本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種定量檢測土壤中假單胞菌的方法。
背景技術(shù)：
：假單胞菌(Pseudomonadaceae)在分類學(xué)上屬于細菌域、變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬。假單胞菌廣泛存在于土壤中，是研究最深入的土壤微生物種群之一。假單胞菌是土壤微生態(tài)系統(tǒng)和土壤碳氮循環(huán)的重要組成部分。很多假單胞菌能改善植物微環(huán)境，并且誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性、抑制病原微生物侵染根系，有促進植物生長和防治植物病害的作用。一些假單胞菌還具有降解利用多種人工合成化合物的潛力。此外，假單胞菌的某些種對重金屬和有機污染物具有抗性并可將其在體內(nèi)富集。對土壤中假單胞菌的定量檢測可以更好的分析土壤微生物生態(tài)功能、土壤抑病性能力和污染土壤的微生物修復(fù)能力等。目前對土壤中假單胞菌的定量檢測方法主要是平板涂布計數(shù)法(Elad和Baker，1985；Garbeva等，2006)。平板涂布計數(shù)法為土壤浸提液經(jīng)梯度稀釋后涂布在選擇性培養(yǎng)基上，再進行假單胞菌菌落計數(shù)，進而計算出土壤中假單胞菌濃度，這種方法存在較大的誤差和困難，準確性低、費時，且易受雜菌影響，對試驗人員假單胞菌識別能力要求高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日益成熟，現(xiàn)在在DNA水平上采用定量PCR技術(shù)對土壤中假單胞菌進行定量檢測(Kaare等，1999)，但常規(guī)定量PCR以拷貝數(shù)或者基因組濃度量化待測樣品，所得結(jié)果單位為拷貝數(shù)每克土或者ng基因組DNA每克土，而非菌數(shù)每克土，不能直觀的了解土壤中假單胞菌的濃度。且不同批次檢測結(jié)果系統(tǒng)誤差較大，同一樣品的不同批次定量結(jié)果可能存在千倍以上的差異。因此，常規(guī)定量PCR在檢測土壤中假單胞菌濃度時也具有局限性。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明提供一種采用定量PCR技術(shù)以假單胞菌濃度已知的標準土樣繪制標曲從而定量檢測待測土樣中的假單胞菌，可用于假單胞菌的跟蹤檢測，為研究假單胞菌對土壤的生態(tài)適應(yīng)性和假單胞菌相關(guān)土壤生態(tài)功能提供了一種簡便、高效的方法，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種基于標準樣品的土壤中假單胞菌的定量檢測方法，其具體步驟如下：a)分別制備假單胞菌濃度依次為5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL(CFU/mL是指活菌數(shù)每毫升菌液，下同)的系列梯度標準土樣；b)利用土壤微生物DNA提取試劑盒分別提取系列梯度標準土樣DNA及待測土樣DNA，提取步驟嚴格依照說明書進行；c)選定可擴增假單胞菌的特異性引物(Widmer發(fā)明，1998)，合成特異性上下游引物SEQIDNO.1(Psf)和SEQIDNO.2(Psr)；分別以步驟b)中獲得系列梯度標準土樣DNA及待測土樣DNA為模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為上下游引物，進行熒光定量PCR反應(yīng)；d)根據(jù)系列梯度標準土樣假單胞菌濃度的對數(shù)值和相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)作圖，并進行線性擬合得到標準曲線：y＝40.765-4.755x，R2＝0.991；將待測土樣熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果(閾值循環(huán)數(shù)和線性方程)代入標準曲線，即可獲得待測土樣中假單胞菌的濃度。進一步，本發(fā)明所述基于標準土樣的土壤中假單胞菌的定量檢測方法中，步驟c)所述熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRPremixExTaq10μL，濃度均為10μmol/L上下游引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，濃度為40-60ng/μLDNA模板2μL，滅菌超純水補足至20μL；反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s；95℃預(yù)變性5s，65℃退火34s，共40個循環(huán)。