本發(fā)明涉及生物
技術領域：
中，靶DNA富集探針的制備方法。
背景技術：
：隨著越來越多生物基因組測序的完成,生物醫(yī)學研究已進入后基因組時代。隨著二代測序的成本不斷的降低，早在2014年，美國illumina公司已經推出全新高通量測序儀器，可以將測序成本降低到1000美元，基因檢測的普及和隨之加速，利用高通量測序技術在科學研究和臨床檢測上。目前，對于全基因組測序雖然成本已經到達1000美元，但在對于需要超高深度測序的臨床或科技研究領域，特別是腫瘤檢測中，高深度測序面臨的測序成本以及高通量數據的處理帶來的成本，不能廣泛的用于臨床檢測及相關研究中，所以就產生了基因捕獲技術，所謂基因捕獲，就是針對所需要關注或研究的目的區(qū)域設計相應的捕獲探針，利用雜交技術，將目的片段從全基因組中富集出來，將這些片段再進行高通量測序，既能滿足研究需要深度要求，同時也能實現不增加成本，目前基因捕獲技術已經在克隆、發(fā)現新基因及揭示基因功能方面具有獨特的優(yōu)點,已成為功能基因組時代研究的有力工具,在生物醫(yī)學研究各個領域的應用日趨廣泛。目前基因捕獲中用到的探針為cDNA單鏈探針和RNA探針。技術實現要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是如何制備可以捕獲靶DNA的探針。為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了靶DNA富集探針的制備方法。本發(fā)明所提供的靶DNA富集探針的制備方法，包括：制備N個亞探針，連接所述N個亞探針，得到靶DNA富集探針；所述N個亞探針滿足所述N個亞探針能覆蓋所述靶DNA的全部序列。其中，N為大于等于2的一個自然數。N的數值具體可根據所述靶DNA的長度和所述亞探針的長度確定，將所述靶DNA的長度(bp)與所述亞探針的長度(bp)的比值記為n，當n為非整數時，N＝n的整數部分+1；當n為整數時，N＝n。如果所述N個亞探針中存在序列完全相同的探針，在實際應用中還可以將去掉重復的亞探針，使所述亞探針的數量只要能滿足覆蓋所述靶DNA的全部序列即可。在本發(fā)明的一個實施例中，通過計算得到的N值為208，但在這208個亞探針中，第207個與第208個亞探針完全相同，在進行具體的實驗中，可只制備第1-207條亞探針。所述N個亞探針均為單鏈DNA或雙鏈DNA。所述N個亞探針能覆蓋所述靶DNA的全部序列的含義為如下H1或H2：H1、當所述N個亞探針均為單鏈DNA時，所述N個亞探針能與所述靶DNA的兩條單鏈DNA或一條單鏈DNA結合形成雙鏈DNA；當所述N個亞探針均只與所述靶DNA的一條單鏈DNA結合時，該所述靶DNA的單鏈DNA不存在不能與所述N個亞探針中的亞探針結合的位點；當所述N個亞探針與所述靶DNA的兩條單鏈DNA結合時，在所述靶DNA的任何一個位點均有一條鏈能與所述N個亞探針中的亞探針結合；也就是說，當所述N個亞探針均為單鏈DNA時，所述N個亞探針均與所述靶DNA的兩條單鏈DNA或一條單鏈DNA互補；當所述N個亞探針只與所述靶DNA的一條鏈DNA互補而與所述靶DNA的另一條鏈DNA均不互補時，與所述N個亞探針互補的所述靶DNA的那條單鏈DNA中不存在不與所述N個亞探針中的亞探針互補的位點；當所述N個亞探針能與所述靶DNA的兩條鏈中的DNA片段互補時，所述靶DNA的任何一個位點均有一條鏈與所述N個亞探針中的亞探針互補；H2、當所述N個亞探針均為雙鏈DNA時，所述N個亞探針能與所述靶DNA的兩條單鏈DNA結合形成雙鏈DNA，所述靶DNA的兩條單鏈DNA均不存在不能與所述N個亞探針中的任一條單鏈DNA結合的位點；也就是說，當所述N個亞探針均為雙鏈DNA時，所述N個亞探針中每個亞探針的兩條單鏈分別與所述靶DNA的兩條單鏈DNA在同一位點互補，所述靶DNA的兩條單鏈DNA均不存在不與所述N個亞探針互補的位點。在連接所述N個亞探針前還可包括將所述芯片上的所述N個亞探針洗脫下來。洗脫所述所述芯片上的所述N個亞探針可利用氨水進行。所述氨水的摩爾濃度可為35％。從所述芯片上洗脫下來的所述N個亞探針可利用超純水溶解。所述制備N個亞探針可在芯片上原位合成所述N個亞探針。上述靶DNA富集探針的制備方法中，在所述靶DNA上任何兩個相鄰的亞探針均可滿足上游亞探針的下游有一個或多個核苷酸與下游亞探針的上游重疊(即序列相同)。上述靶DNA富集探針的制備方法中，所述一個或多個核苷酸的數量可根據具體情況確定，所述一個或多個核苷酸的數量使所述N個亞探針的長度滿足具體實驗的要求。在本發(fā)明的一個實施例中，所述一個或多個核苷酸的數量使所述N個亞探針的長度均為108bp。上述方法中，所述一個或多個核苷酸的序列均為所述靶DNA上的序列，所述一個或多個核苷酸的序列為所述亞探針在所述靶DNA上延伸的序列。上述靶DNA富集探針的制備方法中，所述N個亞探針的長度均可為50-150bp。所述N個亞探針的長度具體均可為108bp。上述靶DNA富集探針的制備方法中，所述連接所述N個亞探針可包括下述A1)和A2)：A1)連接所述N個亞探針，得到長鏈DNA和/或環(huán)狀DNA；A2)將所述長鏈DNA和/或所述環(huán)狀DNA進行擴增，得到靶DNA富集探針。所述靶DNA富集探針為雙鏈DNA。上述靶DNA富集探針的制備方法中，在連接所述N個亞探針前還可包括對所述N個亞探針進行磷酸化修飾。對所述N個亞探針進行磷酸化修飾具體可為在所述N個亞探針的5′端進行磷酸化修飾。所述磷酸化修飾可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進行所述磷酸化修飾的反應體系可為：所述N個亞探針10μl、10×反應緩沖液5μl、10mMATP5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H2027.5μl。所述反應體系中所述N個亞探針的濃度可為5ng/μl。所述反應體系中10×反應緩沖液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均為NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑。所述磷酸化修飾的反應條件可為37℃30min。所述連接所述N個亞探針可利用ssDNA連接酶或epicentre的ssDNA連接試劑盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)進行。所述連接的反應體系可為：所述N個亞探針的磷酸化產物或所述N個亞探針20μl、CircLigaseII10×ReactionBuffer5μl、50mMMnCl22.5μl、5MBetaine10μl、CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5μl和H2O10μl。所述連接的反應條件可為60℃60min。上述靶DNA富集探針的制備方法得步驟A2)中，在進行將所述長鏈DNA或所述環(huán)狀DNA進行擴增時還可包括利用生物素對擴增產物進行標記。進行所述擴增可采用隨機引物進行。所述隨機引物可為由A、C、G和T這四個核苷酸隨機組成的長度均為6bp的46條單鏈DNA所形成的混合物。所述隨機引物中所有單鏈DNA的摩爾數均可相同。將所述長鏈DNA和/或所述環(huán)狀DNA進行擴增以及利用生物素對擴增產物進行標記可利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行。利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行反應的反應體系可為：所述長鏈DNA和/或所述環(huán)狀DNA10μl、2×反應緩沖液25μl、Bio-16-dUTP5μl、Replig_Enzyme1μl和H2O9μl。