本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中單核苷酸多態(tài)性rs3888722在篩查落葉型天皰瘡患者中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

天皰瘡是一種少見(jiàn)的可威脅生命的自身免疫性大皰性皮膚病(Stanley,1989；Nousari and Anhalt,1999)，其特點(diǎn)為患者體內(nèi)存在抗角質(zhì)形成細(xì)胞黏附分子的自身抗體，缺乏角質(zhì)形成細(xì)胞間的黏連功能。天皰瘡發(fā)病率為每年0.76-6.7/百萬(wàn)人次，不同種族及地域間存在差異(Ahmed et al.,1990；Bystryn and Rudolph,2005；Meyer and Misery,2010)。盡管目前可通過(guò)長(zhǎng)期系統(tǒng)性應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑對(duì)該病進(jìn)行治療(Loiseau et al.,2000)，但在美國(guó)，由于天皰瘡導(dǎo)致的死亡率接近10％(Lombardi et al.,1996)，且目前的治療方案存在明顯的副作用。因此，我們需要對(duì)天皰瘡的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究并尋找新的治療方案。

尋常型天皰瘡(PV)和落葉型天皰瘡(PF)是天皰瘡的兩種主要亞型，二者影響皮膚的不同結(jié)構(gòu)層次并且有不同的臨床表現(xiàn)(Stanley,1989；Bystryn and Rudolph,2005)。尋常型天皰瘡主要的自身抗原為橋粒核心糖蛋白3(Dsg 3)，50％-60％的患者存在橋粒核心糖蛋白1(Dsg 1)的抗體。尋常型天皰瘡患者的皮膚和黏膜均受累。落葉型天皰瘡患者僅存在橋粒核心糖蛋白1(Dsg 1)的抗體，并且僅有皮膚損害，不累及黏膜。尋常型天皰瘡的皮損程度較深，體液流失較多，機(jī)體代謝紊亂，加大感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，與尋常型天皰瘡相比，落葉型天皰瘡的預(yù)后較好。盡管二者在臨床表現(xiàn)及自身抗原方面存在差異，二者被視為同一種疾病且治療方案相近。

目前，天皰瘡的遺傳學(xué)基礎(chǔ)還沒(méi)有被很好的研究，但通過(guò)不同種群中疾病患病率的差異、自身免疫性疾病與遺傳相關(guān)及HLA I和HLA II類分子在不同種群中的關(guān)聯(lián)性均可證實(shí)該病存在遺傳風(fēng)險(xiǎn)(Ahmed et al.,1990；Lombardi et al.,1996；Miyagawa et al.,1997；Lombardi et al.,1999；Loiseau et al.,2000；Shams et al.,2009；Saha et al.,2010；Tunca et al.,2010)。然而，大部分文章僅研究了較少的HLA等位基因并且缺乏獨(dú)立的驗(yàn)證。目前，僅有一篇關(guān)于尋常型天皰瘡的全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究，該研究對(duì)猶太人群中的100例尋常型銀屑病患者及397例健康對(duì)照進(jìn)行分析(Sarig et al.,2012)。然而，該研究除在HLAII類分子區(qū)域發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)信號(hào)外，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何篩查落葉型天皰瘡患者與檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了下述任一用途：

A1)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備篩查落葉型天皰瘡患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；

A2)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；

A3)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測(cè)與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

A4)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B1)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備篩查落葉型天皰瘡患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B2)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B3)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在篩查落葉型天皰瘡患者中的應(yīng)用；

B4)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性中的應(yīng)用；

B5)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在檢測(cè)與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的中的應(yīng)用；

