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MSH2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和檢測(cè)方法與流程

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MSH2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和檢測(cè)方法與流程
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域
,是一種檢測(cè)MSH2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的引物和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)
:錯(cuò)配修復(fù)基因是生物進(jìn)化過(guò)程中的保守基因,具有修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配,增強(qiáng)DNA復(fù)制忠實(shí)性,維持基因組穩(wěn)定性,降低自發(fā)性突變的功能。hMSH2(humanMutShomolog2)是第一個(gè)被分離的人類MMR基因,該基因與細(xì)菌的MutS同源,位于人類染色體2p1-p22,其基因組DNA全長(zhǎng)約73kb(不包括啟動(dòng)子),含16個(gè)外顯子,其中第7個(gè)外顯子最長(zhǎng),有279bp;11外顯子最短,僅98bp,cDNA全長(zhǎng)3111bp,含2727bp的開放閱讀框架,翻譯后編碼一種由909個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),與酵母蛋白的相應(yīng)區(qū)域有85%的一致性。hMSH2是最重要的錯(cuò)配修復(fù)基因,它對(duì)維持基因組的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用,該基因異常將導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定,從而引發(fā)細(xì)胞癌變。研究報(bào)道血清樣本中檢測(cè)MSH2基因甲基化有助于多種腫瘤的早期診斷。檢測(cè)胰腺癌中hMSH2蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腫瘤的惡性分化程度有相關(guān)性。hMSH2的檢測(cè)對(duì)了解遺傳穩(wěn)定性,以及惡性黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展有重要意義,而hMSH2基因的內(nèi)部和外部發(fā)生改變均會(huì)導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性和乳腺癌的發(fā)生。應(yīng)用多態(tài)性分析法分析hMsHZ蛋白的表達(dá),對(duì)估計(jì)腦膠質(zhì)瘤患者的存活期有一定意義,且其胞核hMSH2的表達(dá)檢測(cè)則是估計(jì)其預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。另外,人們已認(rèn)識(shí)到lynch(林奇)綜合征本質(zhì)在于MLH1、MSH2、MSH6、PMS2四個(gè)基因的遺傳缺陷,基因診斷已成為林奇綜合征的“金標(biāo)準(zhǔn)”。國(guó)際上由多家癌癥中心組成的兩大癌癥診斷治療權(quán)威機(jī)構(gòu)NCCN(NationalComprehensiveCancerNetwork,美國(guó)國(guó)家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò))、ESMO(TheEuropeanSocietyforMedicalOncology,歐洲臨床腫瘤學(xué)會(huì))制定出林奇綜合征基因的診斷指南。該指南強(qiáng)調(diào)所有70歲以下新診斷的大腸癌患者都要納入林奇綜合征基因篩查,并經(jīng)過(guò)免疫組化、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)初篩,再進(jìn)行甲基化檢測(cè),仍不能排除基因缺陷的,就進(jìn)入MLH1、MSH2、MSH6、PMS2基因篩查。子宮頸癌確卻的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確,一般認(rèn)為有兩種途徑,其一為經(jīng)典的腫瘤抑制基因雜合性缺失途徑;其二為錯(cuò)配修復(fù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑。大量研究證實(shí)了子宮頸癌的發(fā)生和MSH2基因密切相關(guān)。研究表明了,子宮頸癌組織中,MSH2基因呈過(guò)度甲基化。目前對(duì)于MSH2啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的常規(guī)方法有:甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM),甲基化特異性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR擴(kuò)增檢測(cè)來(lái)判斷樣本是否存在甲基化,該法實(shí)用且普遍,但假陽(yáng)性較高,穩(wěn)定性較差;亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序因其操作繁瑣,因此不適合大批量檢測(cè);MS-HRM是通過(guò)將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異,從而判斷是否存在甲基化,這種方法對(duì)儀器的要求頗高,需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀,同時(shí)該法只能分析檢測(cè)片段整體甲基化狀態