本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及分子標(biāo)志物STAC2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔頜面外科較常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率、致死率均位于口腔頜面部的惡性腫瘤中位居首位。因其惡性程度較高，且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后較差，并且術(shù)后也經(jīng)常會(huì)繼發(fā)頜面部的畸形，在臨床上對(duì)于醫(yī)生制定治療方案造成很大難度，更重要的是對(duì)患者的生存質(zhì)量造成極大的影響。在我國(guó)，鱗癌多發(fā)生于40-60歲的成人，男性多于女性部位以舌、頰、牙齦、腭、上頜竇為常見(jiàn)。鱗癌常向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

腫瘤是一種分子水平的疾病，從基因蛋白水平進(jìn)行腫瘤的研究是最終途徑。分子靶向治療始于20世紀(jì)末，它指在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)已明確的致癌位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物特異地與致癌位點(diǎn)相結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞死亡，而不損傷正常的組織細(xì)胞。分子靶向治療調(diào)控腫瘤相關(guān)基因、干預(yù)腫瘤異常的信號(hào)通路或阻斷其能量通路，具有高特異性、低毒性和高治療指數(shù)等特點(diǎn)。尋找可干預(yù)的分子靶點(diǎn)其實(shí)就是尋找腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在生物化學(xué)、分子間的差異，包括數(shù)量和活性的差異。這些靶點(diǎn)包括生長(zhǎng)因子及其受體、癌基因、抑癌基因、腫瘤血管生成因子、端粒及端粒酶、蛋白激酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙酸化酶、DNA引物酶、泛素化途徑調(diào)控因子等。

目前口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床上也并沒(méi)有用于口腔鱗狀細(xì)胞癌診治的有效的分子標(biāo)志物，尋找新的分子標(biāo)志物對(duì)于口腔鱗狀細(xì)胞癌的機(jī)制研究以及臨床應(yīng)用都具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種口腔鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物，靈敏和特異性的實(shí)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的診斷和治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了分子標(biāo)志物在制備診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述分子標(biāo)志物為STAC2。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品通過(guò)測(cè)定樣本中STAC2基因或其同源物的變化進(jìn)行診斷。

其中，STAC2基因或其同源物的變化可以通過(guò)芯片、印跡法、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、FISH法、CGH法或陣列CGH法、亞硫酸氫鹽測(cè)序法、COBRA法進(jìn)行測(cè)定。印跡法包括Northern、Southern、Western印跡法。Southern印跡法是將從樣本得到的基因組DNA分離并固定，通過(guò)檢測(cè)DNA與STAC2基因的雜交來(lái)測(cè)定樣本中的STAC2基因；Northern印跡法是一種將由樣本中獲得的mRNA分離、固定，通過(guò)檢測(cè)mRNA與STAC2基因的雜交來(lái)檢測(cè)該基因的mRNA；Western印跡法是一種將樣本中的蛋白分離、固定，通過(guò)檢測(cè)抗體與STAC2蛋白的免疫反應(yīng)來(lái)分析基因的表達(dá)程度。

本發(fā)明提供了一種診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過(guò)檢測(cè)樣本中STAC2基因的表達(dá)水平來(lái)診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或制劑。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)STAC2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)STAC2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的STAC2蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)STAC2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括STAC2蛋白的特異性抗體。

本發(fā)明提供了STAC2基因在制備治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括STAC2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。所述抑制劑包括抑制STAC2基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制STAC2基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制STAC2基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。

進(jìn)一步，所述抑制劑包括針對(duì)STAC2基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸和/或針對(duì)STAC2蛋白的抗體、配體。優(yōu)選的，所述抑制劑為siRNA。

本發(fā)明還提供了一種治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物組合物，所述藥物組合物包含上面所述的STAC2的抑制劑。

