本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于核酸和鉑納米材料的自組裝體系檢測核酸濃度的方法。

背景技術(shù)：

核酸在生物的生長、發(fā)育和繁殖等正常生命活動中起著非常重要的作用。其含量的多少或序列的突變都可能導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。人類基因組計(jì)劃完成后，分析研究特定序列核酸和基因突變的檢測研究，尤其是研究基因突變與人類重大疾病之間的關(guān)系變得越來越重要。目前，大量的核酸擴(kuò)增技術(shù)的相繼報(bào)道，例如聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、依賴于核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling circle amplification,RCA)等為核酸靈敏檢測提供有力的手段。然而，這些擴(kuò)增技術(shù)往往依賴特定的溫度以及限制其他反應(yīng)條件來保證擴(kuò)增有效運(yùn)行。這也給實(shí)際操作帶來很大的麻煩，同時(shí)增加研究的成本支出。然而，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)作為一種無酶等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該反應(yīng)依賴引發(fā)探針、兩種帶有粘性末端的發(fā)夾環(huán)單體探針鏈。若無引發(fā)序列存在時(shí)，二者可穩(wěn)定存在于溶液中。當(dāng)經(jīng)引發(fā)探針觸發(fā)后，發(fā)卡型結(jié)構(gòu)依次打開形成具有多個(gè)重復(fù)單元的交替共聚物。由于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不需要酶的加入，以核苷酸鏈作為引發(fā)劑誘導(dǎo)鏈聚合，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，可適用于其他傳感器的信號放大。

目前，眾多納米材料如金屬氧化物、金屬納米顆粒、碳基納米材料(石墨烯、碳量子點(diǎn)、碳納米管等)和這些材料相互結(jié)合形成的復(fù)合型納米材料等已被證實(shí)具有優(yōu)越的類過氧化物酶活性，并且被廣泛用于各種生物傳感策略中。同時(shí)，由于納米人工酶具有納米材料和天然酶的雙重優(yōu)越特性，在發(fā)展納米酶來替代傳統(tǒng)的蛋白酶生物分析研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，核酸和納米材料之間的自組裝體系可以完美的將納米材料自身良好的光學(xué)、電磁學(xué)、以及催化性能與核酸有序組裝特性和序列特異性識別能力相互融合，從而在分析檢測中獲得優(yōu)越的信號識別和信號放大效果。

中國專利CN 104007152A公開了基于鉑納米粒子催化電化學(xué)循環(huán)信號放大技術(shù)測定DNA的電化學(xué)傳感器和測定DNA的方法，其公開了DNA可與鉑納米粒子發(fā)生自組裝反應(yīng)，鉑納米粒子的制備方法是采用檸檬酸鈉和HPtCl₆制備方法，但該過程需制備電化學(xué)傳感器，制備時(shí)間為24h，存在檢測時(shí)間長的缺點(diǎn)。

中國專利CN103820541A公開了一種基于指數(shù)發(fā)卡組裝和比色快速檢測核酸的方法，且具體公開了目標(biāo)核酸分子與修飾了DNA的納米金通過剪輯互補(bǔ)配對使目標(biāo)核酸分子的一端固定在納米金上，固定在納米金上的目標(biāo)核酸分子引發(fā)發(fā)卡DNA發(fā)生自組裝反應(yīng)，在上述體系中加入二價(jià)或一價(jià)陽離子鹽，可使納米金產(chǎn)生聚沉，顏色從紅色到藍(lán)色變化，加入的目標(biāo)核酸分子越多，顏色越紅，加入的目標(biāo)核酸分子越少，顏色越藍(lán)，實(shí)現(xiàn)了肉眼可視化檢測，同時(shí)可利用紫外可見吸收裝置對其進(jìn)行紫外吸收檢測，檢測效果及準(zhǔn)確度均較高。但目前還沒有關(guān)于基于核酸和鉑納米材料的自組裝體系與顯色反應(yīng)結(jié)合的核酸濃度的檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種基于核酸和鉑納米材料的自組裝體系檢測核酸濃度的方法，該方法結(jié)合顯色底物的顯色反應(yīng)，能快速實(shí)現(xiàn)核酸濃度的可視化檢測。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于核酸和鉑納米材料的自組裝體系檢測核酸濃度的方法，包括如下步驟：引發(fā)核酸探針之間的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，留取雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的上清液；在上清液中，制備核酸鉑納米復(fù)合材料；制備顯色底物；把顯色底物引入核酸鉑納米復(fù)合材料進(jìn)行顯色反應(yīng)以進(jìn)行核酸濃度的檢測。

