本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的PCR檢測方法，具體是一種能同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》GB 14922.2-2011中對病原體的檢測方法——以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清型分析和特殊鑒定實(shí)驗(yàn)為主。在臨床實(shí)踐中，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的常見重要病原體，且易混合感染。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如分離培養(yǎng)、免疫學(xué)試驗(yàn)等費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于臨床快速診斷，也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)狀傳統(tǒng)方法存在過程繁瑣，費(fèi)時(shí)，檢出率低和漏檢等缺陷。為了滿足大樣本的多種病原體的快速檢測，急需一種快速、簡便、準(zhǔn)確率高的多重PCR檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測多種病原體的五重PCR檢測方法，其步驟簡單，檢測快速，準(zhǔn)確性高，易于標(biāo)準(zhǔn)化，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的。隨著PCR的核酸檢定技術(shù)成功的在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，建立多重PCR新技術(shù)檢測成為可能。多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction)是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。其可在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多種病原體的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于同時(shí)檢測多種病原體或不同型病原體?；诖耍景l(fā)明本著一次性檢測就可以檢出樣品中五種病原體的目標(biāo)，首先從已發(fā)表的文獻(xiàn)中篩選出具有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的保守性序列的基因，作為PCR檢測的靶點(diǎn)，分別合成擴(kuò)增對應(yīng)保守序列的特異性引物，將5對引物同時(shí)放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，通過各項(xiàng)優(yōu)化，建立直接從樣本中一次性檢測五種病原體的五重PCR檢測方法。本發(fā)明還通過檢測糞便改進(jìn)取材，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)利用該五重PCR方法快速檢測實(shí)際樣品的目的。

具體的，本發(fā)明的一種同時(shí)檢測多種病原體的五重PCR檢測方法，包括以下步驟：

(1)篩選出具有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的保守性序列的基因，作為PCR檢測的靶點(diǎn)，分別合成擴(kuò)增對應(yīng)保守序列的特異性引物；

(2)將5對引物同時(shí)放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增出目的基因片段；

(3)通過瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，擴(kuò)增金黃色葡萄球菌上游引物的序列如表1a所示，下游引物的序列如表1b所示；擴(kuò)增綠膿桿菌上游引物的序列如表1c所示，下游引物的序列如表1d所示；擴(kuò)增肺支原體上游引物的序列如表1e所示，下游引物的序列如表1f所示；擴(kuò)增多殺巴氏桿菌上游引物的序列如表1g所示，下游引物的序列如表1h所示；擴(kuò)增支氣管敗血性波氏桿菌上游引物的序列如表1i所示，下游引物的序列如表1j所示。具體見表1。

表1：引物序列及PCR產(chǎn)物

本發(fā)明中，步驟(1)，由于對引物的退火溫度，片段長度等要求，最終選定金黃色葡萄球菌的nuc基因、綠膿桿菌的LasI基因、多殺巴氏桿菌的KMT1基因、支氣管敗血性波氏桿菌的Fla基因和肺支原體的16S rRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物。

本發(fā)明中，步驟(2)，PCR反應(yīng)體系為50μl，包括：Mix 25μl，引物7μl，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA每種1μl DNA，其余無菌水補(bǔ)足；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；進(jìn)入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。

本發(fā)明中，步驟(3)，PCR產(chǎn)物在2.5％瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min。

本發(fā)明中，實(shí)際檢測樣品前先選擇人工摻病原體陽性標(biāo)本驗(yàn)證體系檢測能力，再取待檢測樣本糞便和氣管分泌物，提取被檢病原體的DNA，作為模板，進(jìn)行五重PCR檢測，全過程僅需要4h；并且通過檢測糞便改進(jìn)取材，進(jìn)一步達(dá)到利用該五重PCR方法快速無創(chuàng)檢測無創(chuàng)實(shí)際樣品的目的。而常規(guī)的檢測方法需要培養(yǎng)基接種，一般需24h長出菌落，再生化接種，此過程時(shí)間較長，并且對檢測人員的技能要求高。本發(fā)明較常規(guī)方法縮短了檢測時(shí)間，能進(jìn)一步達(dá)到快速檢測和檢測標(biāo)準(zhǔn)化的目的。

本發(fā)明取得如下有益效果：

(1)較常規(guī)的PCR檢測方法，本發(fā)明的五重PCR檢測方法具有快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，同時(shí)降低了對檢測人員的要求、檢測平臺(tái)和檢測成本，提高了檢測效率。

(2)該方法體系通過檢測糞便改進(jìn)取材，進(jìn)一步達(dá)到利用該五重PCR方法快速無創(chuàng)檢測無創(chuàng)實(shí)際樣品的目的。

附圖說明

圖1是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR體系引物濃度的優(yōu)化結(jié)果；其中：M為100bp DNA Ladder；泳道1-4：多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為1μl，0.5μl，0.25μl，0.125μl。

圖2是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR體系退火溫度的優(yōu)化結(jié)果；其中：M為100bp DNA Ladder；泳道1：56℃；泳道2：58℃；泳道3：60℃；泳道4：62℃。

圖3是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR人工樣本的檢測結(jié)果；其中：M為100bp DNA Ladder；泳道1：五重PCR陽性對照；泳道2：五重PCR陰性對照；泳道3：糞便陰性對照；泳道4：金黃色葡萄球菌；泳道5：綠膿桿菌；泳道6：金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌；泳道7：氣管分泌物陰性對照；泳道8：多殺巴氏桿菌；泳道9：支氣管敗血性波氏桿菌；泳道10：肺支原體；泳道11：多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體；泳道12：金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體。