本發(fā)明提供了一種組合藥物，所述組合藥物包括上述的藥物組合物、和含抗腫瘤劑的藥物組合物。

進(jìn)一步，抗腫瘤劑的藥物組合物包括但不限于免疫治療劑如西妥昔單克隆抗體，化學(xué)治療劑或化學(xué)放射性治療劑如卡波鉑或者是一種相關(guān)類(lèi)別的鉑類(lèi)藥物、紫杉烷或者是一種類(lèi)別的紫衫烷，或者是兩者。

本發(fā)明還提供了一種抑制細(xì)胞增殖的方法，所述方法是將針對(duì)STAC2基因的siRNA、shRNA、反義寡核苷酸或功能缺失型基因在體外導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物—STAC2，通過(guò)檢測(cè)受試者STAC2的變化，來(lái)實(shí)現(xiàn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷。

本發(fā)明提供了治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子靶標(biāo)，通過(guò)靶向于分子標(biāo)志物來(lái)治療疾病具有敏感性和特異性。

本發(fā)明對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用QPCR檢測(cè)STAC2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況；

圖2顯示利用QPCR檢測(cè)STAC2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；

圖3顯示利用QPCR檢測(cè)siRNA對(duì)STAC2基因表達(dá)的影響；

圖4顯示MTT法檢測(cè)STAC2對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖活性的影響；

圖5顯示利用transwell小室檢測(cè)STAC2基因?qū)谇击[狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了STAC2與口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并驗(yàn)證了STAC2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)。STAC2可作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，也可以和其他的基因標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物”是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正常或健康細(xì)胞或組織的表達(dá)水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的編碼序列或氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。

本文所述的生物標(biāo)志物包括基因和蛋白。此類(lèi)生物標(biāo)志物包括含有編碼生物標(biāo)志物的核酸序列或此序列的互補(bǔ)序列的完整或部分序列的DNA。生物標(biāo)志物核酸還包括含有所關(guān)注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物標(biāo)志物蛋白是由本發(fā)明的DNA生物標(biāo)志物編碼的或?qū)?yīng)于本發(fā)明的DNA生物標(biāo)志物的蛋白。生物標(biāo)志物蛋白包含任何生物標(biāo)志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物標(biāo)志物基因和蛋白的片段和變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

所謂“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而編碼的蛋白的一部分。為生物標(biāo)志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400個(gè)連續(xù)的核苷酸，或最多存在于本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)生物標(biāo)志物多核苷酸中的核苷酸個(gè)數(shù)。生物標(biāo)志物多核苷酸的片段將通常編碼至少15、25、30、50、100、150、200或250個(gè)連續(xù)氨基酸，或存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)生物標(biāo)志物蛋白中的氨基酸的總數(shù)。

“變體”旨在表示基本上相似的序列。一般來(lái)講，本發(fā)明的特定生物標(biāo)志物的變體將具有通過(guò)序列比對(duì)程序測(cè)定的與所述生物標(biāo)志物至少約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測(cè)定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄或翻譯(即蛋白)水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

在一些實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行具體DNA和RNA測(cè)量的多種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一些方法涉及電泳分離(例如，用于檢測(cè)DNA的Southern印跡和用于檢測(cè)RNA的Northern印跡)，但是也可以在不利用電泳分離的情況下進(jìn)行DNA和RNA的測(cè)量(例如，通過(guò)斑點(diǎn)印跡)?；蚪MDNA(例如，來(lái)自人)的Southern印跡可用于篩選限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，以檢測(cè)影響本發(fā)明多肽的遺傳病癥的存在?？梢詸z測(cè)所有形式的RNA，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖體RNA(rRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，“探針”通常指能通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱(chēng)為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