B6)檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的中的應(yīng)用；

B7)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在篩查落葉型天皰瘡患者中的應(yīng)用；

B8)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性中的應(yīng)用。

rs3888722是人染色體6p22.1上的一個(gè)二等位多態(tài)性的SNP位點(diǎn)，該變異是顛換(C/G，在其互補(bǔ)鏈上則為G/C)。所述rs3888722基因型是CC、CG或GG。所述CC是rs3888722位點(diǎn)為C的純合型，所述GG是rs3888722位點(diǎn)為G的純合型，所述CG是rs3888722位點(diǎn)為C和G的雜合型。所述檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型具體可為檢測(cè)rs3888722的核苷酸種類。

上述用途中，所述檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為擴(kuò)增包括rs3888722在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和/或成套探針。所述產(chǎn)品可包括所述PCR引物和/或所述成套探針。

上述用途中，所述GG和所述CG基因型的個(gè)體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例分別高于對(duì)應(yīng)的基因型在正常人群體中的比例，所述GG和所述CG基因型的個(gè)體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例分別高于對(duì)應(yīng)的基因型在尋常型天皰瘡群體中的比例。

上述用途中，所述落葉型天皰瘡具體可為中國(guó)人群落葉型天皰瘡。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了含有檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的含有檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)-d)中的任一種產(chǎn)品：

a)檢測(cè)與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品；

b)鑒定或輔助鑒定與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品；

c)篩查落葉型天皰瘡患者產(chǎn)品；

d)檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性產(chǎn)品。

上述產(chǎn)品中，所述檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為擴(kuò)增包括rs3888722在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和/或成套探針。

上述產(chǎn)品中，所述落葉型天皰瘡具體可為中國(guó)人群落葉型天皰瘡。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述M1)或M2)的方法：

M1)篩查落葉型天皰瘡患者的方法，包括：檢測(cè)待測(cè)對(duì)象基因組中rs3888722位點(diǎn)的基因型，如rs3888722位點(diǎn)的基因型為GG基因型，所述待測(cè)對(duì)象為或候選為落葉型天皰瘡患者；如rs3888722位點(diǎn)的基因型為CG基因型，所述待測(cè)對(duì)象為或候選為落葉型天皰瘡患者；如rs3888722位點(diǎn)的基因型為CC基因型，所述待測(cè)對(duì)象為或候選為非落葉型天皰瘡患者；

M2)檢測(cè)落葉型天皰瘡易感性的方法，包括：檢測(cè)待測(cè)對(duì)象基因組中rs3888722位點(diǎn)的基因型，如rs3888722位點(diǎn)的基因型為GG基因型，所述待測(cè)對(duì)象易感或候選易感落葉型天皰瘡；如rs3888722位點(diǎn)的基因型為CG基因型，所述待測(cè)對(duì)象易感或候選易感落葉型天皰瘡；如rs3888722位點(diǎn)的基因型為CC基因型，所述待測(cè)對(duì)象不易感或候選不易感落葉型天皰瘡。

上述方法中，檢測(cè)待測(cè)對(duì)象基因組中rs3888722位點(diǎn)的基因型可采用所述檢測(cè)rs3888722的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)進(jìn)行。

上述方法中，所述落葉型天皰瘡具體可為中國(guó)人群落葉型天皰瘡。

實(shí)驗(yàn)證明，rs3888722的風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)镚，該等位基因在落葉型天皰瘡患者群體中的比例比該等位基因在正常健康人群中的比例高147.32％，比該等位基因在尋常型天皰瘡患者中的基因頻率增加了46.96％，比正常對(duì)照和尋常型天皰瘡患者群體中的基因頻率增加了132.90％。rs3888722的P值是6.73×10^-9，且rs3888722的相對(duì)危險(xiǎn)度是2.74，說(shuō)明rs3888722是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。rs3888722的三個(gè)基因型中，GG基因型的個(gè)體和CG基因型的個(gè)體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例分別高于對(duì)應(yīng)的基因型的個(gè)體在正常人群體和/或?qū)こＰ吞彀挴徎颊呷后w中的比例，CC基因型的個(gè)體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例低于該基因型的個(gè)體在正常人群體和/或?qū)こＰ吞彀挴徎颊呷后w中的比例。