優(yōu)選的，所述雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括以下步驟：

步驟1、分別配制預(yù)定濃度的核酸探針發(fā)夾環(huán)H1、發(fā)夾環(huán)H2、目標(biāo)核酸和末端修飾生物素的探針鏈，分別在95度水浴中保持5min，隨后再緩慢冷卻至室溫；

步驟2、目標(biāo)核酸和探針鏈在Tris-HCl反應(yīng)液中形成部分互補(bǔ)的雜交體系，于37度下反應(yīng)1h；

步驟3、將發(fā)夾環(huán)H1、發(fā)夾環(huán)H2溶液加入到反應(yīng)液中，水浴37度下雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1.5h；

步驟4、將鏈霉親和素修飾的磁珠加入到反應(yīng)液中，37度水浴下反應(yīng)1h；

步驟5、在磁鐵吸附下從反應(yīng)溶液中移除磁珠，并保留反應(yīng)液的上清液作為制備核酸鉑納米復(fù)合材料的反應(yīng)液。

優(yōu)選的，在所述雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟2中，Tris-HCl反應(yīng)液含有20mM Tris-HCl、300mM NaCl、50mM MgCl₂·6H₂O，所述Tris-HCl反應(yīng)液的PH值為7.5。

優(yōu)選的，所述核酸探針發(fā)夾環(huán)H1、發(fā)夾環(huán)H2的濃度均為0.06uM，所述目標(biāo)核酸的濃度為0.25～8uM，所述末端修飾生物素的探針鏈的濃度為0.01uM。

優(yōu)選的，所述核酸鉑納米復(fù)合材料的制備包括如下步驟：

步驟一、將上清液加入到離心管中，滴加鉑前驅(qū)體物質(zhì)，將離心管離心振蕩5s,并室溫下培育2min；

步驟二、將新鮮配置的硼氫化鈉溶液快速滴加到離心管中，離心振蕩5s，并在室溫下靜置反應(yīng)4-5min，獲得核酸鉑納米復(fù)合材料。

優(yōu)選的，所述鉑前驅(qū)體物質(zhì)是K₂PtCl₄，其濃度為80uM。

優(yōu)選的，所述顯色底物為TMB/H₂O₂溶液，其組成如下：20mM MES-HAc(140mM NaAc，PH4.0)溶液中含有2％v/vTMB(30mM)和2％/v H₂O₂(30wt％)。

優(yōu)選的，所述顯色反應(yīng)的步驟如下：在核酸鉑納米復(fù)合材料中引入TMB/H₂O₂溶液，室溫下反應(yīng)4-5min，隨后加入濃硫酸終止反應(yīng)，顯色底物從無色到藍(lán)色發(fā)生變化，顏色的深度與目標(biāo)核酸的濃度成反比。