作為探針，可以使用熒光標(biāo)記、放射標(biāo)記、生物素標(biāo)記等對(duì)癌檢測(cè)用多核苷酸進(jìn)行了標(biāo)記的標(biāo)記探針。多核苷酸的標(biāo)記方法本身是公知的?？赏ㄟ^(guò)如下方法檢查試樣中是否存在受試核酸：固定受試核酸或者其擴(kuò)增物，與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，洗滌，以及然后測(cè)定與固相結(jié)合的標(biāo)記。備選地，還可固定癌檢測(cè)用多核苷酸，使受試核酸與其雜交，然后應(yīng)用標(biāo)記探針等檢測(cè)結(jié)合于固相上的受試核酸。在這種情況下，結(jié)合于固相上的癌檢測(cè)用多核苷酸也稱(chēng)為探針。使用多核苷酸探針測(cè)定受試核酸的方法在本領(lǐng)域也是公知的?？梢匀缦逻M(jìn)行該方法：在緩沖液中使多核苷酸探針與受試核酸在Tm或者其附近(優(yōu)選在±4℃以?xún)?nèi))接觸用于雜交，洗滌，然后測(cè)定雜交的標(biāo)記探針或者與固相探針結(jié)合的模板核酸。

在作為探針使用的多核苷酸的大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸、更優(yōu)選為20個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及編碼區(qū)域的全長(zhǎng)或更少。作為引物使用時(shí)，該多核苷酸大小優(yōu)選為18個(gè)或更多個(gè)核苷酸，以及50個(gè)或更少核苷酸。

術(shù)語(yǔ)“芯片”也稱(chēng)為“陣列”，指包含連接的核酸或肽探針的固體支持物。陣列通常包含按照不同的已知位置連接至基底表面的多種不同的核酸或肽探針。這些陣列，也稱(chēng)為“微陣列”，通常可以利用機(jī)械合成方法或光引導(dǎo)合成方法來(lái)產(chǎn)生這些陣列，所述光引導(dǎo)合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的組合。陣列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝膠、聚合物表面、諸如光纖的纖維、玻璃或任何其它合適的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式來(lái)包裝陣列，從而允許進(jìn)行全功能裝置的診斷或其它方式的操縱。

本發(fā)明中使用的針對(duì)上述STAC2蛋白質(zhì)的抗體只要能夠發(fā)揮抗腫瘤活性就可以是任何種類(lèi)的抗體，包含例如，單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、例如合成抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、三特異性抗體等)、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scFv)等人抗體，它們的抗體片段、例如Fab、F(ab’)²、Fv等。這些抗體及其片段還可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。在本發(fā)明中，期望是能夠與STAC2蛋白質(zhì)特異性地結(jié)合的抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，但只要能夠穩(wěn)定地生產(chǎn)均質(zhì)的抗體，則也可以是多克隆抗體。另外，在受試者是人的情況下，為了避免或抑制排斥反應(yīng)，優(yōu)選為人抗體或人源化抗體。

制作了嵌合抗體或人源化抗體之后，可以將可變區(qū)(例如，F(xiàn)R)和/或恒定區(qū)中的氨基酸用其他氨基酸替換等。氨基酸的替換例如是小于15個(gè)、小于10個(gè)、8個(gè)以下、7個(gè)以下、6個(gè)以下、5個(gè)以下、4個(gè)以下、3個(gè)以下、或2個(gè)以下的氨基酸、優(yōu)選1～5個(gè)氨基酸、更優(yōu)選1或2個(gè)氨基酸的替換，替換抗體應(yīng)與未替換抗體在功能上等同。

STAC2蛋白質(zhì)的片段具有從作為抗體所識(shí)別的最小單位的表位(抗原決定簇)的氨基酸長(zhǎng)到小于該蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)的長(zhǎng)度。表位是指在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人中具有抗原性或免疫原性的肽片段，其最小單位由約7～12個(gè)氨基酸、例如8～11個(gè)氨基酸組成。

在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增STAC2基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增STAC2基因的引物。在一些實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷管鱗癌的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增STAC2基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明中的基因芯片或基因檢測(cè)試劑盒還可用于檢測(cè)包括STAC2基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)包括STAC2蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。將口腔鱗狀細(xì)胞癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明術(shù)語(yǔ)siRNA是一種小RNA分子(21-25核苷酸)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中對(duì)雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成，它是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。siRNA的制備可采用多種方法，比如：化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長(zhǎng)鏈dsRNA、載體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。