進一步，本發(fā)明所述基于標準土樣的土壤中假單胞菌的定量檢測方法中，所述系列梯度標準土樣是這樣獲得的：a)取耕地土壤126℃滅菌120min，風(fēng)干后即獲得獲得土樣；b)將假單胞菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中活化，活化后的假單胞菌接種到裝有100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、160r/min搖床培養(yǎng)2天后，平板計數(shù)后備用；用無菌水將菌液依次稀釋為5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL；分別取20mL稀釋后的菌液加入到100g步驟a)獲得的土樣中(即體積質(zhì)量比1:5，mL/g)并快速風(fēng)干(強通風(fēng)陰暗條件下12h內(nèi)風(fēng)干土壤)，即獲得假單胞菌濃度依次為5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL的系列梯度標準土樣。本發(fā)明中，Psf和Psr可對假單胞菌特異性擴增出990bp的產(chǎn)物。本發(fā)明所涉及的平板計數(shù)法是參照文獻[沈萍，范秀榮，李廣武。微生物學(xué)實驗[M]。北京：高等教育出版社，1999,92-94]進行，其具體步驟為：用1mL無菌吸管，吸取1mL菌液移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次混勻菌液，即成10-1稀釋液；再換一支無菌吸管吸取1mL10-1稀釋液移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次混勻菌液，即成10-2稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋液。各稀釋液均吸取0.1mL到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，用無菌刮鏟涂勻至干。37℃培養(yǎng)三天后計數(shù)，菌液濃度＝同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。即知菌懸液中假單胞菌的濃度。本發(fā)明提供的用于定量檢測土壤中假單胞菌濃度的方法，可對土壤中假單胞菌進行快速檢測定量，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)實用性強，反應(yīng)土壤真實假單胞菌濃度。本發(fā)明方法，可以替代一直沿用的平板涂布計數(shù)和常規(guī)定量PCR技術(shù)，通過改進常規(guī)定量PCR技術(shù)，以假單胞菌濃度已知的標準土樣DNA做為定量PCR標曲DNA，可計數(shù)出待測土樣中的假單胞菌濃度，所得數(shù)據(jù)單位為菌數(shù)每克土，這樣即可避免傳統(tǒng)平板涂布計數(shù)法結(jié)果的不可靠性，又可避免常規(guī)定量PCR結(jié)果的不直觀性。(2)重復(fù)性高。已知假單胞菌濃度的標準土樣DNA與待測土樣DNA同時進行定量PCR，利用每個樣品在熒光閩值處所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)和標準樣品的假單胞菌濃度建立標準曲線，根據(jù)待測樣品Ct值在標準曲線上計算對應(yīng)的假單胞菌濃度。這樣可有效消除同一土樣進行不同批次檢測的系統(tǒng)誤差。即同一土樣不同批次檢測結(jié)果差異較小。(3)操作簡便快捷，應(yīng)用本發(fā)明方法，對標準土樣和待測土樣進行土壤微生物DNA提取，再進行定量PCR即可得出結(jié)果，操作簡便，適于檢測土壤中假單胞菌濃度及對其進行實時檢測。附圖說明圖1為特異性檢測引物對假單胞菌及其它常見土壤細菌的擴增結(jié)果；圖中：泳道1-2位假單胞菌，3-4為芽孢桿菌，5-6為鏈霉菌，7-8為大腸桿菌，9-10為農(nóng)桿菌，11-12為陰性對照。圖2為本發(fā)明對土壤中假單胞菌的靈敏度檢測試驗擴增曲線，樣品閾值循環(huán)數(shù)從高到底依次對107、106、105、104、103、102和10假單胞菌/g風(fēng)干土。圖3為標準樣品和待測樣品的假單胞菌熒光定量PCR溶解曲線圖，溶解溫度為88.5℃。圖4為標準樣品和待測樣品的假單胞菌熒光定量PCR擴增曲線圖，縱坐標為循環(huán)數(shù)，橫坐標為土壤假單胞菌濃度。圖5為標準樣品和待測樣品的假單胞菌熒光定量PCR標準曲線圖，y＝40.765-4.755x，R2＝0.991。