優(yōu)選的，所述濃硫酸的濃度為3～5M，更優(yōu)選4M。

優(yōu)選的，在顯色反應(yīng)終止后加入水溶液并置于紫外儀器上檢測紫外吸光度值，間接檢測溶液中目標(biāo)核酸的濃度。

優(yōu)選的，所述紫外吸光度值與目標(biāo)核酸的濃度對數(shù)值之間為線性關(guān)系。

優(yōu)選的，所述紫外儀器能夠?qū)崿F(xiàn)對0.228uM目標(biāo)核酸濃度的檢測。

在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)核酸作為模板元件原位合成鉑納米材料時(shí)，該非共價(jià)自組裝復(fù)合物體系幾乎沒有任何類過氧化物酶活性。另外，當(dāng)體系中不存在核酸時(shí)最終制備得到的鉑納米材料則表現(xiàn)了優(yōu)越的酶催化活性。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案，本發(fā)明采用如下機(jī)理：大多數(shù)與鉑納米相關(guān)的材料都具備優(yōu)異類似過氧化氫酶活性，可以快速催化TMB/H₂O₂底物生成藍(lán)色可見的沉淀物。大分子核酸可以通過非公價(jià)相互作用快速與鉑前驅(qū)體分子(K₂PtCl₄)結(jié)合，當(dāng)強(qiáng)還原劑硼氫化鈉加入后會催化這些鉑前驅(qū)體分子以核酸分子為模板快速生成核酸鉑納米復(fù)合材料(DNA-Pt hybrid naomaterials)。由于核酸大分子的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致核酸鉑納米復(fù)合材料表面活性位點(diǎn)被大量包覆，使得核酸鉑納米復(fù)合材料的酶催化活性被有效抑制。失去酶活性的核酸鉑納米復(fù)合材料不能夠有效地催化TMB/過氧化氫H₂O₂底物溶液產(chǎn)生顏色響應(yīng)。

本發(fā)明所述的檢測方法主要通過目標(biāo)核酸部分序列驅(qū)動發(fā)夾環(huán)核酸探針之間發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)，同時(shí)靶核酸鏈又可以連接末端修飾生物素的探針鏈，最終形成的長鏈體系可通過鏈霉親和素修飾的磁珠進(jìn)一步移除。因而，溶液中不同濃度的目標(biāo)核酸含量直接導(dǎo)致最終體系中核酸的總體含量有所區(qū)別，繼而影響到核酸鉑納米復(fù)合材料的酶活性，最終通過催化TMB/H₂O₂反應(yīng)來比色檢測目標(biāo)核酸。

本發(fā)明構(gòu)建了一種利用目標(biāo)核酸驅(qū)動核酸探針組裝，并繼而在磁珠介導(dǎo)地分離作用下將長鏈核酸組裝體系移除。由于核酸的存在會嚴(yán)重抑制最終形成的核酸鉑納米復(fù)合材料的酶催化活性，失去酶活性的核酸鉑納米復(fù)合材料不能夠有效地催化TMB/H₂O₂顯色底物溶液產(chǎn)生相應(yīng)的顏色響應(yīng)。而體系中核酸的存在量取決于目標(biāo)核酸的加入量，故可以通過最終比色結(jié)果來間接檢測溶液中目標(biāo)核酸目標(biāo)的含量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明所述的檢測核酸濃度的方法，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的比色檢測，該方法克服了有酶反應(yīng)的缺點(diǎn)，縮短了反應(yīng)時(shí)間，通過肉眼觀測可直接進(jìn)行核酸濃度的定性檢測，大大縮短了檢測時(shí)間，同時(shí)可采用紫外吸光度的測量，進(jìn)行核酸濃度的精確檢測，提高了檢測靈敏度，本發(fā)明所述的比色檢測方法對于目標(biāo)核酸具有很好的選擇性和特異性，設(shè)計(jì)和操作過程都十分簡便、成本低廉、又兼顧較好的靈敏度，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為目標(biāo)核酸的比色檢測的原理示意圖。

圖2為本發(fā)明所述檢測核酸濃度的方法對不同濃度目標(biāo)核酸檢測的結(jié)果示意圖。

圖3為本發(fā)明檢測核酸濃度的方法對目標(biāo)核酸的選擇性的結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明采用的目標(biāo)核酸選取于阿茲海默疾病(Alzheimer’s disease(AD))相關(guān)聯(lián)的致病基因部分序列片段，所有實(shí)驗(yàn)中采用的核酸序列如下：