本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用中，可將檢測(cè)rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查落葉型天皰瘡患者的產(chǎn)品。

其中，檢測(cè)人基因組中rs3888722的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為通過(guò)下述至少一種方法確定rs3888722的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器：DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜、SNP芯片、TaqMan探針技術(shù)和Sequenom MassArray技術(shù)。其中，利用Sequenom MassArray技術(shù)確定rs3888722的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括PCR引物對(duì)、基于單堿基延伸反應(yīng)的延伸引物、磷酸酶、樹(shù)脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)和/或Sequenom MassArray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器；利用TaqMan探針技術(shù)確定rs3888722的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括TaqMan探針、PCR引物對(duì)、定量PCR儀、進(jìn)行基因分型的模塊和/或TaqMan探針技術(shù)所需要的其他試劑；SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片和/或基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，，利用的是TaqMan探針技術(shù)。

所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒和儀器組成的系統(tǒng)，如由引物和DNA測(cè)序儀組成的系統(tǒng)，由PCR試劑和DNA測(cè)序試劑和DNA測(cè)序儀組成的系統(tǒng)，由TaqMan探針、PCR引物對(duì)、定量PCR儀和進(jìn)行基因分型的模塊以及TaqMan探針技術(shù)所需要的其他試劑組成的系統(tǒng)，由探針、PCR引物對(duì)以及連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)，由PCR引物對(duì)、單堿基延伸引物、芯片、PCR儀、進(jìn)行基因分型的模塊和/或Sequenom MassArray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)。

采用TaqMan探針技術(shù)確定rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)和基因型時(shí)，所述PCR引物對(duì)在序列上沒(méi)有特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括rs3888722在內(nèi)的基因組DNA片段即可。所述TaqMan探針的序列覆蓋rs3888722。所述定量PCR儀為ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。所述進(jìn)行基因分型的模塊具體可為7900System SDS software。

本發(fā)明中，所述PCR引物可由rs3888722-F和rs3888722-R組成；

所述rs3888722-F是如下a1)至a4)中的任一種單鏈DNA：

a1)序列表中序列4所示的單鏈DNA；

a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA；

a3)與a1)或a2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；

a4)在嚴(yán)格條件下與a1)或a2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA；

所述rs3888722-R是如下b1)至b4)中的任一種單鏈DNA：

b1)序列表中序列5所示的單鏈DNA；

b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA；

b3)與b1)或b2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。

所述成套探針由探針1和探針2組成；所述探針1的序列為如下c1)至c4)中的任一種：

c1)序列表中序列6所示的序列；

c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的序列；

c3)與c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；

c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的序列雜交的序列；

所述探針2的序列為如下d1)至d4)中的任一種：

d1)序列表中序列7所示的序列；

d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的序列；

d3)與d1)或d2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；

d4)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的序列雜交的序列。

a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA為在序列4所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA為在序列5所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個(gè)核苷酸得到的單鏈DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的序列為在序列6所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個(gè)核苷酸得到的序列。d2)所述在d1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的序列為在序列7所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個(gè)核苷酸得到的序列。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的序列4、序列5、序列6或序列7所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述85％以上同一性，可為85％、90％或95％以上的同一性。

所述探針1和所述探針2均可由熒光物質(zhì)標(biāo)記。所述探針1可為在序列表中序列6所示的單鏈DNA的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料FAM、在3’端標(biāo)記淬滅熒光染料NFQ得到的TaqMan探針。所述探針2可為在序列7所示的單鏈DNA的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光染料VIC、在3’端標(biāo)記淬滅熒光染料NFQ得到的TaqMan探針。

