人呼吸道病原體的流式細胞檢測試劑盒、方法和細胞固定液的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于病原體診斷技術領域，具體涉及一種人呼吸道病原體的流式細胞檢測方法和試劑盒以及細胞固定液。
【背景技術】
[0002]流感病毒A (ΙΑ)，流感病毒Β (IB)，呼吸道合胞病毒(RSV)和呼吸道腺病毒(ADV)、副流感1、2、3、偏肺病毒、博卡病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腸道病毒、支原體、衣原體是引起呼吸道疾病的主要病原體。其中流感病毒A，流感病毒B，呼吸道合胞病毒和呼吸道腺病毒最為常見，約占呼吸道疾病的病毒性病原體的50%。為了更加快速和靈敏檢測呼吸道病毒，合理使用各種抗生素，和治療流感的新抗病毒藥物的使用，早期檢測和辨別感染病毒變得非常重要。
[0003]目前標準的鑒定病毒的方法仍然是通過細胞培養(yǎng)和使用熒光單克隆抗體。然而，細胞培養(yǎng)法分離率低、耗時長，因此限制了它的使用。目前臨床上使用熒光單克隆抗體檢測呼吸道病毒感染的方法，具體是指玻片直接免疫熒光法，該方法通過肉眼觀察，并且根據(jù)在玻片上點樣的標本中有綠色熒光細胞的數(shù)量來判定結果。因此玻片直接免疫熒光法結果的判定具有主觀性。而且由于該檢測方法需要人肉眼觀察結果，因此只能使用單一熒光素標記抗體，導致該方法一般一次只能鑒定一種病原體。
[0004]流式細胞術是利用流式細胞儀快速定量分析細胞群的物理化學特征的技術，主要應用于生命科學的基礎研究:免疫學、細胞生物學和分子生物學。80年代后期開始應用于臨床，用于測定外周血CD4T細胞的數(shù)量，監(jiān)測HIV感染者疾病的進展；利用流式分選干細胞過繼回輸用于疾病的治療。現(xiàn)在，流式細胞術還能輔助多種疾病的診斷，尤其是白血病的診斷和分型。由于流式細胞是以細胞表面因子為檢測對象，而人呼吸道病原體一般都位于細胞內(nèi)部，因此目前尚未見能很好地利用流式細胞術來檢測呼吸道病原體的技術和產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述技術缺陷，本發(fā)明提供了一種人呼吸道病原體的流式細胞檢測的細胞固定液，檢測試劑盒和檢測方法。通過本發(fā)明所提供的檢測方法和試劑盒，實現(xiàn)了人呼吸道病原體感染檢測的自動化、且結果客觀準確；可實現(xiàn)單樣本多重檢測，可反映病原體感染情況等技術效果。
[0006]本發(fā)明的目的之一在于提供一種細胞固定液。
[0007]實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。
[0008]—種細胞固定液，含有體積分數(shù)為0.1 % — 1 %甲醛和體積分數(shù)為60% — 80 %甲醇的PBS溶液，pH為7.2-7.4。
[0009]在其中一個實施例中，所述甲醛的體積分數(shù)為0.3% -0.8%，所述甲醇的體積分數(shù)為 60% — 65%。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種人呼吸道病原體的流式細胞檢測試劑盒。
[0011 ] 實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。
[0012]—種人呼吸道病原體的流式細胞檢測試劑盒，包括有:上述細胞固定液、細胞通透劑和至少一種待檢測人呼吸道病原體的單克隆抗體，每種人呼吸道待檢測病原體的抗體標記有熒光素，且針對不同待檢測人呼吸道病原體的熒光素各不相同。
[0013]在其中一個實施例中，還包括有細胞洗滌液。
[0014]在其中一個實施例中，所述人呼吸道病原體為呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IA)、乙型流感病毒(IB)、腺病毒(Adv)、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腸道病毒、支原體或衣原體中的至少一種。
[0015]在其中一個實施例中，所述細胞通透劑為Triton-XlOO溶液。
[0016]本發(fā)明的另一目的是提供一種人呼吸道病原體的流式細胞檢測方法。
