖8結果所示，普通ARMS引物和Super-ARMS引物對同樣的樣本進行檢測，Super-ARMS引物擴增效率和特異性均比普通ARMS引物更優(yōu)。由圖9結果來看，Super-ARMS引物對Q61K陽性細胞系(NCI-H1299)的檢測靈敏度可低至1拷貝/μL。<110>廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種改進的ARMS引物結構(SUper-ARMS)及其使用方法<160>27<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>1AAGATGAGYTGCACTCACCTCCACCGTGCARCTCATCTT39<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2AGTTGAGCAGGTACTGGGAG20<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3TCACCTCCACCGTGCARCTCATCAC25<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4AGCTCATGCCCTTCGGCTGCC21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5TCCAGGAGGTGGCTGGTTAT20<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6CATATTTCCTCTGATGATCTGCAGGTT27<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7CTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGC25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>8TCACCTCCACCGTGCARCTCATCTT25<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9TTGAGCAGGTACTGGGAGCCAAT23<210>10<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>10TGAGCTCCAACTACTGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCA48<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>11TGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATT32<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>12TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG34<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>13AGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA29<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14TCTCGGCCTCCCAAGGTGTT20<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>15TCCACACAGCAGCAAGTGATAGT23<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>16TAGGTGCCTAGCCCATGGTGCC22<210>17<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>17TGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCA34<210>18<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>18TCCTGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATTTAC38<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>19AGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT25<210>20<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>20ACAGAAGAGTACAGTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTGT43<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>21GTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTGTC29<210>22<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>22CCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAACAGG31<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23TCATTGCACCAGTAACTCCAGC22<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>24CTGAGTTTTCCAGTCATGGTAAAGG25<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>25CTGACCTCTTCTTTCCTTGCAGGGCTA27<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>26CCAGGATTCTTACAGAAAACAAGTGGT27<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>27GTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTGT27當前第1頁1 2 3