本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及一種寡核苷酸染液及其應(yīng)用與用法。

背景技術(shù)：

寡核苷酸是可人工合成的短DNA或RNA序列。寡核苷酸作為探針廣泛應(yīng)用于染色體鑒定。由于單鏈寡核苷酸(single-strand oligonucleotide，SSON)探針具有較高的敏感性和分辨率，已在小麥、黑麥等多個(gè)作物以及人類的染色體鑒定中得到應(yīng)用(Fu et al.2015，Du et al.2016，Beliveau et al.2012)。SSON探針的特點(diǎn)是易于合成和標(biāo)記檢測(cè)信號(hào)，可避免常規(guī)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)過程中的變性步驟。該方法通常稱為非變性熒光原位雜交(non-denaturing FISH，ND-FISH)。隨著基因組測(cè)序的發(fā)展，SSON探針的開發(fā)已由基于端粒重復(fù)序列和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)發(fā)展到基于基因組序列和串聯(lián)重復(fù)序列(Han et al.2015，Tang et al.2014)。由于SSON探針的雜交信號(hào)與基于常規(guī)質(zhì)?？寺￠_發(fā)的探針的雜交信號(hào)一樣穩(wěn)定，因此，SSON可以取代質(zhì)?？寺∮糜陂_發(fā)FISH的簡(jiǎn)化步驟。

所以開發(fā)一種能夠全面鑒定物種染色體的SSON探針組具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有單一探針組成的染液不能全面鑒定物種染色體的問題，提供能夠全面鑒定物種染色體的寡核苷酸染液及其用法與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種寡核苷酸染液，所述染液包含四個(gè)寡核苷酸探針：

第一個(gè)寡核苷酸探針為YMPNS-CentC69-1，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：

5′-CCCAATCCACTACTTTAGGTCCAAAACTCATGTTTGGGGTGGTTTCGCGCAATTTCGTT-3′；

第二個(gè)寡核苷酸探針為MKnob-2，5′端由FAM修飾，其核苷酸序列為：

5′-GAAGGCTAACACCTACGGATTTTTGACCAAGAAATGGTCTCCACCAGAAATCCAAAAAT-3′；

第三個(gè)寡核苷酸探針為YMPNS-MR68-3，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：

5′-CTCTCGTGCGAATACAATGCCCTCAATATCATAGAAACACTATTCCTTTAGTGTGAATA-3′；

第四個(gè)寡核苷酸探針為(ACT)10，5′端由TAMRA修飾，其核苷酸序列為：

5′-ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT-3′。

優(yōu)選的，所述寡核苷酸染液包括YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)₁₀和2×SSC，其中YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)₁₀四種探針組成探針混合液，所述染液按體積比計(jì)，探針混合液︰2×SSC＝22︰25；所述探針混合液由體積比YMPNS-CentC69-1:MKnob-2:YMPNS-MR68-3:(ACT)₁₀＝20:4:15:5混合所得，其中YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3、(ACT)₁₀混合前均為1.0μg/μl的水溶液。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明所述的寡核苷酸染液可用于玉米及其親緣物種中染色體快速鑒定；

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種寡核苷酸染液快速鑒定玉米染色體的用法：將寡核苷酸染液加8μl在每張不經(jīng)變性的染色體制片上，并加入2.5μl 50％w/v硫酸葡聚糖水溶液于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行雜交2小時(shí)，然后在42℃2×SSC中洗5分鐘，用DAPI套染后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明所述的寡核苷酸染液可用于制備商品化染液，優(yōu)選為試劑盒及其由試劑盒衍生的其它商品。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明成本低、檢測(cè)時(shí)間快，可用于大規(guī)模玉米染色體變異分析。

本發(fā)明中的探針名稱YMPNS-CentC69-1、MKnob-2、YMPNS-MR68-3和(ACT)₁₀均為本發(fā)明自己定義的名稱。

附圖說明：

圖1為16個(gè)玉米材料的多重SSON探針核型分析。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑耗材，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的，另外實(shí)驗(yàn)過程中如無特殊說明，所述溶液均為水溶液。