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明涉及的檢測方法做進一步說明。實施例涉及的菌種及培養(yǎng)基：本實施例中涉及的假單胞菌為銅綠假單胞菌P1(參見文獻“銅綠假單胞菌結(jié)合生物熏蒸防控辣椒疫病的效果”，王秋君等，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015)；芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌BS211(參見文獻“西瓜內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS211的拮抗活性及盆栽防效”，馬艷等，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006)；鏈霉菌為婁徹氏鏈霉菌(參見文獻“麥秸不同部位生物降解速率差異”，王佳佳等，農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報，2015)；農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌SK1044(參見文獻“農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大麗輪枝菌的體系優(yōu)化”，陳天子等，棉花學(xué)報，2011)；大腸桿菌為DH5a，購至寶生物工程(大連)有限公司。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，水1L，pH7.2-7.4。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1L，pH7.2-7.4。實施例涉及的引物序列：SEQIDNO.1(Psf)：5‘-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3’；SEQIDNO.2(Psr)：5‘-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3’。實施例涉及的試劑及儀器：土壤微生物DNA提取試劑盒為MP土壤DNA提取試劑盒，貨號116560200；SYBRpremixExTaq試劑盒(包含2×SYBRPremixExTaq和ROXReferenceDyeII)購自寶生物工程有限公司，貨號為RR420A；2×TaqPCRMasterMix購自南京基天生物技術(shù)有限責任公司；Psf/Psr引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；實施例中的PCR熒光定量儀為ABI7500熒光定量PCR儀，數(shù)據(jù)分析由ABI7500熒光定量PCR儀自帶的分析軟件完成，熒光定量PCR反應(yīng)完成后，軟件自動對每個反應(yīng)收集到的熒光信號進行分析，選擇合適的熒光閩值，然后利用每個樣品在熒光閩值處所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)和標準樣品的假單胞菌濃度建立標準曲線，待測樣品可以根據(jù)其Ct值在標準曲線上查到對應(yīng)的假單胞菌濃度。實施例中對土樣快速風(fēng)干是指即強通風(fēng)陰暗條件下12h內(nèi)風(fēng)干土壤。實施例1假單胞菌的特異引物檢測(1)各菌株DNA制備用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)所有菌株，再用OMEGA細菌DNA提取試劑盒提取各菌株DNA。(2)檢測假單胞菌特異引物的合成Psf：5’-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3’Psr：5’-TTAGCTCCACCTCGCGGC-3’由金斯瑞生物科技有限公司合成。(3)用于檢測假單胞菌的PCR反應(yīng)體系分別以各菌株DNA為模板，Psf和Psr為上下游引物，進行PCR擴增：PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，10μmol/L的引物各0.5μL，1μL濃度為40-60ng/μL的DNA模板，滅菌超純水補足至25μL。PCR反應(yīng)程度：95℃預(yù)變性5min；92℃變性1min，64.1℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10min。