實(shí)施例1

驗(yàn)證本發(fā)明所述的檢測核酸濃度的方法的可行性及原理的準(zhǔn)確性。

如圖1所示，本發(fā)明進(jìn)行了兩組實(shí)驗(yàn)，未添加目標(biāo)核酸和添加目標(biāo)核酸。

如圖1左側(cè)所示的未添加目標(biāo)核酸實(shí)驗(yàn)中，在反應(yīng)液中添加生物素標(biāo)記的核酸探針，不引入目標(biāo)核酸，然后加入發(fā)夾環(huán)H1和發(fā)夾環(huán)H2，核酸探針和發(fā)夾環(huán)在未引入目標(biāo)核酸的情況下，即無引發(fā)序列存在，二者穩(wěn)定地存在于反應(yīng)液中；將鏈霉親和素修飾的磁珠加入到反應(yīng)液，以結(jié)合生物素標(biāo)記的核酸探針，并采用磁性分離將磁珠從反應(yīng)液中分離出來，保留上清液，發(fā)夾環(huán)H1和發(fā)夾環(huán)H2均存在于上清液中；隨后在上清液中進(jìn)行核酸鉑納米復(fù)合材料的制備，鉑納米材料分別與發(fā)夾環(huán)H1、發(fā)夾環(huán)H2自組裝反應(yīng)生成核酸鉑納米復(fù)合材料，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行吸光度檢測，發(fā)現(xiàn)鉑納米材料的酶催化活性受到抑制。

如圖2右側(cè)所示的添加目標(biāo)核酸實(shí)驗(yàn)中，在反應(yīng)液中添加生物素標(biāo)記的核酸探針，引入目標(biāo)核酸，預(yù)先與添加生物素標(biāo)記的核酸探針形成部分互補(bǔ)的雜交體系，然后加入發(fā)夾環(huán)H1和發(fā)夾環(huán)H2，進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成長鏈核酸組裝體系；將鏈霉親和素修飾的磁珠加入到反應(yīng)液，以結(jié)合生物素標(biāo)記的核酸探針，并采用磁性分離將磁珠從反應(yīng)液中分離出來，保留上清液，上清液中不存在任何核酸分子；隨后在反應(yīng)液中進(jìn)行鉑納米材料的制備，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行吸光度檢測，發(fā)現(xiàn)鉑納米材料的酶催化活性沒有受到抑制。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，由于核酸大分子的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致核酸鉑納米復(fù)合材料表面活性位點(diǎn)被大量包覆，使得核酸鉑納米復(fù)合材料的酶催化活性被有效抑制。

實(shí)施例2

研究本發(fā)明所述的檢測核酸濃度的方法對相關(guān)目標(biāo)核的檢測靈敏度和檢測限。

進(jìn)行6組實(shí)驗(yàn)，在所述6組實(shí)驗(yàn)中，核酸目標(biāo)鏈的濃度分別為0.25nM、0.5nM、1nM、2nM、4nM和8nM；

所述實(shí)驗(yàn)方法的具體步驟如下：

a.分別將核酸探針發(fā)夾環(huán)H1、發(fā)夾環(huán)H2、目標(biāo)核酸和末端修飾生物素的探針鏈配置到特定濃度，然后在95度水浴中保持5min，隨后再緩慢冷卻至室溫；

b.不同濃度的目標(biāo)核酸分別預(yù)先和濃度為0.01uM的末端修飾生物素的探針鏈在Tris-HCl反應(yīng)液(20mM Tris-HCl,300mM NaCl,50mM MgCl2·6H2O,PH 7.5)中形成部分互補(bǔ)的雜交體系，37度下反應(yīng)1h；

c.隨后將濃度均為0.06uM的發(fā)夾環(huán)H1、發(fā)夾環(huán)H2溶液分別加入到步驟b的反應(yīng)溶中，在水浴37度下雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1.5h來促進(jìn)核酸探針鏈之間組裝；

d.最后將8ul鏈霉親和素修飾的磁珠(20mg/ml,500nM)加入到上述的反應(yīng)液中37度水浴下反應(yīng)1h，由于末端修飾生物素的Capture probes可以迅速與鏈霉親和素修飾的磁珠結(jié)合，繼而整個(gè)長鏈核酸組裝體系就會有效地結(jié)合到磁珠表面，最終在磁鐵吸附下從反應(yīng)溶液中移除，并保留上清液50ul作為鉑納米材料制備的反應(yīng)液；

e.將不同濃度的目標(biāo)核酸對應(yīng)的上清液(50ul)分別加入到500ul的離心管中，然后滴加2.5ul鉑前驅(qū)體物質(zhì)(80uM K₂PtCl₄)到這些離心管中，渦旋離心振蕩5s，并室溫下培育2min左右；

f.緊接著10ul新鮮配制的硼氫化鈉溶液(25mM)快速滴加到上述離心管中，渦旋離心振蕩5s，并在室溫下靜置反應(yīng)4-5min，獲得核酸鉑納米復(fù)合材料，不需要任何離心清洗操作；