本發(fā)明在一個(gè)來(lái)自中國(guó)人群的樣本(落葉型天皰瘡患者群體、尋常型天皰瘡患者群體和健康群體)中發(fā)現(xiàn)rs3888722是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，并且rs3888722的單核苷酸多態(tài)性與尋常型天皰瘡無(wú)關(guān)?？蓪z測(cè)rs3888722的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測(cè)其它的與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查落葉型天皰瘡患者的產(chǎn)品。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、rs2178077和rs3888722是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性

研究對(duì)象

全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)階段的研究對(duì)象包括166例天皰瘡患者(尋常型天皰瘡(PV)101例，落葉型天皰瘡(PF)65例)和885例正常對(duì)照(CK)。在SNP驗(yàn)證階段中的研究對(duì)象為156例天皰瘡患者(PV 86例，PF 70例)和996例正常對(duì)照(CK)。聯(lián)合分析研究對(duì)象為369例天皰瘡患者(PV 210例，PF 159例)和2493例正常對(duì)照(CK)。所有研究對(duì)象均來(lái)自于中國(guó)人群。

所有天皰瘡患者的診斷符合以下4條：1)臨床特點(diǎn)：紅斑基礎(chǔ)上的水皰、大皰，尼式征陰性；2)具有典型的尋常型天皰瘡或落葉型天皰瘡病史；3)免疫學(xué)檢查包括皮膚活檢組織的直接免疫熒光與血漿樣本的間接免疫熒光證實(shí)其為尋常型天皰瘡或落葉型天皰瘡患者；4)ELISA分析證實(shí)其為尋常型天皰瘡或落葉型天皰瘡患者。

所有正常對(duì)照都被臨床證實(shí)無(wú)天皰瘡(包括尋常型天皰瘡和落葉型天皰瘡)病史且無(wú)天皰瘡的家族史，并均沒(méi)有自身免疫性疾病。

所有患者和對(duì)照的特點(diǎn)見(jiàn)表1。年齡分布及性別比例在PV群體、PF群體及對(duì)照群體中均無(wú)顯著差異。

表1、發(fā)現(xiàn)階段與驗(yàn)證階段的樣本

本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象都已簽署知情同意書。

樣本為每位患者的大約2ml全血，提取基因組DNA用于基因型分析。

發(fā)現(xiàn)階段(第一階段)

對(duì)發(fā)現(xiàn)階段的101例PV、65例PF和885例正常對(duì)照應(yīng)用涵蓋900015個(gè)SNPs的Illumina Omni Zhonghua芯片進(jìn)行基因分型。在進(jìn)一步分析時(shí)排除了總體基因分型率<96％或雜合體率超過(guò)平均值±3S.D.的樣本(18例對(duì)象)；通過(guò)繼承等同分析(IBD)(PI_HAT>0.25)確定的9例可能的重復(fù)樣本或親戚樣本也被排除。滿足下列條件的SNPs也被排除：(i)沒(méi)有映射到常染色體；(ii)call rate<90％；(iii)MAF<0.01；(iv)對(duì)照中SNP的基因型分布與Hardy-Weinberg平衡的預(yù)測(cè)值(P<10^-5)相偏離。在對(duì)樣本和SNP進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾后，得到了包含101例PV，65例PF病例及844例對(duì)照中的43826個(gè)常見(jiàn)獨(dú)立的SNPs(r2<0.1)的數(shù)據(jù)集，將這些數(shù)據(jù)以及來(lái)自YRI(來(lái)自尼日利亞，伊巴丹的約魯巴人；n＝90)，CEU(來(lái)自北歐和西歐的猶太人；n＝90)，CHB(n＝45)和JPT(n＝44)的HapMap樣本一起進(jìn)行PCA分析，排除了14個(gè)異常的樣本。我們對(duì)剩余的病例和對(duì)照樣本進(jìn)行了另一輪PCA，結(jié)果顯示病例和對(duì)照都匹配很好(附件圖S1)。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制階段，一共有101例PV，65例PF和844例對(duì)照的806342個(gè)SNPs被納入到全基因組SNP推算。對(duì)于那些基于千人組計(jì)劃的基準(zhǔn)(2012年3月發(fā)布)而未分型的SNPs，我們應(yīng)用Shapeit(Delaneau et al.,2013)和IMPUTE_v2(Howie et al.,2009)來(lái)定相和推算。低推算置信度(INFO score<0.8)，顯著的Hardy-Weinberg連鎖不平衡(P<10^-5)或MAF<5％的SNPs被排除于進(jìn)一步的分析之外。最終，在GWAS發(fā)現(xiàn)階段一共有101例PV病例，65例PF病例和844例對(duì)照中的5546030個(gè)SNPs被分型和推算。