圖4是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR樣本的檢測結(jié)果；其中：M為100bp DNA Ladder；泳道1：五重PCR陽性對照；泳道2：五重PCR陰性對照；泳道3-17：樣本的糞便和氣管分泌物。

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1 金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR體系退火溫度的優(yōu)化

(1)樣品前處理

將標(biāo)準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體分別在相應(yīng)的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其中金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌培養(yǎng)24h，多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌培養(yǎng)36h，肺支原體培養(yǎng)7d，收集菌液或菌落提取相應(yīng)的DNA樣本。

(2)細(xì)菌DNA提取

本發(fā)明采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，步驟如下：

①將上述5種病原體菌液或菌落溶于緩沖液GA,震蕩懸?。?/p>

②加入20μl Proteinase K溶液，混勻，加入220μl緩沖液GB，震蕩15s，70℃10min，加入220μl無水乙醇，充分震蕩混勻；

③將溶液和沉淀都加入一個(gè)吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；

④向吸附柱加500μl緩沖液GD，12000rpm離心30s，棄廢液；

⑤向吸附柱加600μl緩沖液PW，12000rpm離心30s，棄廢液；重復(fù)一次；

⑥收集沉淀，30μl TE溶解。

(3)多重PCR反應(yīng)體系建立

在PCR反應(yīng)體系中，尤其是多重PCR反應(yīng)體系中，引物濃度和退火溫度是關(guān)鍵的影響因素。本發(fā)明為了找到合適的五重PCR體系的引物濃度和退火溫度，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：

①引物濃度的優(yōu)化：反應(yīng)體系：金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌上下游引物各為1μl，多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為1μl、0.5μl、0.25μl、0.125μl，Mix 25μl，DNA每種1μl DNA，其余用無菌水補(bǔ)足至50μl；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；進(jìn)入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min；PCR產(chǎn)物10μl在2.5％瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min。結(jié)果如圖1顯示2泳道較好。

②退火溫度的優(yōu)化：PCR反應(yīng)體系為50μl，包括：Mix 25μl，引物7μl，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌上下游引物各為1μl，多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為0.5μl，DNA每種1μl DNA，其余無菌水補(bǔ)足。反應(yīng)條件僅將退火溫度分別設(shè)置為56℃,58℃,60℃,62℃，其余不變。結(jié)果如圖2顯示3泳道較好。

(4)結(jié)果

PCR反應(yīng)體系為50μl，包括：Mix 25μl，引物7μl，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA每種1μl DNA，其余無菌水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；進(jìn)入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。

實(shí)施例2 金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR人工樣本的檢測

(1)樣品前處理

取待檢測動(dòng)物的樣本糞便和氣管分泌物。

(2)細(xì)菌DNA提取

同實(shí)施例1

(3)多重PCR反應(yīng)體系建立

PCR反應(yīng)體系為50μl，Mix 25μl，引物7μl，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA分別為陽性對照5μl，陰性對照0μl，樣本糞便和氣管分泌物各2μl，其余無菌水補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；進(jìn)入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物10μl在2.5％瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min。

(4)結(jié)果

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR樣本的檢測結(jié)果如圖3所示：1陽性對照；2陰性對照；3、7糞便和氣管分泌物的陰性對照；4金黃色葡萄球菌；5綠膿桿菌；6金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌；8多殺巴氏桿菌；9支氣管敗血性波氏桿菌；10肺支原體；11多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體；12金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體。由結(jié)果看出，該五重PCR檢測體系可以檢出金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體。

實(shí)施例3 金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR樣本的檢測

(1)樣品前處理

取待檢測動(dòng)物的樣本糞便和氣管分泌物。

(2)細(xì)菌DNA提取

同實(shí)施例1

(3)多重PCR反應(yīng)體系建立

PCR反應(yīng)體系為50μl，Mix 25μl，引物7μl，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體上下游引物各為1μl、1μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl，DNA分別為陽性對照5μl，陰性對照0μl，樣本糞便和氣管分泌物各2μl，其余無菌水補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；進(jìn)入94℃30s，60℃30s，72℃30s的循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物10μl在2.5％瓊脂糖凝膠中，120V電泳30min。

(4)結(jié)果

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌和肺支原體的五重PCR樣本的檢測結(jié)果如圖4所示：1陽性對照；2陰性對照；3-17樣本的糞便和氣管分泌物。陽性對照和陰性對照良好，樣本的檢測為陰性，與傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種同時(shí)檢測多種病原體的五重PCR檢測方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

cacctgaaac aaagcatcct aa 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 2

tatacgctaa gccacgtcca t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 3

atgatcgtac aaattggtcg g 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 4

gtcatgaaac cgccagtc 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Bordetella bronchiseptica

<400> 5

aggctcccaa gagagaaagg ctt 23

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Bordetella bronchiseptica

<400> 6

tggcgcctgc cctatc 16

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 7

agcgtttgct tcactttgaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Mycoplasma pneumoniae

<400> 8

gggcatttcc ctccctagct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida

<400> 9

gtgagtgggc ttctcggtag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida

<400> 10

gctgtaaacg aactcgccac 20