g.配置3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)/過氧化氫(H₂O₂)顯色底物溶液，其組成如下：20mM MES-HAc(140mM NaAc PH4.0)溶液中含有2％v/v TMB(30mM)和2％v/v H₂O₂(30wt％)。TMB由無水乙醇溶解，TMB和H₂O₂溶液均需保證現(xiàn)配現(xiàn)用；

h.將上述制備得到的核酸鉑納米材料引入170ul TMB/H₂O₂顯色底物溶液中，室溫下反應(yīng)4-5min，隨后加入200ul濃硫酸(4M)終止反應(yīng)，顯色底物從無色到藍(lán)色發(fā)生變化，顏色的深度與目標(biāo)核酸的濃度成反比，根據(jù)顏色直接進(jìn)行核酸濃度的定性檢測；

i.在顯色反應(yīng)終止后加入400ul水溶液并置于紫外儀器上檢測紫外吸光度值，間接檢測溶液中目標(biāo)核酸的濃度。

按照上述操作步驟考察該檢測核酸濃度的方法對目標(biāo)核酸檢測的靈敏度。最終結(jié)果如圖2所示，隨著目標(biāo)核酸濃度的增大，體系在450nm處的吸光度也不斷增強(qiáng)。以目標(biāo)核酸的濃度對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，體系中含目標(biāo)核酸時(shí)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)作圖，可得出在0.25nM到8nM范圍內(nèi)體系的紫外吸光度與目標(biāo)核酸濃度的對數(shù)值之間有很好的線性關(guān)系，線性方程為：ΔA＝0.04699+0.0047log₂C(R²＝0.998)。根據(jù)三倍信噪比計(jì)算出檢測限是0.228nM。

實(shí)施例3

驗(yàn)證本發(fā)明所述的檢測核酸濃度的方法對目標(biāo)核酸的選擇性和特異性。

為了驗(yàn)證該檢測方法的特異性，選取了其他體系作為對照項(xiàng)，分別為空白對照組、完全錯(cuò)配的核酸序列組、部分核酸序列錯(cuò)配組。按照實(shí)施例2的操作步驟，最終的檢測分析結(jié)果如圖3所示，體系含有目標(biāo)核酸的最終吸光度值較空白對照組顯著增強(qiáng)，而含有2個(gè)堿基錯(cuò)配的樣品和完全錯(cuò)配樣品的吸光度結(jié)果較空白對照組都比較接近。從以上分析結(jié)果可以看出，說明該檢測方法對于目標(biāo)核酸具有較好的選擇性。

由上述實(shí)施例可知，本發(fā)明所述的檢測核酸濃度的方法對于目標(biāo)核酸具有很好的選擇性和特異性，設(shè)計(jì)和操作過程都十分簡便、成本低廉、又兼顧較好的靈敏度，因而具有良好的應(yīng)用前景，可廣泛應(yīng)用于臨床檢測、食品安全檢測和環(huán)境檢測等領(lǐng)域。

以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

<110> 復(fù)旦大學(xué)；上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司

<120> 一種基于核酸和鉑納米材料的自組裝體系檢測核酸濃度的方法

<160> 6

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA探針鏈

<400> 1

ttttacgttg gggcctttgc gtagttgtac 30

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核酸探針發(fā)夾環(huán)H1

<400> 2

tagcctagaa tttttcgttc ggtaatcgga tttaccgaac gaaaaattct 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核酸探針發(fā)夾環(huán)H2

<400> 3

ttaccgaacg aaaaattcta ggctaagaat ttttcgttcg gtaaatccga 50

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 阿茲海默疾?。ˋlzheimer’s disease）相關(guān)聯(lián)的致病基因部分序列片段

<220>

<223> 目標(biāo)核酸

<400> 4

ttaccgaacg aaaaattcta ggctatgtac aactacgcaa aggccccaac gt 52

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全錯(cuò)配核酸鏈

<400> 5

ttggctttca gttatatgga tgatgtggta 30

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 部分錯(cuò)配核酸鏈

<400> 6

ttaccgaacg aaaaattcta ttctatgtac aactacgcaa aggccccaac gt 52