作為該siRNA分子的一種表達(dá)形式，可將其制備成DNA表達(dá)框形式，比如：U6啟動(dòng)子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，可將siRNA分子、表達(dá)siRNA分子的DNA表達(dá)框、或者包含siRNA分子表達(dá)框的質(zhì)粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如腫瘤組織。

在一些實(shí)施方案中，siRNA分子采用化學(xué)法合成的。在具體的實(shí)施方案中，合成的siRNA分子的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本發(fā)明中的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類(lèi)載體包括(但并不限于)：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本發(fā)明的藥物組合物可以使用不同的添加劑進(jìn)行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、pH控制劑及表面活性劑。本發(fā)明的藥物還可包括藥學(xué)上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過(guò)程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，可以配制成軟膏、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑等，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)乇３諷TAC2基因或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑分子的活性。比如，對(duì)于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。

本發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。

本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。表達(dá)載體向宿主細(xì)胞中的導(dǎo)入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜透過(guò)性肽的結(jié)合等周知的方法。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“治療”是指改善與疾病或病癥例如實(shí)體癌相關(guān)的癥狀，包括阻止或延遲疾病癥狀的發(fā)作和/或減少疾病或病癥的嚴(yán)重度或頻率。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)胞增殖”是指殺死細(xì)胞或永久性地或臨時(shí)性地阻止或減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果在施用基因產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑后，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目保持恒定或減少，那么可推斷此類(lèi)細(xì)胞的增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加但腫瘤生長(zhǎng)速率減小也可推斷癌細(xì)胞的增殖被抑制。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“樣本”包括細(xì)胞、組織、臟器、腦脊液、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。在一些實(shí)施方案中，所述樣本為組織、血液。

在本發(fā)明中，生物標(biāo)志物的“高表達(dá)”或“過(guò)表達(dá)”或“表達(dá)上調(diào)”是指生物標(biāo)志物的表達(dá)高出10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1 篩選與口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例周?chē)Ｕ衬そM織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)，所有患者術(shù)前未接受任何形式的治療。手術(shù)切下的樣本于液氮中凍存，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。

2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進(jìn)行操作)

取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)提取分離RNA。具體如下：

1)加入Trizol，室溫放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10min；

3)12000rpm離心15min，將上層水相移到另一新的離心管中(注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì))，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10min；

4)12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗滌沉淀(4℃保存)，洗滌沉淀物，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心5min；

5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-70℃冰箱。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)用Cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達(dá)譜芯片,每張芯片包括45015個(gè)寡核苷酸，其中有43376個(gè)人基因探針和1639個(gè)實(shí)驗(yàn)控制探針。按芯片使用說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，溫度在65℃，經(jīng)17h 10r/min滾動(dòng)雜交，37℃洗片。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與正常粘膜組織相比，STAC2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量顯著上調(diào)。

實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證STAC2基因的差異表達(dá)

1、對(duì)STAC2基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇正常粘膜組織和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織各80例。

2、RNA提取步驟如實(shí)施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

1)反應(yīng)體系：

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件進(jìn)行。

42℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶鏈反應(yīng)

1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中STAC2基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

STAC2基因：

正向引物為5’-ATCGTAGGAAACTCCAAACAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-ATCTCCTCAGAGCACCAG-3’(SEQ ID NO.4)。

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)

2)按照表1配制25μl PCR反應(yīng)體系：

表2 PCR反應(yīng)體系

3)PCR反應(yīng)條件：94℃4min，(94℃20s，60℃30s、72℃30s)×30個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量，每個(gè)樣進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算口腔鱗狀細(xì)胞癌組織與正常粘膜組織熒光定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與周?chē)Ｕ衬そM織相比，STAC2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3 STAC2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113、HN13，正常粘膜上皮細(xì)胞系HIOEC購(gòu)自于上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院。HIOEC的培養(yǎng)基為K-SFM；Tca8113、HN13的培養(yǎng)基為DMEM；以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、細(xì)胞總RNA的提取