SNP驗(yàn)證階段(第二階段)

發(fā)明人選取了82個(gè)SNPs按以下1)或2)的標(biāo)準(zhǔn)：1)在PV關(guān)聯(lián)分析中P<10^-4；或2)在PF關(guān)聯(lián)分析中P<10^-4，在另一獨(dú)立樣本中選擇56例PV患者，49例PF患者和996例正常對(duì)照的獨(dú)立樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。在82個(gè)SNPs中，一共有71個(gè)SNPs被成功分型，call rate>90％且無(wú)顯著HWE偏離(P>0.0003)。

其中rs2178077SNP分型的引物序列如下：

rs2178077_W1_F(正向引物)：ACGTTGGATGTAACAACCGAGGATTACTGC(序列1)

rs2178077_W1_R(反向引物)：ACGTTGGATGATCTCAGCAGTGATGTTGCC(序列2)

rs2178077_W1_E(延伸引物)：TGCCTCCGATGAGCAC(序列3)

rs2178077SNP分型的具體操作步驟如下：

采用Sequenom MassArray(San Diego，USA)平臺(tái)驗(yàn)證，每個(gè)樣本約用到15ngDNA。首先提取外周血的基因組DNA，標(biāo)準(zhǔn)化后，樣本DNA經(jīng)多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增包括SNP位點(diǎn)在內(nèi)的基因組DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SNP位點(diǎn)特異性單一鏈的延伸，延伸產(chǎn)物脫鹽并轉(zhuǎn)移到384孔的芯片上。質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)進(jìn)行等位基因的檢測(cè)，采用Sequenom Mass ARRAY分型軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1、全血標(biāo)本采集

在患者知情同意，并簽署書面同意書的情況下采集研究對(duì)象外周靜脈血5ml，放置于EDTANa₂抗凝管中，置-80℃冰柜儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2、DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化包括如下步驟：

1)利用NanoDrop-1000濃度測(cè)試儀準(zhǔn)確測(cè)定每一份需要標(biāo)準(zhǔn)化的樣本DNA濃度和OD比值(A260/A280、A260/A230)。

2)建立電子表格，排定每個(gè)樣本孔需要加入的DNA編號(hào)。

進(jìn)行Sequenom MassArray分型的樣本，在每96孔板上留有空白對(duì)照和重復(fù)樣本對(duì)照。

3)按照電子表格的順序，加入已測(cè)定濃度的DNA。

對(duì)于進(jìn)行Sequenom MassArray分型的樣本要求實(shí)驗(yàn)濃度為12-30ng/μl，一般以18ng/μl為佳。并且A260/A280比值介于1.5-2.0之間、A260/230介于1.5-2.3，如DNA濃度高于18ng/μl則加入適量FG3，將濃度標(biāo)化至18ng/μl；如DNA濃度低于12ng/μl，則重新從血液提取合格的DNA。濃度在12—18ng/μl間直接加入。

離心后貼上粘性錫箔紙，并用標(biāo)記筆標(biāo)上樣本板標(biāo)號(hào)、樣本類型、來(lái)源地等信息。

4)在平板離心機(jī)上，3000g離心3分鐘，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3、利用正向引物和反向引物進(jìn)行多重PCR。

4、SNP位點(diǎn)特異性單一鏈的延伸反應(yīng)