實(shí)施例

1、植物材料及染色體準(zhǔn)備

共有16個(gè)玉米材料用于染色體分析，包括3個(gè)自交系及對(duì)應(yīng)的2個(gè)雜交種，以及其它11個(gè)中國(guó)主栽雜交種(表1)。玉米種子浸在水中28℃培養(yǎng)過夜直至根尖長(zhǎng)度達(dá)到2cm。切取根尖放入2ml離心管，用0.29g/L8-羥基喹啉溶液處理3～4h。然后使用體積比為3:1的乙醇冰醋酸溶液固定2-3天。進(jìn)行染色體準(zhǔn)備時(shí)，切取0.3-0.5mm的根尖組織加入45％(v/v)的冰醋酸溶液進(jìn)行滴片，-70℃冷凍過夜。含有有絲分裂染色體的載玻片經(jīng)100％乙醇脫水后用于FISH或ND-FISH分析。

表1所用材料

2、單鏈寡核苷酸(SSON)探針開發(fā)及標(biāo)記

利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)及質(zhì)?？寺〉拇?lián)重復(fù)序列開發(fā)SSON探針。SSR包括(A)₃₅，(GA)₁₅，(AT)₁₅，(GC)₁₅，(AC)₁₅，(GCC)₁₀，(ACG)₁₀，(CAG)₁₀，(ATT)₁₀，(AGG)₁₀，(CAC)₁₀，(CAT)₁₀，(ACT)₅，(ACT)₁₀，(ACT)₁₉，(GAA)₁₀以及(AAC)₁₀(Cuadrado and Jouve 2010)。串聯(lián)重復(fù)序列包括180bp Knob序列，第六染色體特異序列MR68，Knob關(guān)聯(lián)成簇重復(fù)TR1-357，著絲粒重復(fù)CentC69以及Knob關(guān)聯(lián)串聯(lián)重復(fù)克隆K10-72(Peacock et al.1981；Chen et al.2000，Hsu et al.2003，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)http://preview.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)(表2)?；赟SR及180bp Knob序列合成的SSON探針在其5’末端由TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)或FAM(6-羧基熒光素)直接修飾，其它基于質(zhì)?？寺￠_發(fā)的SSON探針由生物素或地高辛標(biāo)記。

表2具有雜交信號(hào)的SSON探針

3、非變性熒光原位雜交

每個(gè)不經(jīng)變性的染色體載玻片含有12μl的雜交液，由5.0μl 20×SSC緩沖液，2.5μl50％(w/v)硫酸葡聚糖以及5～3000ng SSON(根據(jù)每個(gè)SSON探針調(diào)節(jié))，上覆20×20mm蓋玻片?；旌虾玫娜疽涸?7℃培養(yǎng)箱雜交2小時(shí)，然后在42℃2×SSC中洗5分鐘，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)套染后在奧林巴斯BX51熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，染色體無重疊，雜交信號(hào)清晰的圖片用于后續(xù)分析。每個(gè)載玻片觀察5-20個(gè)細(xì)胞，每個(gè)玉米材料至少檢測(cè)4個(gè)重復(fù)。

4、非變性熒光原位雜交分析

非變性熒光原位雜交結(jié)果顯示：基于SSR開發(fā)的SSON探針中，(ACT)₁₀在B73的3個(gè)染色體(1、2和4)及Mo17的四個(gè)染色體(1、2、4和5)上獲得了清晰的雜交信號(hào)。與(ACT)₅開發(fā)的探針相比，(ACT)₁₀的雜交信號(hào)更穩(wěn)定、有效；基于180bp Knob重復(fù)序列開發(fā)的三個(gè)SSON探針在相同條件下產(chǎn)生相似的信號(hào)，但差異類型不同。Knob-2探針在B73第5、7、8和9染色體信號(hào)較強(qiáng)，在第1和6染色體信號(hào)較弱。Mo17中，Knob-2探針在第8染色體獲得清晰信號(hào)，但在第3、4、6和9染色體上信號(hào)較弱；基于著絲粒重復(fù)序列CentC69(GenBank：AY530284.1)開發(fā)的SSON探針中，只有CentC69-1探針在B73及Mo17中能夠檢測(cè)到信號(hào)。在B73中，CentC69-1在第1、6、7和8染色體著絲粒區(qū)域信號(hào)較強(qiáng)，在第3、5、9和10染色體信號(hào)較弱，在第4和6染色體上未見雜交信號(hào)。在Mo17中，CentC69-1可在所有染色體的著絲粒區(qū)域產(chǎn)生雜交信號(hào)，其中，第1、3、7、8和9染色體上信號(hào)較強(qiáng)，其它染色體信號(hào)較弱；基于串聯(lián)重復(fù)序列MR68，TR1-357及K10-72開發(fā)的三個(gè)SSON探針MR68-3，TR1-357-2及K10-72-1在Mo17第6染色體相同區(qū)域均可產(chǎn)生清晰的雜交信號(hào)。在B73中，三個(gè)探針只在第4和6染色體上產(chǎn)生信號(hào)。