1)當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)終止培養(yǎng)，0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞于1.5m1EP管中，每管中加入lm1Trizol緩慢搖動(dòng)破碎細(xì)胞，冰上放置10min。

2)去蛋白，去DNA：每個(gè)1.5m1EP管加入0.2ml三氯甲烷，搖晃15s，室溫放置10min。4℃，12000rpm離心15min。

剩余操作步驟同組織中RNA提取過(guò)程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常粘膜上皮細(xì)胞相比，STAC2基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113、HN13中表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例4 STAC2基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、siRNA設(shè)計(jì)

針對(duì)STAC2基因的siRNA序列：

陰性對(duì)照siRNA序列(siRNA-NC)：

正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)

反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)

siRNA1-STAC2：

正義鏈為5’-AAAUUAGCUGGGAAGAAGCCA-3’(SEQ ID NO.9)

反義鏈為5’-GCUUCUUCCCAGCUAAUUUUG-3’(SEQ ID NO.10)

siRNA2-STAC2：

正義鏈為5’-UCUACUUGAACAGAUAGUCUC-3’(SEQ ID NO.11)

反義鏈為5’-GACUAUCUGUUCAAGUAGAAA-3’(SEQ ID NO.12)

將細(xì)胞按4×10⁴/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h，在無(wú)雙抗、含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于Invitrogen公司)的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染。

將實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組(Tca8113)、陰性對(duì)照組(siRNA-NC)和實(shí)驗(yàn)組(siRNA1-STAC2、siRNA2-STAC2)，其中陰性對(duì)照組siRNA與STAC2基因的序列無(wú)同源性，濃度為20nM/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3、QPCR檢測(cè)STAC2基因的轉(zhuǎn)錄水平

3.1細(xì)胞總RNA的提取

具體步驟同實(shí)施例3。

3.2逆轉(zhuǎn)錄 步驟同實(shí)施例2。

3.3 QPCR擴(kuò)增 步驟同實(shí)施例2。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，干擾STAC2基因表達(dá)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，相比TCA8113、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA2-STAC2組，siRNA1-STAC2組能夠顯著降低STAC2基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)施例5 ELISA檢測(cè)Tca8113細(xì)胞中STAC2的蛋白表達(dá)

應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法測(cè)定Tca8113細(xì)胞上清中STAC2蛋白水平。RNA干擾后第六天，分別收集三組Tca8113細(xì)胞的上清液，按照ELISA試劑盒操作流程定量檢測(cè)腫瘤細(xì)胞上清液中STAC2的濃度。

1、配置濃度為70000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，10倍稀釋后，再進(jìn)行2倍倍比稀釋?zhuān)灿?個(gè)稀釋度。

2、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?0μl，余孔分別加不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品各50μl。輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)2h。

3、棄去液體，晾干。每孔加200μl VEGF-C結(jié)合物。37℃，120min后，棄去孔內(nèi)液體，晾干，PBS洗板3次。

4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光顯色30min。

5、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。

6、用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。所有標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的OD值均需減去零孔的OD值以得到校正值。

7、計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。

8、結(jié)果如下表3所示，siRNA沉默Tca8113細(xì)胞的STAC2基因，STAC2的蛋白含量也相應(yīng)降低，說(shuō)明沉默STAC2基因可以抑制STAC2基因的表達(dá)。

表3 ELISA檢測(cè)不同組別細(xì)胞中的STAC2蛋白的表達(dá)

實(shí)施例6 MTT法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞增殖活性

應(yīng)用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)法檢測(cè)STAC2基因沉默后對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖活性的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng) 將Tca8113細(xì)胞按1×10³/孔接種于96孔板，每孔100μ1，37℃，5％CO₂孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 步驟同實(shí)施例3。

3、MTT檢測(cè)

1)分別于轉(zhuǎn)染1～7天時(shí)，棄掉各孔培養(yǎng)基，加入MTT(5mg/ml)20μl。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h。