其中，2×反應緩沖液中含有所述隨機引物。利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行反應的反應溫度可為37℃。利用Qiagen公司的全基因組擴增試劑盒進行反應的時間可不小于16小時。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了捕獲靶DNA的方法。本發(fā)明所提供的捕獲靶DNA的方法，包括所述靶DNA富集探針的制備方法制備的靶DNA富集探針捕獲靶DNA。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了靶DNA測序的方法。本發(fā)明所提供的靶DNA測序的方法，包括利用所述捕獲靶DNA的方法捕獲靶DNA，然后對捕獲的靶DNA進行測序。上述靶DNA測序的方法中，所述對捕獲的靶DNA進行測序可利用現有技術中的測序方法進行，只要能達到對靶DNA測序的目的即可。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供可下述X1-X5中的任一應用：X1、所述靶DNA富集探針的制備方法在捕獲靶DNA中的應用；X2、所述靶DNA富集探針的制備方法在制備捕獲靶DNA產品中的應用；X3、所述靶DNA富集探針的制備方法在靶DNA測序中的應用；X4、所述靶DNA富集探針的制備方法在制備靶DNA測序產品中的應用；X5、所述捕獲靶DNA的方法在靶DNA測序中的應用。上述應用中，所述靶DNA測序可采用二代測序方法進行。實驗證明，利用本發(fā)明的靶DNA富集探針的制備方法制備的捕獲人類線粒體全基因的富集探針對人類線粒體基因的捕獲達到了100％覆蓋，其捕獲效率均大于50％，從至少覆蓋到4X、10X和20X的參數來看，均達到100％，探針的整體均一性非常好，并且穩(wěn)定性好。表明，本發(fā)明的靶DNA富集探針的制備方法可以用于制備靶DNA富集探針，并進一步對靶DNA進行測序。本發(fā)明的靶DNA富集探針的制備方法制備的探針為雙鏈DNA探針，存在以下優(yōu)勢：1、雙鏈DNA探針更加穩(wěn)定，不易降解；2、雙鏈DNA探針，在制備時，連接完成后，直接進行全基因組擴增，探針的均一性好；3、雙鏈DNA探針，在富集時，捕獲雙鏈，更加準確，可以排除單鏈中PCR帶入的堿基錯配。附圖說明圖1為連接產物檢測結果。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明所提供的靶DNA富集探針的制備方法，包括：制備N個亞探針，連接N個亞探針，得到長鏈DNA和環(huán)狀DNA；將長鏈DNA和環(huán)狀DNA進行擴增，得到靶DNA富集探針。下面以人類線粒體全基因為靶DNA為例，來具體闡述如何利用本發(fā)明的靶DNA富集探針的制備方法制備可以捕獲人類線粒體全基因的富集探針。實施例1、可以捕獲人類線粒體全基因的富集探針的制備1、單鏈亞探針的序列設計及制備作為靶DNA的人類線粒體全基因的序列如序列表中序列1所示。靶DNA的長度為16569bp，將靶DNA分為208個片段，其中，第1-207個片段的長度均為80bp，第208個片段的長度為9bp，每兩個相鄰的片段均符合上游片段的末位與下游片段的首位相連，即，第1個片段的序列為序列1的第1-80位，第2個片段的序列為序列1的第81-160位，……，第207個片段的序列為序列1的第16481-16560位，第208個片段的序列為序列1的第16561-16569位。根據靶DNA的這208個片段設計能覆蓋全靶DNA的單鏈亞探針，將這208個片段的序列分別向其上下游延伸，使最終得到的序列長度均為108bp，具體如下：將第1個片段的序列向其下游延伸28bp、將第2-206個片段的每個片段的序列分別向兩端延伸14bp、將第207個片段的序列向其上游延伸19bp向其下游延伸9bp(因為其下游不足14bp)、將第208個片段的序列向其上游延伸99bp，得到208條長度均為108bp的序列。其中，第1條序列為序列1的第1-108位，第2條序列為序列1的第67-174位，第3條序列為序列1的第147-254位，第n條序列為序列1的第(80(n-1)-13)位至第(80n+14)位，n為4-205中的任一個自然數，第206條序列為序列1的第16387-16494位，第207條序列為序列1的第16462-16569位，第208條序列為序列1的第16462-16569位，第207條序列與第208條序列完全相同。利用原位合成的方法，根據序列分別為上述第1-207條序列在芯片合成寡核苷酸探針，即207條單鏈亞探針。利用35％的氨水，將固定在芯片上的207條單鏈亞探針洗脫下來，收集到離心管中，利用真空濃縮儀濃縮后，加入500μl超純水溶解，成為一個靶DNA207條單鏈亞探針的混池；測定濃度，并稀釋到25ng/μl。2、可以捕獲人類線粒體全基因的富集探針的制備1)單鏈亞探針的5′磷酸化修飾：利用NEB的T4多聚核苷酸激酶試劑盒進行。5′磷酸化修飾的反應體系如下：組分體積(μl)207條單鏈亞探針的混池(50ng/μl)1010×反應緩沖液(ReactionBuffer)510mMATP5T4PolynucleotideKinase(T4多聚核苷酸激酶)2.5H2027.5總反應體積50μl，該反應體系中，除207條單鏈亞探針的混池和H2O外的試劑均為T4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑。混合均勻后，恒溫加熱器或PCR儀器上37℃恒溫孵育30min。反應結束后，利用微量PCR產物回收試劑盒按照其操作流程進行產物純化回收，洗脫體積20μl，得到磷酸化產物；2)連接反應：將步驟1)得到的磷酸化產物，利用商業(yè)的ssDNA連接試劑盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)連接，連接反應體系如下：組分體積(μl)步驟1)得到的磷酸化產物20CircLigaseII10×ReactionBuffer550mMMnCl22.55MBetaine10CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5H2O10總反應體積為50μl，該反應體系中，除步驟1)得到的磷酸化產物和H2O外的試劑均為ssDNA連接試劑盒中試劑?；旌暇鶆蚝?，60℃反應1小時。反應產物利用微量DNA回收試劑盒按照其操作流程進行產物純化回收，回收產物，得到連接產物(長鏈DNA和環(huán)狀DNA)。通過凝膠電泳，鑒別連接產物片段，結果如圖1所示，圖1中1號泳道為DNA分子量標準，2號為泳道為連接產物，結果顯示，得到了成功連接的連接產物。3)標記生物素與擴增：利用Qiagen公司的商業(yè)化全基因組擴增試劑盒，反應體系如下：組分體積(μl)步驟2)得到的連接產物102×反應緩沖液(2×ReactionBuffer)25Bio-16-dUTP5Replig_Enzyme1H2O9總體積50μl，該反應體系中，除步驟2)得到的連接產物和H2O外的試劑均為全基因組擴增試劑盒中試劑，其中，2×反應緩沖液中含有隨機引物，隨機引物為由A、C、G和T這四個核苷酸隨機組成的長度均為6bp的46條單鏈DNA所形成的混合物，該混合物中所有單鏈DNA的摩爾數均相同。混合均勻后，37度恒溫孵育16小時以上。反應產物采用DNA回收試劑盒，按照試劑盒的標準操作流程，進行DNA純化，得到靶DNA富集探針。采用Nanodrop2000進行定量，并將靶DNA富集探針稀釋到150ng/μl，形成最終的靶DNA富集探針溶液。