(4)PCR產(chǎn)物鑒定取6μLPCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖電泳檢測，經(jīng)SYBR-green染色紫外燈下觀察，根據(jù)DNA條帶的有無及大小對假單胞菌特異引物的特異性進行驗證。(5)試驗結(jié)果PCR擴增結(jié)果如圖1所示，圖1中，泳道1-2位假單胞菌，3-4為芽孢桿菌，5-6為鏈霉菌，7-8為大腸桿菌，9-10為農(nóng)桿菌，11-12為陰性對照引物；由圖1可見，Psf/Psr只能特異性從假單胞菌DNA(1-2)中擴增出990bp的條帶，而芽孢桿菌(3-4)、鏈霉菌(5-6)、大腸桿菌(7-8)、農(nóng)桿菌(9-10)及陰性對照(11-12)均無擴增條帶(3-12)。因此該對引物具有很好的特異性，只對假單胞菌有990bp的擴增產(chǎn)物，對其它對照菌株均無擴增產(chǎn)物。實施例2制作假單胞菌濃度已知的標準土樣(1)假單胞菌的培養(yǎng)將試管斜面保存的一株假單胞菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中活化，再將活化好的假單胞菌接種到裝有100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶，置于搖床，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，在37℃環(huán)境中培養(yǎng)2天后得假單胞菌液，對菌液進行平板菌落計數(shù),冷藏備用。實施例中對菌液進行平板菌落計數(shù)方法參照文獻[沈萍，范秀榮，李廣武。微生物學(xué)實驗[M]。北京：高等教育出版社，1999,92-94]進行，用1mL無菌吸管，吸取1mL菌液移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次混勻菌液，即成10-1稀釋液；再換一支無菌吸管吸取1mL10-1稀釋液移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次混勻菌液，即成10-2稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀釋液。各稀釋液均吸取0.1mL到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，用無菌刮鏟涂勻至干。37℃培養(yǎng)2天后計數(shù)，即知菌懸液中假單胞菌的濃度。(2)標準土樣的制備在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地設(shè)施辣椒大棚取耕層土壤進行126℃滅菌120min，然后風(fēng)干即獲得土樣；取7份100g土壤，將菌液稀釋為5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50CFU/mL，分別取20mL加入到100g土壤中并快速風(fēng)干，獲得107、106、105、104、103、102和10CFU/g風(fēng)干土的系列梯度標準土樣。實施例3定量檢測土壤中假單胞菌成套技術(shù)的靈敏度試驗(1)標準土樣DNA的制備采用MP土壤DNA提取試劑盒提取107、106、105、104、103、102和10CFU/g的系列梯度標準土樣的DNA。(2)用于定量檢測假單胞菌的PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系包括2×SYBRPremixExTaq10μL，10μmol/L的Psf/Psr引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，DNA模板2μL，滅菌超純水補足至20μL。(3)用于定量檢測假單胞菌的PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性30s，95℃預(yù)變性5s，65℃退火34s，40個循環(huán)。(4)定量PCR擴增將標準土樣DNA在ABI7500儀上進行定量PCR擴增。(5)試驗結(jié)果本發(fā)明對土壤中不同濃度假單胞菌的靈敏度檢測試驗擴增曲線如圖2所示，圖2中，樣品閾值循環(huán)數(shù)從高到底依次對應(yīng)107、106、105、104、103、102和10假單胞菌/g風(fēng)干土；結(jié)果顯示此方法下107、106、105、104、103、102和10CFU/g的梯度標樣DNA可形成梯度擴增曲線，靈敏度可達10CFU/g土。因此利用該方法檢測土壤中假單胞菌濃度可檢測到10個假單胞菌每克土。