2)吸去混合液，每孔加入DMSO 200μl，震蕩10min使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫儀上測(cè)490nm處的光吸收值，記錄結(jié)果。

4、以時(shí)間為橫軸，光吸收值(OD)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染siRNA1-STAC2組的細(xì)胞增殖顯著降低。

實(shí)施例7 Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)

RNA干擾后第六天收集不同組別的Tca8113細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)液中，使細(xì)胞終濃度為2×10⁶/ml，吸取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室中。應(yīng)用Transwell小室方法觀察STAC2基因沉默對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響。

1、將Matrigel(4μg/μl)放入4℃融化，準(zhǔn)備冰盒(冰浴環(huán)境)。Matrigel用DMEM稀釋8倍后使用。在Transwell小室濾膜(8μm孔徑)的外表面涂8μg人纖粘連蛋白，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。

2、在6孔Transwell小室濾膜的內(nèi)表面鋪以100μ1/孔的Matrigel膠，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育1h，形成一個(gè)基質(zhì)屏障層備用。

3、在6孔板每孔內(nèi)加入含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液2.5m1。

4、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)液中，終濃度為2×10⁶/ml。

5、將細(xì)胞懸液加入Transwell小室中，每孔100μ1，將小室浸于6孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂孵箱內(nèi)孵育24h。

6、將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1min。

7、HE染色：蘇木精染色3min，水洗；伊紅染色10～30s，水洗。并用棉簽擦掉未穿過(guò)膜的細(xì)胞。

8、顯微鏡下觀察、照相并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)不同視野的透過(guò)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。每組平行設(shè)3個(gè)濾膜。

9、數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，Tca8113、siRNA1-STAC2、siRNA-NC組細(xì)胞在transwell小室中培養(yǎng)24h后，siRNA1-STAC2組聚碳酸酯膜下室面的細(xì)胞數(shù)顯著減少。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> 分子標(biāo)志物STAC2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgaccgaga tgagcgagaa ggagaacgaa ccggatgacg cggccaccca cagcccccca 60

gggaccgtct ccgccctcca ggaaaccaag ctccagcgat tcaagcgctc cctctccctc 120

aagaccatcc tccgaagtaa gagcttggag aacttcttcc ttcgctcggg ctctgagctc 180

aagtgcccca ccgaggtgct gctgacgccc ccaaccccac tgccccctcc ctccccacca 240

cccacagcct cggacagggg cctggctacc ccatccccct ccccatgccc agtcccacgc 300

cccctggcag cgctcaaacc agtgaggctg cacagcttcc aggaacatgt cttcaagcga 360

gctagccctt gtgagctgtg ccaccagctc atcgtaggaa actccaaaca gggcttgcga 420

tgtaagatgt gcaaagtcag cgtccacctc tggtgctctg aggagatctc ccaccagcaa 480

tgcccaggca agacgtccac ctccttccgc cgcaacttca gttcccctct cctggtgcat 540

gagccgccac cagtctgtgc cacaagcaaa gagtccccac ccactgggga cagtgggaag 600

gtggaccctg tctacgagac cctgcgctat ggcacctccc tggcactgat gaaccgctcc 660

agtttcagca gcacctctga gtccccgaca aggagcctga gtgagcggga tgagctgacc 720

gaggatgggg aaggcagcat ccgcagctct gaggaggggc ctggtgacag tgcatctcca 780

gtattcacag ccccagcaga gagtgaaggg ccaggaccag aggagaagag tcctggacag 840

cagctcccca aagccaccct gcggaaggat gtggggccca tgtactccta cgttgcactc 900

tacaagtttc tgccccagga gaacaatgat ctggctctgc agcctggaga tcggatcatg 960

ctggtggatg actctaacga ggactggtgg aagggcaaga tcggcgaccg ggttggcttc 1020

ttcccagcta attttgtgca acgggtgagg ccaggcgaga atgtttggcg ctgctgccaa 1080

cccttctccg ggaacaagga acagggttac atgagcctca aggagaacca gatctgcgtg 1140

ggcgtgggca gaagcaagga tgctgacggc ttcatccgcg tcagcagtgg caagaagcgg 1200

ggcctggtgc cagtcgacgc cctgactgag atctga 1236

<210> 2

<211> 411

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Thr Glu Met Ser Glu Lys Glu Asn Glu Pro Asp Asp Ala Ala Thr