[0017]實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。
[0018]—種人呼吸道病原體的流式細胞檢測方法，包括如下步驟:
[0019](1)標本采集和細胞固定:收集呼吸道的標本中的上皮細胞到上述細胞固定液內(nèi)；
[0020](2)單細胞懸液的制備:洗去所述細胞固定液；
[0021](3)加入細胞通透劑和熒光素標記的待檢測的人呼吸道病原體的單克隆抗體進行染色，不同呼吸道病原體的單克隆抗體所標記的熒光素不同；
[0022](4)洗去多余的抗體；
[0023](5)上流式細胞儀進行分析。
[0024]所述標本為咽拭子或肺泡支氣管灌洗液。
[0025]本發(fā)明所述細胞固定液，能夠很好地使組織和細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態(tài)。對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。
[0026]本發(fā)明通過將細胞固定液固定，以Triton-XlOO溶液作為細胞通透劑，熒光染色等步驟實現(xiàn)流式細胞儀方法檢測呼吸道上皮細胞病原體，計算病原體感染陽性的上皮細胞占總上皮細胞的百分比，以此作為診斷呼吸道病原體感染的依據(jù)。與玻片免疫熒光法相比具有如下優(yōu)勢:a、檢測過程自動化，節(jié)省人力成本山、儀器自動計算陽性百分比，結果更加客觀準確；c、通過針對不同病原體單抗標記不同熒光染料，可實現(xiàn)單樣本多重檢測，節(jié)省資源和時間；d、更為重要的，要反映病原體感染情況，相比于玻片直接免疫熒光法以鏡下觀察到絕對量的熒光染色的細胞來反映，本發(fā)明所述檢測方法以相對的陽性百分比來反映更為準確。
【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明方法進行Adv檢測的結果圖，標本為分別采自8位臨床疑似呼吸道病原體感染患者的支氣管肺泡灌洗液標本；其中A:根據(jù)前向散射光信號(FSC-Η)和側向散射光信號(SSC-H)，劃出細胞門(P2) ;B:根據(jù)所述細胞門(P2)，作出細胞熒光信號(FITC-H)的柱形圖，在所述柱形圖上設定陽性門(M3)，其百分比(M3% )為陽性百分比；
[0028]圖2是利用玻片直接免疫熒光法進行四項呼吸道病原體(RSV、IA、IB和Adv)感染檢測的陽性結果圖，標本為分別標本為分別采自3位臨床疑似呼吸道病原體感染患者的口咽拭子標本。圖2-1、圖2-2、圖2-3分別為所述3份標本的陽性結果圖，圖中白色發(fā)亮的細胞為陽性細胞。
[0029]圖3是利用本發(fā)明方法檢測四項呼吸道病原體(RSV、IA、IB和Adv)感染情況的結果圖，標本為分別標本為分別采自3位臨床疑似呼吸道病原體感染患者的口咽拭子標本。3份標本的檢測結果分別如圖3-1、圖3-2、圖3-3所示，根據(jù)前向散射光信號(FSC-Η)和側向散射光信號(SSC-H)，劃出細胞門(P2)。根據(jù)所述細胞門，作出細胞熒光信號(RSV-H、IA-H、Adv-H、IB-Η)的柱形圖。在所述柱形圖上設定陽性門(M3、M4、M5、M6)，其百分比(M3%,M4%,M5%,M6%)為陽性百分比。所述陽性百分比作為診斷依據(jù)，本例各臨界值均設為
0.20%，大于0.20%的標本判為相應病毒感染陽性，小于或等于0.20%的標本判為相應病毒感染陰性。
【具體實施方式】
[0030]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0031]實施例1細胞固定液
[0032]本實施例所述的細胞固定液，含有體積分數(shù)為0.5%甲醛和體積分數(shù)為60%甲醇的PBS溶液。其配制方法為，在PBS溶液中加入甲醛和甲醇，使甲醛的體積分數(shù)為0.5%，甲醇的體積分數(shù)為60%，調(diào)節(jié)pH值至7.3，即得。
[0033]實施例2:人呼吸道病原體的流式細胞檢測試劑盒
[0034]本實施例提供一種人呼吸道病原體感染的流式細胞檢測試劑盒。該試劑盒包含實施例1所述的細胞固定液、細胞通透劑和熒光素(FITC-異硫氰酸熒光素)標記的針對Adv抗原的單克隆抗體(購自廣州