(tài),而不能明確每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài);MS-PCR是基于PCR開發(fā)的技術(shù),主要是在檢測(cè)中加入了TaqMan探針,從而保證了較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,但其對(duì)于多個(gè)甲基化位點(diǎn)的檢測(cè),也只能做到整體化分析,同時(shí)探針成本較高,因此該法較適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:設(shè)計(jì)用于檢測(cè)MSH2基因啟動(dòng)子甲基化的引物,包括一對(duì)特異性擴(kuò)增兼并引物SEQNO1和SEQNO2,其序列為:SEQNO1:5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’;SEQNO2:5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。R堿基代表A或G,Y堿基代表C或T,所述SEQNO1和SEQNO2同時(shí)也為雙向測(cè)序引物。本發(fā)明提供的另一個(gè)技術(shù)方案是:用于檢測(cè)MSH2基因啟動(dòng)子甲基化的方法,包括:(1)提取樣本中的DNA;(2)將步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理;(3)以步驟(2)中的DNA作為模板,使用SEQNO1和SEQNO2擴(kuò)增MSH2基因片段,獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;(4)對(duì)步驟(3)中獲得的產(chǎn)物測(cè)序;(5)根據(jù)步驟(4)的測(cè)序結(jié)果,得到序列CG位點(diǎn)的甲基化結(jié)果;其中,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:第一階段,92-97℃預(yù)變性5-15min;第二階段,變性溫度92-97℃30sec,退火溫度62-66℃90sec,延伸溫度72℃30sec,循環(huán)12-18次,每循環(huán)一次,所述退火溫度降低0.5℃;第三階段,變性溫度92-97℃30sec,退火溫度53-57℃30sec,延伸溫度72℃30sec,循環(huán)24-34次;第四階段,72℃10min;第五階段,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。所述的測(cè)序?yàn)镾anger測(cè)序,測(cè)序引物為:SEQNO1:5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’;SEQNO2:5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。該方法檢測(cè)的樣本為石蠟切片樣本、全血樣本、新鮮組織樣本或細(xì)胞系樣本。更進(jìn)一步地,本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)MSH2基因啟動(dòng)子甲基化的試劑盒的技術(shù)方案,包括亞硫酸鹽修飾、PCR擴(kuò)增試劑以及Sanger測(cè)序試劑、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品,其中:(1)亞硫酸鹽處理試劑包括:BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer;(2)PCR擴(kuò)增試劑:10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5U/ulTaq酶、10uM擴(kuò)增引物(SEQNO1、SEQNO2)以及滅菌水;(3)酶純化試劑:EXOI、CIP;(4)測(cè)序試劑:BigdyeTerminatorV3.1、無(wú)水乙醇、EDTA、及測(cè)序引物(SEQNO1、SEQNO2)。其中,陽(yáng)性對(duì)照品為經(jīng)過(guò)所有胞嘧啶甲基化修飾的全甲基化正常人群血液基因組DNA,陰性對(duì)照品為正常人群血液基因組DNA。本發(fā)明采用Touch-downPCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序法MSH2啟動(dòng)子甲基化檢測(cè),針對(duì)石蠟切片DNA片段化嚴(yán)重,在造成亞硫酸氫鹽處理飽和的情況下,仍出現(xiàn)的有效模板濃度很低的情況,Touch-downPCR擴(kuò)增可確保正、反向擴(kuò)增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補(bǔ)的序列之間,當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時(shí),特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在此時(shí)已經(jīng)有一個(gè)幾何數(shù)的起始優(yōu)勢(shì),豐度較高,在剩余的擴(kuò)增反應(yīng)中,特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng),但是因非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較低,特異性擴(kuò)增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴(kuò)增,從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而Sanger測(cè)序法是檢測(cè)基因甲基化的金標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高,并且很大程度上地節(jié)省了檢測(cè)成本。