其中，延伸引物根據(jù)人基因組中SNP位點(diǎn)上游(不包括該SNP位點(diǎn))設(shè)計(jì)，所述延伸引物的最后1位核苷酸對(duì)應(yīng)于人基因組中該SNP位點(diǎn)的前1位核苷酸。

5、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

1)對(duì)分型的SNP進(jìn)行call rate計(jì)算，去除call rate<95％的SNP或等位基因頻率<0.01的SNPs；

2)對(duì)SNP進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，去除偏離遺傳平衡定律的SNP(對(duì)照樣本中Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的P≦0.001)。

3)在Sequenom MassArray系統(tǒng)中查看SNP的分型聚類圖，去除聚類圖分堆不清的SNP。

4)樣本質(zhì)控：直接去除分型失敗的樣本。

將通過(guò)質(zhì)控的樣本和SNP進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Plink 1.07軟件對(duì)分型成功并通過(guò)質(zhì)控的SNP在病例組和對(duì)照組做基因表型相關(guān)性分析，用Cochran-Armitage trend檢驗(yàn)每個(gè)樣本的基因型和表型的關(guān)聯(lián)性，然后用Cochran-Mantel-Haenszel綜合分析所有樣本的基因型和表型的相關(guān)性。用Q檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)個(gè)體間的異質(zhì)性，本次實(shí)驗(yàn)中，以p<0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。多重logistic回歸分析用于檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的信號(hào)的獨(dú)立性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α以0.05除以通過(guò)質(zhì)量控制的SNP數(shù)目為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。Q檢驗(yàn)用于評(píng)估遺傳異質(zhì)性的顯著性，對(duì)SNP校正檢測(cè)后P值小于0.05者視為有顯著遺傳異質(zhì)性。

經(jīng)過(guò)對(duì)MHC突變的分析，發(fā)明人選取了1個(gè)MHC區(qū)域內(nèi)的獨(dú)立的SNP(rs3888722)應(yīng)用Taqman Allelic Discrimination Assay(Applied Biosystems)在新招募的一批樣本與部分驗(yàn)證階段的研究對(duì)象(共148例病例(80例PV，68例PF)和759例正常對(duì)照，年齡分布及性別比例在PV群體、PF群體及對(duì)照群體中均無(wú)顯著差異)中進(jìn)行驗(yàn)證，新招募的研究對(duì)象也均符合上文中的標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)SNP被成功分型，call rate>90％且無(wú)顯著HWE偏離(P>0.025)。

利用7900HT/Taqman基因分型系統(tǒng)Taqman Allelic Discrimination Assay(Applied Biosystems)對(duì)rs3888722進(jìn)行分型：

引物及探針序列為：

正向引物rs3888722-F：TGTGGTTAAGCATTCTATCGAATCA(序列4)

反向引物rs3888722-R：TGTCATCCACAGCAGAGACATG(序列5)

探針1rs3888722-P1：AGGAACACTAAAAGTT(序列6)，5′端由報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3′端由淬滅熒光染料NFQ標(biāo)記

探針2rs3888722-P2：AACACTAAAACTTGCTTCT(序列7)，5′端由報(bào)告熒光染料VIC標(biāo)記，3′端由淬滅熒光染料NFQ標(biāo)記

操作步驟如下：

分別抽取每個(gè)對(duì)象的外周靜脈血5ml，提取基因組DNA，分別基因組DNA(DNA濃度均在50-100ng/微升之間)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為：基因組DNA 1μL、2×TaqMan GT master mix(Life technology公司)2.5μL、20×TaqMan探針混合物0.65μL、去離子水0.85μL。將上述反應(yīng)體系加入96孔PCR板中，采用ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃變性30秒，60℃退火1分鐘，40個(gè)循環(huán)。