1 5 10 15

His Ser Pro Pro Gly Thr Val Ser Ala Leu Gln Glu Thr Lys Leu Gln

20 25 30

Arg Phe Lys Arg Ser Leu Ser Leu Lys Thr Ile Leu Arg Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Glu Asn Phe Phe Leu Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Cys Pro Thr

50 55 60

Glu Val Leu Leu Thr Pro Pro Thr Pro Leu Pro Pro Pro Ser Pro Pro

65 70 75 80

Pro Thr Ala Ser Asp Arg Gly Leu Ala Thr Pro Ser Pro Ser Pro Cys

85 90 95

Pro Val Pro Arg Pro Leu Ala Ala Leu Lys Pro Val Arg Leu His Ser

100 105 110

Phe Gln Glu His Val Phe Lys Arg Ala Ser Pro Cys Glu Leu Cys His

115 120 125

Gln Leu Ile Val Gly Asn Ser Lys Gln Gly Leu Arg Cys Lys Met Cys

130 135 140

Lys Val Ser Val His Leu Trp Cys Ser Glu Glu Ile Ser His Gln Gln

145 150 155 160

Cys Pro Gly Lys Thr Ser Thr Ser Phe Arg Arg Asn Phe Ser Ser Pro

165 170 175

Leu Leu Val His Glu Pro Pro Pro Val Cys Ala Thr Ser Lys Glu Ser

180 185 190

Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Lys Val Asp Pro Val Tyr Glu Thr Leu

195 200 205

Arg Tyr Gly Thr Ser Leu Ala Leu Met Asn Arg Ser Ser Phe Ser Ser

210 215 220

Thr Ser Glu Ser Pro Thr Arg Ser Leu Ser Glu Arg Asp Glu Leu Thr

225 230 235 240

Glu Asp Gly Glu Gly Ser Ile Arg Ser Ser Glu Glu Gly Pro Gly Asp

245 250 255

Ser Ala Ser Pro Val Phe Thr Ala Pro Ala Glu Ser Glu Gly Pro Gly

260 265 270

Pro Glu Glu Lys Ser Pro Gly Gln Gln Leu Pro Lys Ala Thr Leu Arg

275 280 285

Lys Asp Val Gly Pro Met Tyr Ser Tyr Val Ala Leu Tyr Lys Phe Leu

290 295 300

Pro Gln Glu Asn Asn Asp Leu Ala Leu Gln Pro Gly Asp Arg Ile Met

305 310 315 320

Leu Val Asp Asp Ser Asn Glu Asp Trp Trp Lys Gly Lys Ile Gly Asp

325 330 335

Arg Val Gly Phe Phe Pro Ala Asn Phe Val Gln Arg Val Arg Pro Gly

340 345 350

Glu Asn Val Trp Arg Cys Cys Gln Pro Phe Ser Gly Asn Lys Glu Gln

355 360 365

Gly Tyr Met Ser Leu Lys Glu Asn Gln Ile Cys Val Gly Val Gly Arg

370 375 380

Ser Lys Asp Ala Asp Gly Phe Ile Arg Val Ser Ser Gly Lys Lys Arg

385 390 395 400

Gly Leu Val Pro Val Asp Ala Leu Thr Glu Ile

405 410

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atcgtaggaa actccaaaca g 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atctcctcag agcaccag 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaauuagcug ggaagaagcc a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcuucuuccc agcuaauuuu g 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

ucuacuugaa cagauagucu c 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

ucuacuugaa cagauagucu c 21