實施例4待測土樣中假單胞菌的定量檢測(1)待測土樣DNA的制備對照土壤：取自淮安市清浦區(qū)耕作地；生物炭土壤：向?qū)φ胀寥乐屑尤?.33wt％的生物炭(由20目麥秸經(jīng)馬弗爐500℃或600℃厭氧裂解1h所得)；將辣椒疫霉游動孢子液均勻加入上述兩組土壤中，使得辣椒疫霉數(shù)量為每克干土500個游動孢子，在上述兩組土壤中分別按照常規(guī)方法栽種辣椒(蘇椒5號)，自然光照，溫度25℃-35℃，栽種32天(參見文獻“秸稈生物炭對辣椒疫病的防控效果及機理研究”，王光飛等，土壤，2015)，然后分別取兩組土壤按照實施例2步驟(2)標準土樣的制備步驟制備待測土樣，將待測土樣快速風(fēng)干后，采用土壤微生物DNA提取試劑盒提取DNA。(2)用于定量檢測假單胞菌的PCR反應(yīng)體系20μLPCR反應(yīng)體系：2×SYBRPremixExTaq10μL，10μmol/L的Psf/Psr引物各0.4μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，濃度為60ng/μLDNA模板2μL(在具體操作過程中，DNA模板的濃度可以在40-60ng/μL范圍內(nèi)選擇)，滅菌超純水補足至20μL。(3)用于定量檢測假單胞菌的PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性30s，95℃預(yù)變性5s，65℃退火34s，40個循環(huán)。(4)定量PCR擴增將107、106、105、104和103CFU/g標準土樣和待測土樣DNA進行同時定量PCR擴增，并以標準土樣假單胞菌濃度的對數(shù)值和相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)作圖，并進行線性擬合得到標準曲線。根據(jù)待測土樣閾值循環(huán)數(shù)和線性方程，計算出待測土壤中的假單胞菌濃度。(5)試驗結(jié)果應(yīng)用上述方法測定添加生物炭土壤和對照土壤假單胞菌濃度。溶解曲線見圖3，溶解溫度為88.5℃，標準樣品及待測樣品溶解曲線單峰。擴增曲線見圖4(縱坐標為循環(huán)數(shù)，橫坐標為土壤假單胞菌濃度)，擴增效率為102.1。標準曲線見圖5，標準土樣DNA的對數(shù)值和相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)作圖，并進行線性擬合得到標準曲線，標曲為y＝40.765-4.755x，相關(guān)系數(shù)R2＝0.991。擴增曲線、溶解曲線和標準曲線均符合定量PCR要求，結(jié)果可靠。根據(jù)待測土樣閾值循環(huán)數(shù)和線性方程，可計算出待測土壤中的假單胞菌濃度，試驗重復(fù)操作兩次，兩次技術(shù)結(jié)果如表1所示：表1同一樣品不同批次檢測結(jié)果樣品假單胞菌濃度對照土壤11.40×106CFU/g生物炭土壤11.63×106CFU/g對照土壤21.37×106CFU/g生物炭土壤21.54×106CFU/g由表1可知，添加生物炭土壤假單胞菌顯著高于對照土壤，這與相關(guān)報道研究(參見文獻“EffectofbiocharamendmentsonmycorrhizalassociationsandFusariumcrownandrootrotofasparagusinreplantsoils”,Elmer等，PlantDisease,2011；“Inductionofsystemicresistanceinplantsbybiochar,asoilappliedcarbonsequesteringagent”，Elad等，Phytopathology,2010)一致。實施例5待測樣品的重復(fù)性檢測試驗利用實施例4所述方法對同一土樣進行多次定量檢測，以此樣品的檢測結(jié)果來判定該方法的重復(fù)性。待測土樣：取自淮安市清浦區(qū)耕作地土壤，按照常規(guī)方法人工栽種辣椒(蘇椒5號)，自然光照，溫度25℃-35℃，栽種32天(即文獻“秸稈生物炭對辣椒疫病的防控效果及機理研究”，王光飛等，土壤，2015中1.2節(jié)，CK1空白對照)，采用與實施例4相同的方法，對上述土樣進行多次檢測，檢測結(jié)果如表2所示：表2同一樣品不同批次檢測結(jié)果樣品假單胞菌濃度第一次檢測結(jié)果1.32×106CFU/g第二次檢測結(jié)果1.37×106CFU/g第三次檢測結(jié)果1.26×106CFU/g第四次檢測結(jié)果1.23×106CFU/g從表2中數(shù)據(jù)可以看出該樣品的多次重復(fù)檢測結(jié)果誤差較小，因此利用此方法檢測土壤中假單胞菌濃度時，其檢測結(jié)果受系統(tǒng)誤差影響較小，可精確的反應(yīng)土壤中假單胞菌濃度。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3