上述反應(yīng)體系中，20×TaqMan探針混合物包括擴(kuò)增包括rs3888722在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物對(duì)和成套探針，其中PCR引物對(duì)由上述正向引物和反向引物組成，成套探針由探針1和探針2組成。

反應(yīng)結(jié)束后，采用7900System SDS software進(jìn)行基因型分型，確定研究位點(diǎn)的基因型。

在排除分型失敗樣本外，在共計(jì)157例尋常型天皰瘡(PV)患者、114例落葉型天皰瘡(PF)患者和1840例正常對(duì)照中聯(lián)合分析rs2178077與天皰瘡的相關(guān)性(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2178077是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，rs2178077的P值是1.57×10^-9，rs2178077的相對(duì)危險(xiǎn)度是3.03。該SNP天皰瘡(PV和PF)患者和正常對(duì)照中的基因型頻率如表3所示。結(jié)果表明：rs2178077的三個(gè)基因型中，AG基因型的個(gè)體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個(gè)體在正常人群體和PV患者群體中的比例，AA基因型的個(gè)體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個(gè)體在正常人群體和PV患者群體中的比例，GG基因型的個(gè)體在PF患者群體中的比例分別低于該基因型的個(gè)體在正常人群體和PV患者群體中的比例。

在排除分型失敗樣本外，在共計(jì)167例尋常型天皰瘡(PV)患者、125例落葉型天皰瘡(PF)患者和1675例正常對(duì)照中聯(lián)合分析rs3888722與天皰瘡的相關(guān)性(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于MHC區(qū)域內(nèi)的rs3888722是與落葉型天皰瘡相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)；rs3888722的P值是6.73×10^-9，OR值為2.74。該SNP天皰瘡(PV和PF)患者和正常對(duì)照中的基因型頻率如表3所示。結(jié)果表明：rs3888722的三個(gè)基因型中，GC基因型的個(gè)體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個(gè)體在正常人群體和PV患者群體中的比例，GG基因型的個(gè)體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個(gè)體在正常人群體和PV患者群體中的比例，CC基因型的個(gè)體在PF患者群體中的比例分別低于該基因型的個(gè)體在正常人群體和PV患者群體中的比例。

表2、PV患者、PF患者和正常對(duì)照群體中各基因型的個(gè)體數(shù)及基因型頻率

注：rs2178077的基因型中，A1*A1表示AA，A1*A2表示AG，A2*A2表示GG；

rs3888722的基因型中，A1*A1表示GG，A1*A2表示GC，A2*A2表示CC。

表3、rs2178077在PV患者、PF患者和正常對(duì)照群體中的等位基因頻率

表4、rs3888722在PV患者、PF患者和正常對(duì)照群體中的等位基因頻率

利用二分類的logistic回歸模型(log-additive模型)計(jì)算PV患者群體、PF患者群體和正常人群體中基因頻率差異性P值，確定SNP有無(wú)顯著性意義，其中基因型采用可加模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2178077和rs3888722的各等位基因的基因頻率在正常人群體和PF患者群體中均有顯著性差異，而在正常人群體和PV患者群體中均無(wú)顯著性差異。

由表3可知，rs2178077的風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)锳，與正常對(duì)照相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了103.25％，與PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了99.25％，與正常對(duì)照和PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了102.93％。

由表4可知，rs3888722的風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)镚，與正常對(duì)照相比該等位基因的基因頻率在PF患者中增加了147.32％，與PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了46.96％，與正常對(duì)照和PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了132.90％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rs2178077和rs3888722的多態(tài)性或基因型或等位基因頻率可用于PF患者的篩查。

<110> 山東省皮膚病性病防治研究所

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

acgttggatg taacaaccga ggattactgc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

acgttggatg atctcagcag tgatgttgcc 30

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tgcctccgat gagcac 16

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tgtggttaag cattctatcg aatca 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tgtcatccac agcagagaca tg 22

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

aggaacacta aaagtt 16

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

aacactaaaa cttgcttct 19