3、靶DNA富集探針的質量評估實驗重復三次，每次重復試驗的具體步驟如下：1)測試實驗方案：選擇10個人的全基因組文庫樣本，每個樣本均分成兩組，兩組分別通過不同的批次進行驗證實驗。利用靶DNA富集探針捕獲上述10個樣本中的靶DNA：將靶DNA富集探針與DNA全基因組文庫混合，樣本中的線粒體基因就被雜交到探針上，通過生物素和鏈霉親和素磁珠結合吸附，經洗脫處理將非目標區(qū)域的DNA片段去除，從而富集人類線粒體全基因，利用新一代測序儀IlluminaNexseq500進行2X150bp高通量測序。具體步驟如下：a1)制備以下混合體系：取500ngDNA全基因組文庫(20μl,25ng/μl)，10μlBufferBL，5μl步驟2得到的靶DNA富集探針溶液，6μlBlockingOligoMix；a2)將步驟a1)的混合體系PCR儀上：95℃，7min，之后65℃，2min；a3)取65℃預熱的BufferHY23μl加入到步驟a2)反應結束的體系中,然后于PCR儀上65℃雜交22小時。a4)取出MyOnebeads(Invitrogen)，漩渦震蕩使磁珠充分懸浮，短暫離心，使管蓋上的beads離心至管底部。a5)取50μlMyOnebeads到新的1.5ml的離心管中，漩渦震蕩至少5s，使磁珠充分懸浮，短暫離心后放入磁力架上一分鐘。a6)離心管在磁力架上保持靜止(不要旋轉離心管)，小心吸棄上清。a7)取下離心管，加入50μl的1XBindingBuffer(binding緩沖液)，旋窩震蕩至少5s，短暫離心后放入磁力架上靜止一分鐘，小心吸棄上清。a8)重復步驟a6)和a7)兩次(一共三次)。a9)取下離心管，加入100μl2XBindingBuffer(binding緩沖液)，旋窩震蕩至少5s，短暫離心后完全轉入一個新的離心管中。a10)將步驟a3)的產物完全轉入beads的離心管中(總體積約200μl，同時處理多個樣本時，混合后輕彈幾下混勻)，旋窩震蕩至少5s(不用離心)，置于Rotator上室溫旋轉1小時。a11)上述步驟后，利用WB1buffer室溫清洗beads一次，15minutes，然后在WB3buffer中洗3次，65℃，15minutes/次。a12)綁定的DNA利用BufferElute洗脫。洗脫的DNA最終擴增15循環(huán)，利用如下程序:98℃，30s(1cycle)；98℃，25s,65℃，30s,72℃，30s(15cycles)；72℃，5min(1cycle)對洗脫的DNA進行PCR擴增。a13)PCR產物利用SPRIbeads(BeckmanCoulter)根據實驗手冊純化，得到富集線粒體基因片段文庫。其中，各試劑的配方如下：采用Nextseq500(illumina)測序平臺進行測序，驗證其探針的重復性與穩(wěn)定性。2)測序數據的分析：首先，利用Trim-Galore程序過濾低質量的序列；然后，用Trim-Galore中的Cutadapt程序去掉3′端和5′端的通用引物序列，保留讀出質量大于20bp和讀取長度大于80bp的序列。過濾的序列用BWA程序匹配到人類基因組上，然后使用GATK軟件包對質量值進行校準，而后重新匹配到參考序列上。重復讀取用序列比對/匹配工具(SAMtools)3去掉后，只有唯一匹配的讀取序列被用于后續(xù)分析。最后對測序的數據進行質量控制，數據見表1。表1、測序數據表1中參數說明：A.測序數據量是指完成靶DNA捕獲的樣本進行測序時產生的總的測序數據；B.目的堿基數：指探針設計所要覆蓋到的目的區(qū)域的總堿基數；C.覆蓋目的堿基數：指經過富集測序后，能夠成功比對到設計所要覆蓋的堿基區(qū)域的堿基數；D.覆蓋率：覆蓋目的堿基數/目的堿基數；E.捕獲效率(有效數據量)：覆蓋目的堿基數/測序數據量F.測序平均深度：指目的區(qū)域測序時，平均所讀取到的次數；G.平均覆蓋4X比例：指最少讀到4次以上的堿基數占比；H.平均覆蓋10X比例：指最少讀到10次以上的堿基數占比；I.平均覆蓋20X比例：指最少讀到20次以上的堿基數占比；探針質量評估：靶DNA富集探針對人類線粒體基因的捕獲達到了100％覆蓋，其捕獲效率均大于50％，從至少覆蓋到4X、10X和20X的參數來看，均達到100％，探針的整體均一性非常好；通過重復實驗和數據的結果顯示，探針的具有很好的穩(wěn)定性。表明，本發(fā)明的靶DNA富集探針的制備方法可以用于制備靶DNA富集探針，并進一步對靶DNA進行測序。<110>北京邁博恒業(yè)科技有限責任公司<120>靶DNA富集探針的制備方法<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>16569<212>DNA<213>人（Homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(3107)..(3107)<223>n為a,c,g或t<400>1gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacgggagctctccatgcatttggtatttt60cgtctggggggtatgcacgcgatagcattgcgagacgctggagccggagcaccctatgtc120gcagtatctgtctttgattcctgcctcatcctattatttatcgcacctacgttcaatatt180acaggcgaacatacttactaaagtgtgttaattaattaatgcttgtaggacataataata240acaattgaatgtctgcacagccactttccacacagacatcataacaaaaaatttccacca300aaccccccctcccccgcttctggccacagcacttaaacacatctctgccaaaccccaaaa360acaaagaaccctaacaccagcctaaccagatttcaaattttatcttttggcggtatgcac420ttttaacagtcaccccccaactaacacattattttcccctcccactcccatactactaat480ctcatcaatacaacccccgcccatcctacccagcacacacacaccgctgctaaccccata540ccccgaaccaaccaaaccccaaagacaccccccacagtttatgtagcttacctcctcaaa600gcaatacactgaaaatgtttagacgggctcacatcaccccataaacaaataggtttggtc660ctagcctttctattagctcttagtaagattacacatgcaagcatccccgttccagtgagt720tcaccctctaaatcaccacgatcaaaaggaacaagcatcaagcacgcagcaatgcagctc780aaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataa840acgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgc900ggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccc960tccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagac1020tacgaaagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattaga1080taccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaa1140cactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctggcggtgcttcatatccctctagagg1200agcctgttctgtaatcgataaaccccgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatata1260ccgccatcttcagcaaaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaag1320acgttaggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctaccccag1380aaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatttagcagtaaactaag1440agtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcctc1500aagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaagt1560cgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacaca1620aagcacccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaaaccta1680gccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaaccatttacccaaataa1740agtataggcgatagaaattgaaacctggcgcaatagatatagtaccgcaagggaaagatg1800aaaaattataaccaagcataatatagcaaggactaacccctataccttctgcataatgaa1860ttaactagaaataactttgcaaggagagccaaagctaagacccccgaaaccagacgagct1920acctaagaacagctaaaagagcacacccgtctatgtagcaaaatagtgggaagatttata1980ggtagaggcgacaaacctaccgagcctggtgatagctggttgtccaagatagaatcttag2040ttcaactttaaatttgcccacagaaccctctaaatccccttgtaaatttaactgttagtc2100caaagaggaacagctctttggacactaggaaaaaaccttgtagagagagtaaaaaattta2160acacccatagtaggcctaaaagcagccaccaattaagaaagcgttcaagctcaacaccca2220ctacctaaaaaatcccaaacatataactgaactcctcacacccaattggaccaatctatc2280accctatagaagaactaatgttagtataagtaacatgaaaacattctcctccgcataagc2340ctgcgtcagattaaaacactgaactgacaattaacagcccaatatctacaatcaaccaac2400aagtcattattaccctcactgtcaacccaacacaggcatgctcataaggaaaggttaaaa2460aaagtaaaaggaactcggcaaatcttaccccgcctgtttaccaaaaacatcacctctagc2520atcaccagtattagaggcaccgcctgcccagtgacacatgtttaacggccgcggtaccct2580aaccgtgcaaaggtagcataatcacttgttccttaaatagggacctgtatgaatggctcc2640acgagggttcagctgtctcttacttttaaccagtgaaattgacctgcccgtgaagaggcg2700ggcataacacagcaagacgagaagaccctatggagctttaatttattaatgcaaacagta2760cctaacaaacccacaggtcctaaactaccaaacctgcattaaaaatttcggttggggcga2820cctcggagcagaacccaacctccgagcagtacatgctaagacttcaccagtcaaagcgaa2880ctactatactcaattgatccaataacttgaccaacggaacaagttaccctagggataaca2940gcgcaatcctattctagagtccatatcaacaatagggtttacgacctcgatgttggatca3000ggacatcccgatggtgcagccgctattaaaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctac3060gtgatctgagttcagaccggagtaatccaggtcggtttctatctacnttcaaattcctcc3120ctgtacgaaaggacaagagaaataaggcctacttcacaaagcgccttcccccgtaaatga3180tatcatctcaacttagtattatacccacacccacccaagaacagggtttgttaagatggc3240agagcccggtaatcgcataaaacttaaaactttacagtcagaggttcaattcctcttctt3300aacaacatacccatggccaacctcctactcctcattgtacccattctaatcgcaatggca3360ttcctaatgcttaccgaacgaaaaattctaggctatatacaactacgcaaaggccccaac3420gttgtaggcccctacgggctactacaacccttcgctgacgccataaaactcttcaccaaa3480gagcccctaaaacccgccacatctaccatcaccctctacatcaccgccccgaccttagct3540ctcaccatcgctcttctactatgaacccccctccccatacccaaccccctggtcaacctc3600aacctaggcctcctatttattctagccacctctagcctagccgtttactcaatcctctga3660tcagggtgagcatcaaactcaaactacgccctgatcggcgcactgcgagcagtagcccaa3720acaatctcatatgaagtcaccctagccatcattctactatcaacattactaataagtggc3780tcctttaacctctccacccttatcacaacacaagaacacctctgattactcctgccatca3840tgacccttggccataatatgatttatctccacactagcagagaccaaccgaacccccttc3900gaccttgccgaaggggagtccgaactagtctcaggcttcaacatcgaatacgccgcaggc3960cccttcgccctattcttcatagccgaatacacaaacattattataataaacaccctcacc4020actacaatcttcctaggaacaacatatgacgcactctcccctgaactctacacaacatat4080tttgtcaccaagaccctacttctaacctccctgttcttatgaattcgaacagcatacccc4140cgattccgctacgaccaactcatacacctcctatgaaaaaacttcctaccactcacccta4200gcattacttatatgatatgtctccatacccattacaatctccagcattccccctcaaacc4260taagaaatatgtctgataaaagagttactttgatagagtaaataataggagcttaaaccc4320ccttatttctaggactatgagaatcgaacccatccctgagaatccaaaattctccgtgcc4380acctatcacaccccatcctaaagtaaggtcagctaaataagctatcgggcccataccccg4440aaaatgttggttatacccttcccgtactaattaatcccctggcccaacccgtcatctact4500ctaccatctttgcaggcacactcatcacagcgctaagctcgcactgattttttacctgag4560taggcctagaaataaacatgctagcttttattccagttctaaccaaaaaaataaaccctc4620gttccacagaagctgccatcaagtatttcctcacgcaagcaaccgcatccataatccttc4680taatagctatcctcttcaacaatatactctccggacaatgaaccataaccaatactacca4740atcaatactcatcattaataatcataatagctatagcaataaaactaggaatagccccct4800ttcacttctgagtcccagaggttacccaaggcacccctctgacatccggcctgcttcttc4860tcacatgacaaaaactagcccccatctcaatcatataccaaatctctccctcactaaacg4920taagccttctcctcactctctcaatcttatccatcatagcaggcagttgaggtggattaa4980accaaacccagctacgcaaaatcttagcatactcctcaattacccacataggatgaataa5040tagcagttctaccgtacaaccctaacataaccattcttaatttaactatttatattatcc5100taactactaccgcattcctactactcaacttaaactccagcaccacgaccctactactat5160ctcgcacctgaaacaagctaacatgactaacacccttaattccatccaccctcctctccc5220taggaggcctgcccccgctaaccggctttttgcccaaatgggccattatcgaagaattca5280caaaaaacaatagcctcatcatccccaccatcatagccaccatcaccctccttaacctct5340acttctacctacgcctaatctactccacctcaatcacactactccccatatctaacaacg5400taaaaataaaatgacagtttgaacatacaaaacccaccccattcctccccacactcatcg5460cccttaccacgctactcctacctatctccccttttatactaataatcttatagaaattta5520ggttaaatacagaccaagagccttcaaagccctcagtaagttgcaatacttaatttctgt5580aacagctaaggactgcaaaaccccactctgcatcaactgaacgcaaatcagccactttaa5640ttaagctaagcccttactagaccaatgggacttaaacccacaaacacttagttaacagct5700aagcaccctaatcaactggcttcaatctacttctcccgccgccgggaaaaaaggcgggag5760aagccccggcaggtttgaagctgcttcttcgaatttgcaattcaatatgaaaatcacctc5820ggagctggtaaaaagaggcctaacccctgtctttagatttacagtccaatgcttcactca5880gccattttacctcacccccactgatgttcgccgaccgttgactattctctacaaaccaca5940aagacattggaacactatacctattattcggcgcatgagctggagtcctaggcacagctc6000taagcctccttattcgagccgagctgggccagccaggcaaccttctaggtaacgaccaca6060tctacaacgttatcgtcacagcccatgcatttgtaataatcttcttcatagtaataccca6120tcataatcggaggctttggcaactgactagttcccctaataatcggtgcccccgatatgg6180cgtttccccgcataaacaacataagcttctgactcttacctccctctctcctactcctgc6240tcgcatctgctatagtggaggccggagcaggaacaggttgaacagtctaccctcccttag6300cagggaactactcccaccctggagcctccgtagacctaaccatcttctccttacacctag6360caggtgtctcctctatcttaggggccatcaatttcatcacaacaattatcaatataaaac6420cccctgccataacccaataccaaacgcccctcttcgtctgatccgtcctaatcacagcag6480tcctacttctcctatctctcccagtcctagctgctggcatcactatactactaacagacc6540gcaacctcaacaccaccttcttcgaccccgccggaggaggagaccccattctataccaac6600acctattctgatttttcggtcaccctgaagtttatattcttatcctaccaggcttcggaa6660taatctcccatattgtaacttactactccggaaaaaaagaaccatttggatacataggta6720tggtctgagctatgatatcaattggcttcctagggtttatcgtgtgagcacaccatatat6780ttacagtaggaatagacgtagacacacgagcatatttcacctccgctaccataatcatcg6840ctatccccaccggcgtcaaagtatttagctgactcgccacactccacggaagcaatatga6900aatgatctgctgcagtgctctgagccctaggattcatctttcttttcaccgtaggtggcc6960tgactggcattgtattagcaaactcatcactagacatcgtactacacgacacgtactacg7020ttgtagcccacttccactatgtcctatcaataggagctgtatttgccatcataggaggct7080tcattcactgatttcccctattctcaggctacaccctagaccaaacctacgccaaaatcc7140atttcactatcatattcatcggcgtaaatctaactttcttcccacaacactttctcggcc7200tatccggaatgccccgacgttactcggactaccccgatgcatacaccacatgaaacatcc7260tatcatctgtaggctcattcatttctctaacagcagtaatattaataattttcatgattt7320gagaagccttcgcttcgaagcgaaaagtcctaatagtagaagaaccctccataaacctgg7380agtgactatatggatgccccccaccctaccacacattcgaagaacccgtatacataaaat7440ctagacaaaaaaggaaggaatcgaaccccccaaagctggtttcaagccaaccccatggcc7500tccatgactttttcaaaaaggtattagaaaaaccatttcataactttgtcaaagttaaat7560tataggctaaatcctatatatcttaatggcacatgcagcgcaagtaggtctacaagacgc7620tacttcccctatcatagaagagcttatcacctttcatgatcacgccctcataatcatttt7680ccttatctgcttcctagtcctgtatgcccttttcctaacactcacaacaaaactaactaa7740tactaacatctcagacgctcaggaaatagaaaccgtctgaactatcctgcccgccatcat7800cctagtcctcatcgccctcccatccctacgcatcctttacataacagacgaggtcaacga7860tccctcccttaccatcaaatcaattggccaccaatggtactgaacctacgagtacaccga7920ctacggcggactaatcttcaactcctacatacttcccccattattcctagaaccaggcga7980cctgcgactccttgacgttgacaatcgagtagtactcccgattgaagcccccattcgtat8040aataattacatcacaagacgtcttgcactcatgagctgtccccacattaggcttaaaaac8100agatgcaattcccggacgtctaaaccaaaccactttcaccgctacacgaccgggggtata8160ctacggtcaatgctctgaaatctgtggagcaaaccacagtttcatgcccatcgtcctaga8220attaattcccctaaaaatctttgaaatagggcccgtatttaccctatagcaccccctcta8280ccccctctagagcccactgtaaagctaacttagcattaaccttttaagttaaagattaag8340agaaccaacacctctttacagtgaaatgccccaactaaatactaccgtatggcccaccat8400aattacccccatactccttacactattcctcatcacccaactaaaaatattaaacacaaa8460ctaccacctacctccctcaccaaagcccataaaaataaaaaattataacaaaccctgaga8520accaaaatgaacgaaaatctgttcgcttcattcattgcccccacaatcctaggcctaccc8580gccgcagtactgatcattctatttccccctctattgatccccacctccaaatatctcatc8640aacaaccgactaatcaccacccaacaatgactaatcaaactaacctcaaaacaaatgata8700accatacacaacactaaaggacgaacctgatctcttatactagtatccttaatcattttt8760attgccacaactaacctcctcggactcctgcctcactcatttacaccaaccacccaacta8820tctataaacctagccatggccatccccttatgagcgggcacagtgattataggctttcgc8880tctaagattaaaaatgccctagcccacttcttaccacaaggcacacctacaccccttatc8940cccatactagttattatcgaaaccatcagcctactcattcaaccaatagccctggccgta9000cgcctaaccgctaacattactgcaggccacctactcatgcacctaattggaagcgccacc9060ctagcaatatcaaccattaaccttccctctacacttatcatcttcacaattctaattcta9120ctgactatcctagaaatcgctgtcgccttaatccaagcctacgttttcacacttctagta9180agcctctacctgcacgacaacacataatgacccaccaatcacatgcctatcatatagtaa9240aacccagcccatgacccctaacaggggccctctcagccctcctaatgacctccggcctag9300ccatgtgatttcacttccactccataacgctcctcatactaggcctactaaccaacacac9360taaccatataccaatgatggcgcgatgtaacacgagaaagcacataccaaggccaccaca9420caccacctgtccaaaaaggccttcgatacgggataatcctatttattacctcagaagttt9480ttttcttcgcaggatttttctgagccttttaccactccagcctagcccctaccccccaat9540taggagggcactggcccccaacaggcatcaccccgctaaatcccctagaagtcccactcc9600taaacacatccgtattactcgcatcaggagtatcaatcacctgagctcaccatagtctaa9660tagaaaacaaccgaaaccaaataattcaagcactgcttattacaattttactgggtctct9720attttaccctcctacaagcctcagagtacttcgagtctcccttcaccatttccgacggca9780tctacggctcaacattttttgtagccacaggcttccacggacttcacgtcattattggct9840caactttcctcactatctgcttcatccgccaactaatatttcactttacatccaaacatc9900actttggcttcgaagccgccgcctgatactggcattttgtagatgtggtttgactatttc9960tgtatgtctccatctattgatgagggtcttactcttttagtataaatagtaccgttaact10020tccaattaactagttttgacaacattcaaaaaagagtaataaacttcgccttaattttaa10080taatcaacaccctcctagccttactactaataattattacattttgactaccacaactca10140acggctacatagaaaaatccaccccttacgagtgcggcttcgaccctatatcccccgccc10200gcgtccctttctccataaaattcttcttagtagctattaccttcttattatttgatctag10260aaattgccctccttttacccctaccatgagccctacaaacaactaacctgccactaatag10320ttatgtcatccctcttattaatcatcatcctagccctaagtctggcctatgagtgactac10380aaaaaggattagactgaaccgaattggtatatagtttaaacaaaacgaatgatttcgact10440cattaaattatgataatcatatttaccaaatgcccctcatttacataaatattatactag10500catttaccatctcacttctaggaatactagtatatcgctcacacctcatatcctccctac10560tatgcctagaaggaataatactatcgctgttcattatagctactctcataaccctcaaca10620cccactccctcttagccaatattgtgcctattgccatactagtctttgccgcctgcgaag10680cagcggtgggcctagccctactagtctcaatctccaacacatatggcctagactacgtac10740ataacctaaacctactccaatgctaaaactaatcgtcccaacaattatattactaccact10800gacatgactttccaaaaaacacataatttgaatcaacacaaccacccacagcctaattat10860tagcatcatccctctactattttttaaccaaatcaacaacaacctatttagctgttcccc10920aaccttttcctccgaccccctaacaacccccctcctaatactaactacctgactcctacc10980cctcacaatcatggcaagccaacgccacttatccagtgaaccactatcacgaaaaaaact11040ctacctctctatactaatctccctacaaatctccttaattataacattcacagccacaga11100actaatcatattttatatcttcttcgaaaccacacttatccccaccttggctatcatcac11160ccgatgaggcaaccagccagaacgcctgaacgcaggcacatacttcctattctacaccct11220agtaggctcccttcccctactcatcgcactaatttacactcacaacaccctaggctcact11280aaacattctactactcactctcactgcccaagaactatcaaactcctgagccaacaactt11340aatatgactagcttacacaatagcttttatagtaaagatacctctttacggactccactt11400atgactccctaaagcccatgtcgaagcccccatcgctgggtcaatagtacttgccgcagt11460actcttaaaactaggcggctatggtataatacgcctcacactcattctcaaccccctgac11520aaaacacatagcctaccccttccttgtactatccctatgaggcataattataacaagctc11580catctgcctacgacaaacagacctaaaatcgctcattgcatactcttcaatcagccacat11640agccctcgtagtaacagccattctcatccaaaccccctgaagcttcaccggcgcagtcat11700tctcataatcgcccacgggcttacatcctcattactattctgcctagcaaactcaaacta11760cgaacgcactcacagtcgcatcataatcctctctcaaggacttcaaactctactcccact11820aatagctttttgatgacttctagcaagcctcgctaacctcgccttaccccccactattaa11880cctactgggagaactctctgtgctagtaaccacgttctcctgatcaaatatcactctcct11940acttacaggactcaacatactagtcacagccctatactccctctacatatttaccacaac12000acaatggggctcactcacccaccacattaacaacataaaaccctcattcacacgagaaaa12060caccctcatgttcatacacctatcccccattctcctcctatccctcaaccccgacatcat12120taccgggttttcctcttgtaaatatagtttaaccaaaacatcagattgtgaatctgacaa12180cagaggcttacgaccccttatttaccgagaaagctcacaagaactgctaactcatgcccc12240catgtctaacaacatggctttctcaacttttaaaggataacagctatccattggtcttag12300gccccaaaaattttggtgcaactccaaataaaagtaataaccatgcacactactataacc12360accctaaccctgacttccctaattccccccatccttaccaccctcgttaaccctaacaaa12420aaaaactcatacccccattatgtaaaatccattgtcgcatccacctttattatcagtctc12480ttccccacaacaatattcatgtgcctagaccaagaagttattatctcgaactgacactga12540gccacaacccaaacaacccagctctccctaagcttcaaactagactacttctccataata12600ttcatccctgtagcattgttcgttacatggtccatcatagaattctcactgtgatatata12660aactcagacccaaacattaatcagttcttcaaatatctactcatcttcctaattaccata12720ctaatcttagttaccgctaacaacctattccaactgttcatcggctgagagggcgtagga12780attatatccttcttgctcatcagttgatgatacgcccgagcagatgccaacacagcagcc12840attcaagcaatcctatacaaccgtatcggcgatatcggtttcatcctcgccttagcatga12900tttatcctacactccaactcatgagacccacaacaaatagcccttctaaacgctaatcca12960agcctcaccccactactaggcctcctcctagcagcagcaggcaaatcagcccaattaggt13020ctccacccctgactcccctcagccatagaaggccccaccccagtctcagccctactccac13080tcaagcactatagttgtagcaggaatcttcttactcatccgcttccaccccctagcagaa13140aatagcccactaatccaaactctaacactatgcttaggcgctatcaccactctgttcgca13200gcagtctgcgcccttacacaaaatgacatcaaaaaaatcgtagccttctccacttcaagt13260caactaggactcataatagttacaatcggcatcaaccaaccacacctagcattcctgcac13320atctgtacccacgccttcttcaaagccatactatttatgtgctccgggtccatcatccac13380aaccttaacaatgaacaagatattcgaaaaataggaggactactcaaaaccatacctctc13440acttcaacctccctcaccattggcagcctagcattagcaggaatacctttcctcacaggt13500ttctactccaaagaccacatcatcgaaaccgcaaacatatcatacacaaacgcctgagcc13560ctatctattactctcatcgctacctccctgacaagcgcctatagcactcgaataattctt13620ctcaccctaacaggtcaacctcgcttccccacccttactaacattaacgaaaataacccc13680accctactaaaccccattaaacgcctggcagccggaagcctattcgcaggatttctcatt13740actaacaacatttcccccgcatcccccttccaaacaacaatccccctctacctaaaactc13800acagccctcgctgtcactttcctaggacttctaacagccctagacctcaactacctaacc13860aacaaacttaaaataaaatccccactatgcacattttatttctccaacatactcggattc13920taccctagcatcacacaccgcacaatcccctatctaggccttcttacgagccaaaacctg13980cccctactcctcctagacctaacctgactagaaaagctattacctaaaacaatttcacag14040caccaaatctccacctccatcatcacctcaacccaaaaaggcataattaaactttacttc14100ctctctttcttcttcccactcatcctaaccctactcctaatcacataacctattcccccg14160agcaatctcaattacaatatatacaccaacaaacaatgttcaaccagtaactactactaa14220tcaacgcccataatcatacaaagcccccgcaccaataggatcctcccgaatcaaccctga14280cccctctccttcataaattattcagcttcctacactattaaagtttaccacaaccaccac14340cccatcatactctttcacccacagcaccaatcctacctccatcgctaaccccactaaaac14400actcaccaagacctcaacccctgacccccatgcctcaggatactcctcaatagccatcgc14460tgtagtatatccaaagacaaccatcattccccctaaataaattaaaaaaactattaaacc14520catataacctcccccaaaattcagaataataacacacccgaccacaccgctaacaatcaa14580tactaaacccccataaataggagaaggcttagaagaaaaccccacaaaccccattactaa14640acccacactcaacagaaacaaagcatacatcattattctcgcacggactacaaccacgac14700caatgatatgaaaaaccatcgttgtatttcaactacaagaacaccaatgaccccaatacg14760caaaactaaccccctaataaaattaattaaccactcattcatcgacctccccaccccatc14820caacatctccgcatgatgaaacttcggctcactccttggcgcctgcctgatcctccaaat14880caccacaggactattcctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatc14940aatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaa15000tggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacgg15060atcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagc15120aacagccttcataggctatgtcctcccgtgaggccaaatatcattctgaggggccacagt15180aattacaaacttactatccgccatcccatacattgggacagacctagttcaatgaatctg15240aggaggctactcagtagacagtcccaccctcacacgattctttacctttcacttcatctt15300gcccttcattattgcagccctagcaacactccacctcctattcttgcacgaaacgggatc15360aaacaaccccctaggaatcacctcccattccgataaaatcaccttccacccttactacac15420aatcaaagacgccctcggcttacttctcttccttctctccttaatgacattaacactatt15480ctcaccagacctcctaggcgacccagacaattataccctagccaaccccttaaacacccc15540tccccacatcaagcccgaatgatatttcctattcgcctacacaattctccgatccgtccc15600taacaaactaggaggcgtccttgccctattactatccatcctcatcctagcaataatccc15660catcctccatatatccaaacaacaaagcataatatttcgcccactaagccaatcacttta15720ttgactcctagccgcagacctcctcattctaacctgaatcggaggacaaccagtaagcta15780cccttttaccatcattggacaagtagcatccgtactatacttcacaacaatcctaatcct15840aataccaactatctccctaattgaaaacaaaatactcaaatgggcctgtccttgtagtat15900aaactaatacaccagtcttgtaaaccggagatgaaaacctttttccaaggacaaatcaga15960gaaaaagtctttaactccaccattagcacccaaagctaagattctaatttaaactattct16020ctgttctttcatggggaagcagatttgggtaccacccaagtattgactcacccatcaaca16080accgctatgtatttcgtacattactgccagccaccatgaatattgtacggtaccataaat16140acttgaccacctgtagtacataaaaacccaatccacatcaaaaccccctccccatgctta16200caagcaagtacagcaatcaaccctcaactatcacacatcaactgcaactccaaagccacc16260cctcacccactaggataccaacaaacctacccacccttaacagtacatagtacataaagc16320catttaccgtacatagcacattacagtcaaatcccttctcgtccccatggatgacccccc16380tcagataggggtcccttgaccaccatcctccgtgaaatcaatatcccgcacaagagtgct16440actctcctcgctccgggcccataacacttgggggtagctaaagtgaactgtatccgacat16500ctggttcctacttcagggtcataaagcctaaatagcccacacgttccccttaaataagac16560atcacgatg16569當前第1頁1 2 3