由于DNA序列在經(jīng)亞硫酸鹽處理后,其部分C堿基會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)門,導(dǎo)致序列區(qū)域內(nèi)CG含量和TM值發(fā)生較大程度的變異,進(jìn)而影響常規(guī)引物設(shè)計(jì)軟件在其序列上獲得理想的引物序列。因此,本發(fā)明中PCR采用的擴(kuò)增引物以及測(cè)序引物均為自行設(shè)計(jì),其中測(cè)序引物使用兼并堿基,從而使得陰性、陽(yáng)性都可在同一體系擴(kuò)增。同時(shí),擴(kuò)增引物的使用比例經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn),相對(duì)于其它文獻(xiàn)和軟件設(shè)計(jì)的引物具備了更加理想的擴(kuò)增效率。因此,本發(fā)明的檢測(cè)方法具備了檢測(cè)出率高,檢測(cè)穩(wěn)定性好,準(zhǔn)確度高以及低污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)結(jié)果將有助于預(yù)見(jiàn)相關(guān)腫瘤疾病的早期,同時(shí)具有潛在的指導(dǎo)臨床醫(yī)生個(gè)體化治療的作用。附圖說(shuō)明圖1和圖2是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)序列,圖1為陰性標(biāo)準(zhǔn)序列,圖2為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)序列。圖3是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的實(shí)施例中陰性檢測(cè)的結(jié)果圖;圖4是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的實(shí)施例中陽(yáng)性結(jié)果的圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是,實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法,通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如,奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版,或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實(shí)施例1MSH2基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化檢測(cè)試劑盒包括一對(duì)特異性兼并引物SEQNO1和SEQNO2,同時(shí),此引物為測(cè)序引物,其堿基序列如下所示:SEQNO1:5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’;SEQNO2:5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’;MSH2基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化檢測(cè)試劑盒還包括如下試劑:(1)亞硫酸鹽處理試劑:BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer;(2)PCR擴(kuò)增試劑:10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5U/ulTaq酶、10uM擴(kuò)增引物(SEQNO1、SEQNO2)以及滅菌水;(3)酶純化試劑:EXOI,CIP;(4)測(cè)序試劑:BigdyeTerminatorV3.1,無(wú)水乙醇,EDTA,及測(cè)序引物(SEQNO1,SEQNO2)。(5)陽(yáng)性質(zhì)控品:已確定的MSH2基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化的DNA。陰性質(zhì)控品:已確定的MSH2基因啟動(dòng)子區(qū)CG島無(wú)甲基化的DNA??瞻讓?duì)照品:滅菌水。實(shí)施例2DNA提取試劑和方式。取石蠟切片(5-10μm厚,1×1cm2大小)5-8張,將石蠟包埋組織收集到1.5mL離心管內(nèi),短暫離心;加入1mL組織透明液,充分振蕩,13200rpm離心1min,移除上清液;加入0.5mL組織透明液,充分振蕩,13200rpm離心1min,移除上清液;加入1mL乙醇(96-100%),劇烈振蕩,13200rpm室溫離心2min,移除上清液;打開蓋子,室溫(15-25℃)或金屬浴37℃孵育直到剩余乙醇完全揮發(fā);取180μLBufferATL對(duì)管內(nèi)組織進(jìn)行吹吸重懸,然后加入20μL蛋白酶K,再次振蕩;將含有混合液的離心管置于56℃的金屬浴上,孵育1h,期間顛倒混勻3次,直至樣品完全溶解;將離心管轉(zhuǎn)移至90℃的金屬浴上,再次孵育1h;短暫離心,將管蓋上的溶液甩至管底;向管內(nèi)加入200μLBufferAL,充分振蕩混勻。然后加入200μL乙醇(96-100%),再次振蕩混勻;短暫離心,將管蓋上的溶液甩至管底;小心將混合液用移液器轉(zhuǎn)移至含有QIAampMinElutecolumn吸附柱的2mL收集管內(nèi),8000rpm離心1min,棄收集管,將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上;向吸附柱內(nèi)加入500μLBufferAW1,務(wù)必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min,棄收集管,將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上;向吸附柱內(nèi)加入500μLBufferAW2,務(wù)必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min,棄收集管,將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上;13200rpm室溫離心3min,以徹底甩掉吸附膜上殘留的溶液;將吸附柱將吸附柱置于一個(gè)干凈的1.5mL離心管上(自備),小心向膜中央滴加50μLBufferATE;13200rpm室溫離心1min,取收集到的DNA溶液1.5μL用NanoDrop檢測(cè)所得DNA的濃度和純度;將剩余的DNA溶液于-20℃保存。