5、多重SSON探針組開發(fā)

SSON探針CentC69-1，MR68-3，K10-72-1，TR1-357-2，Knob-2和(ACT)₁₀用于開發(fā)多重SSON探針組。經(jīng)過篩選，(ACT)₁₀，Knob-2，CentC69-1及MR68-3組成的探針組可產(chǎn)生清晰的雜交信號(hào)，能夠只通過一輪非變性熒光原位雜交即可區(qū)分16個(gè)玉米材料的所有染色體(圖1)。其中，(ACT)₁₀在第1、2和4染色體上產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)，足以區(qū)分所有玉米材料的這三個(gè)染色體。此外，(ACT)₁₀在第2染色體(TZ201，ZZ8，WK702，WK06-9，XY335，DF30，SR16和SR568)和第3染色體的著絲粒(XY9)、第六染色體的近著絲粒區(qū)域(ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，XY335，BY989，DF30，XY9和XY18)以及第9染色體短臂末端區(qū)域均能產(chǎn)生信號(hào)，部分信號(hào)與Knob-2重復(fù)(WK06-9和XY335)。MR68-3除了在所有材料第6染色體產(chǎn)生信號(hào)外，在第4染色體長(zhǎng)臂末端區(qū)域也可產(chǎn)生信號(hào)(Mo17除外)。MR68-3還可在其它8個(gè)材料(Z58，ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，BY989，XY9和XY18)中產(chǎn)生與Knob-2重疊的強(qiáng)信號(hào)。該多重SSON探針組在所有材料的第6染色體上表現(xiàn)出最強(qiáng)的信號(hào)多態(tài)性。在所有材料第6染色體短臂的衛(wèi)星位點(diǎn)上，MR68-3和Knob-2可產(chǎn)生幾乎完全重疊的清晰信號(hào)。在第6染色體的長(zhǎng)臂末端區(qū)域上，MR68-3只在10個(gè)材料(Z58，ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，BY989，XY9，XY18，SR16和SR568)中產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。Knob-2在12個(gè)材料的長(zhǎng)臂末端區(qū)域可產(chǎn)生或強(qiáng)或弱的信號(hào)，其中9個(gè)材料(Z58，ZD958，TZ201，ZZ8，WK702，XY9，XY18，SR16和SR568)的信號(hào)與MR68-3重疊。CentC69-1可在所有材料第6染色體著絲粒區(qū)域產(chǎn)生強(qiáng)度不同的雜交信號(hào)。

利用SSON探針通過一輪非變性熒光原位雜交過程即可實(shí)現(xiàn)玉米染色體核型分析，全部雜交時(shí)間只有2h。本研究中，5OD SSON探針(50-70美元)足以分析1000多個(gè)玻片，平均費(fèi)用遠(yuǎn)低于常規(guī)熒光原位雜交。因此，該技術(shù)可用于大規(guī)模玉米染色體變異快速分析。

盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式做出各種改變、替換和變更。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種寡核苷酸染液及其應(yīng)用與用法

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccaatccac tactttaggt ccaaaactca tgtttggggt ggtttcgcgc aatttcgtt 59

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggctaac acctacggat ttttgaccaa gaaatggtct ccaccagaaa tccaaaaat 59

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctctcgtgcg aatacaatgc cctcaatatc atagaaacac tattccttta gtgtgaata 59

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actactacta ctactactac tactactact actact 36