實(shí)施例3亞硫酸鹽處理試劑和方法如下。操作步驟:將實(shí)施例2提取的基因組DNA與1.5mlEP管中使用雙蒸水稀釋至50ul加5.5ul新鮮配制的3MNaOH溶液,42℃水浴30min;水浴期間配制以下溶液:10mM氫醌溶液(Hydryquinone):取55mg氫醌于50ml水中溶解;3.6mol/LNaHSO3:取18.8gNaHSO3加入40ml水中,并以3MNaOH溶液調(diào)節(jié)溶液PH至5.0,最終定容至50ml。加30ul10mM氫醌溶液和520ul3.6mol/LNaHSO3至上述水浴后溶液中,EP管外包裹以鋁箔紙避光,輕柔顛倒混勻溶液,管內(nèi)加100ul石蠟油,短暫離心使石蠟油蓋住液面,防止水浴過(guò)程中水分的蒸發(fā)并限制氧化50℃避光水浴16h;水浴完后將移液器槍頭伸入石蠟油層下,先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出,然后小心吸取約580ulDNA溶液至潔凈的1.5mlEP管中,使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收DNA,所得到的DNA溶于50ul去離子水,加5.5ul新鮮配制的3MNaOH,室溫放置15min,然后加33ul10M乙酸銨中和NaOH,使溶液PH=7,也加入4ul10mg/ml葡萄糖作為沉淀位置指示劑,加入270ul冰無(wú)水乙醇,至于-20℃,過(guò)夜沉淀后,4℃,12000rpm離心,30min,倒掉上清液,收集沉淀,加入500ul70%乙醇,洗劑沉淀,4℃12000rpm,5min離心兩次;倒掉上清,室溫干燥至沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r(shí),依DNA沉淀多少加入30-50ul雙蒸水溶解沉淀。利用本發(fā)明所述的DNA亞硫酸氫鈉處理試劑和方法,可以獲得更高的DNA回收率,高轉(zhuǎn)化率,同時(shí)可以降低DNA降解率和片段化率,從而提高了PCR擴(kuò)增和后續(xù)分析技術(shù)的靈敏度。實(shí)施例4PCR檢測(cè)方法如下。PCR引物為:所有引物純度達(dá)到PAGE級(jí)或HPLC級(jí),不含雜帶。提供合成結(jié)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明,如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜,證明使用引物達(dá)到檢測(cè)要求。MSH2的引物序列如下:F:5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’;R:5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’;PCR檢測(cè)反應(yīng)體系為:8-10×PCR緩沖液、0.8-1.2mMdNTPs、0.8-1.2uM擴(kuò)增引物(SEQNO1和SEQNO2)、0.5-2ng模板DNA,0.05-0.1U/ulDNA聚合酶。所述dNTPs包括:10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP。所述PCR緩沖液包括:TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為:第一階段,92-97℃預(yù)變性5-15min;第二階段,變性溫度92-97℃30sec,退火溫度62-66℃90sec,延伸溫度72℃30sec,循環(huán)12-18次,每循環(huán)一次,所述退火溫度降低0.5℃;第三階段,變性溫度92-97℃30sec,退火溫度53-57℃30sec,延伸溫度72℃30sec,循環(huán)24-34次;第四階段,72℃10min;第五階段,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。電泳檢測(cè)后將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶純化,測(cè)序反應(yīng),上機(jī)測(cè)序;所述酶純化的反應(yīng)條件為:37℃50min,95℃5min。所述測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)條件為:95℃4min,95℃15S;50℃20S;60℃2min,25個(gè)循環(huán)。依據(jù)相關(guān)軟件獲得樣本的MSH2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。以亞硫酸鹽處理后的MSH2啟動(dòng)子序列為標(biāo)準(zhǔn)序列,通過(guò)軟件分析獲得樣本的MSH2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。針對(duì)石蠟切片DNA片段化嚴(yán)重,而亞硫酸氫鹽修飾飽和狀態(tài)下仍呈現(xiàn)有效模板濃度低的問(wèn)題,將Touch-downPCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序相結(jié)合,可顯著提高檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例5子宮頸癌樣本檢測(cè):選擇石蠟切片樣本10例,3例為已確診子宮頸癌樣本,3例為正常人樣本,其余4例為未知樣本。利用本發(fā)明的試劑盒按照實(shí)施例3中的方法進(jìn)行樣本DNA提取、亞硫酸處理、純化回收、PCR擴(kuò)增、測(cè)序及結(jié)果分析。(1)材料:待測(cè)樣本、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、空白對(duì)照。(2)儀器:移液器、高速離心機(jī)、NANODROP1000、渦旋震蕩以、冰箱、電泳儀、凝膠拍照系統(tǒng),ABI3500XLGeneticAnalyzer,PCR儀。(3)試劑:DNA聚合酶(凱杰),DNA純化試劑(凱杰),dNTPs(TaTaRa)、純化水,亞硫酸鹽處理試劑(凱杰),EXOI(NEB),CIP(NEB),BigdyeTerminator(NEB).(4)引物:所有引物純度達(dá)到PAGE級(jí)或HPLC級(jí),不含雜帶。提供合成結(jié)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明,如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜,證明使用引物達(dá)到檢測(cè)要求。MSH2的引物序列如下:F:5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’;R:5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’;(5)PCR檢測(cè),反應(yīng)體系為:8-10XPCR緩沖液、0.8-1.2mMdNTPs、0.8-1.2uM如權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增引物、0.5-2ng模板DNA,0.05-0.1U/ulDNA聚合酶。(6)所述dNTPs中包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP,所述PCR緩沖液包含TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。(7)所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為:第一階段,92-97℃預(yù)變性5-15min;第二階段,變性溫度92-97℃30sec,退火溫度62-66℃90sec,延伸溫度72℃30sec,循環(huán)12-18次,每循環(huán)一次,所述退火溫度降低0.5℃;第三階段,變性溫度92-97℃30sec,退火溫度53-57℃30sec,延伸溫度72℃30sec,循環(huán)24-34次;第四階段,72℃10min;第五階段,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。(8)電泳檢測(cè)后將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶純化,測(cè)序反應(yīng),上機(jī)測(cè)序;(9)所述酶純化的反應(yīng)條件為:37℃50min,95℃5min。所述測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)條件為:95℃4min,95℃15S;50℃20S;60℃2min,25個(gè)循環(huán)。(10)依據(jù)相關(guān)軟件獲得樣本的MSH2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。以亞硫酸鹽處理后的MSH2啟動(dòng)子序列為標(biāo)準(zhǔn)序列,通過(guò)軟件分析獲得樣本的MSH2啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。10例樣本的MSH2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果如下表所示:樣本編號(hào)檢測(cè)到甲基化的CG數(shù)檢測(cè)結(jié)果S1(子宮頸癌)0個(gè)陰性S2(子宮頸癌)12個(gè)陽(yáng)性S3(子宮頸癌)0個(gè)陰性S4(正常人)0個(gè)陰性S5(正常人)0個(gè)陰性S6(正常人)0個(gè)陰性S7(子宮頸癌未確診)12個(gè)陽(yáng)性S8(子宮頸癌未確診)0個(gè)陰性S9(子宮頸癌未確診)0個(gè)陰性S10(子宮頸癌未確診)0個(gè)陰性檢測(cè)樣本的MSH2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果如圖3和圖4所示,圖3為S1樣本檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果為陰性(箭頭指CG位點(diǎn))。圖4為S2樣本檢測(cè)結(jié)果,結(jié)果為陽(yáng)性(箭頭指CG位點(diǎn))。SEQUENCELISTING<110>南昌艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司<120>MSH2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和檢測(cè)方法<130><160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1tggaagttgattgggtgtggty22<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2rctctccaactacaacrtctccttc25<210>3<211>167<212>DNA<213>人工序列<400>3tggaagttgattgggtgtggttgttgtggttggatgttgtttgggggatgtgggagggga60ggtgggaaatagtttagtgggtgtggggttgtgtattttttttaattaggaggtgaggag120gttttgatatggtggtgtagttgaaggagatgttgtagttggagagt167<210>4<211>167<212>DNA<213>人工序列<400>4tggaagttgattgggtgtggtcgtcgtggtcggacgtcgttcgggggacgtgggagggga60ggcgggaaatagtttagtgggtgtggggtcgcgtattttttttaattaggaggtgaggag120gtttcgatatggcggtgtagtcgaaggagacgttgtagttggagagc167當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
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