本發(fā)明涉及一種判斷MircroRNA基因敲除動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性的方法，屬于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)估領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近十余年以來，microRNA(miRNA)一直是分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)miRNAs是一類由非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體，經(jīng)酶剪切成熟后形成的長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小RNA分子。miRNAs可以在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控真核生物的基因表達(dá)，其通過不完全的堿基互補(bǔ)，作用于特異性靶基因，形成強(qiáng)大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致靶基因穩(wěn)定性降低或表達(dá)減少，在各種細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化以及細(xì)胞死亡等過程中起到舉足輕重的作用。

目前學(xué)術(shù)界對(duì)于食物來源的MicroRNA能否被進(jìn)食者吸收仍存在爭(zhēng)議?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方法主要為給小鼠喂食含有某種特定MicroRNA的食物或合成MicroRNA，之后將小鼠血液中的MicroRNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)?，F(xiàn)有方法主要存在如下不足：a、小鼠體內(nèi)若存在與食物來源的MicroRNA序列相似的MicroRNA，則會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。b、使用合成MicroRNA時(shí)，實(shí)驗(yàn)成本高、周期長(zhǎng)。

雖然學(xué)術(shù)界有大量以MicroRNA基因敲除動(dòng)物為模型開展的研究。但是，對(duì)于該類模型的可靠性，特別是被敲除基因是否仍會(huì)出現(xiàn)在基因敲除小鼠中這一問題，仍然缺乏簡(jiǎn)單有效的評(píng)估手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種判斷MircroRNA基因敲除動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性的方法，通過喂食待驗(yàn)證的MicroRNA基因敲除動(dòng)物特定食物，一定時(shí)間后取出喂食后動(dòng)物血樣，檢測(cè)其中是否有被敲除的MicroRNA。

本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確、快捷、經(jīng)濟(jì)的判斷食物來源的MicroRNA可吸收性的方法，喂食miR-144/451-/-基因敲除型小鼠富含MicroRNA-451的食物后，在miR-144/451-/-基因敲除型小鼠體內(nèi)檢測(cè)到MicroRNA-451(喂食的食物為野生型小鼠的血液)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，對(duì)所有使用MicroRNA基因敲除動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)室有重要意義，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)實(shí)施性。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種判斷MircroRNA基因敲除動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性的方法，其特征在于，包括以下步驟:

1)準(zhǔn)備好相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑；

2)野生型小鼠和miR-144/451基因敲除的雄性小鼠各兩只，通過繁殖得到大量的野生型小鼠和miR-144/451基因敲除鼠；

3)按照SPF(Specific Pathogen Free無特定病原體)級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)小鼠，濕度控制在40％-70％，溫度控制在20-25℃，用已滅菌處理的飼料、墊料和飲水一周更換二到三次；

4)合籠方式為1只miR-144/451基因敲除的雄鼠和1-5只miR-144/451基因敲除的雌鼠交配進(jìn)行繁殖，發(fā)現(xiàn)雌鼠有懷孕表現(xiàn)立即分籠生育，并及時(shí)記錄生育出的小鼠父母系來源；

5)步驟4)中的小鼠DNA提取:取3周齡的小鼠尾部末端組織，長(zhǎng)度為0.5cm，放入1.5ml EP管中，每管加l00μl裂解液，95℃，靜置20分鐘，冷卻后加入l00μl中和液混勻，取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行小鼠基因型鑒定；

6)小鼠DNA的PCR：下列反應(yīng)物構(gòu)成20μl的PCR反應(yīng)體系：含鼠DNA的上清液2μl、引物1μl、DNA聚合酶混合物10μl、雙蒸水7μl；上述材料混勻離心后置于PCR儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增：預(yù)變性，95℃，5分鐘；變性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循環(huán)，72℃，5分鐘；

7)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：取瓊脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE電泳緩沖液中，微波爐中加熱至沸騰，將溶解澄清的瓊脂物室溫冷卻至60℃加入Goldview5μl或EB 3μl混勻，緩緩倒入已置好梳子的膠板中，室溫放置30min，待凝膠完全凝固后輕輕拔出梳子；將制備好的1.5％瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入1×TAE溶液至高出凝膠表面；取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物10μl加樣到膠孔中，電壓100V電泳，時(shí)間為30min；

8)凝膠成像：電泳結(jié)束后，取出凝膠置于凝膠成像分析儀下拍照，小鼠電泳基因型片段為：miR-144/451野生型小鼠為290bp、純合子190bpheterozygous(-/+)250bp和190bp；

9)喂食：使用帶有抗凝劑的玻璃毛細(xì)管從miR-144/451野生型小鼠小內(nèi)眥靜脈取血200微升，使用12#灌胃器將野生型小鼠的血液喂食給miR-144/451基因敲除型小鼠；

10)提取樣本：在喂食3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后，分別使用帶有抗凝劑的玻璃毛細(xì)管從miR-144/451基因敲除型小鼠小內(nèi)眥靜脈取血200微升；

11)提取樣本中的RNA：每0.1mL步驟10)得到的全血加入裂解液Trizolreagent 1ml，大力混勻，靜置5到10分鐘；加入200μl氯仿，劇烈搖晃15s，靜置5分鐘；4℃，12000g離心15min；將上清轉(zhuǎn)入新的EP管，加入500μl異丙醇，顛倒混勻后室溫沉淀10min；4℃，12000g離心20min；棄上清，加入1ml75％乙醇；4℃，12000g離心5min；棄上清，室溫靜置至干燥加入20μlDEPC水溶解；55℃水浴5min；

12)反轉(zhuǎn)錄RNA:配置反應(yīng)液體系：步驟11)中得到的總RNA 1ng、RTase Mix1μl、5xReaction Buffer 5μl，使用ddH₂O將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25μl；混勻后加溫至37℃，而后保溫60分鐘，再加溫至85℃，保溫10分鐘；

13)全血DNA的PCR：下列反應(yīng)物構(gòu)成20μl的PCR反應(yīng)體系：步驟12)得到的全血DNA 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl、DNA聚合酶混合物10μl、雙蒸水7μl；混勻離心后置于PCR儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增：預(yù)變性，95℃，5分鐘；變性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循環(huán)，72℃，5分鐘；

14)使用U6作為內(nèi)參，判斷miR-451的表達(dá)水平。

步驟7)中，50ml的TAE電泳緩沖液由57.1ml的冰乙酸、242g的Tris-base、100ml濃度為0.5mol/L的EDTA配制而成，并由雙蒸水定容至1L。

步驟7)中，1×TAE電泳緩沖液由10ml的50xTAE電泳緩沖液加雙蒸水定容至500ml。

步驟7)中，所述EB濃度為10mg/ml，由1g的EB、100ml的去離子水混勻溶解后避光保存，室溫放置而制成。

步驟5)中，所述裂解液由40μl的0.5M EDTA、25μl的10N NaOH、100ml的蒸餾水制成，并調(diào)節(jié)PH至8.0。

步驟5)中，所述中和液由4ml的1M Tris-HCl加蒸餾水定容至100ml。

本發(fā)明通過提供一種準(zhǔn)確、快捷、經(jīng)濟(jì)的判斷食物來源的MicroRNA可吸收性的方法，可以輔助判斷實(shí)驗(yàn)室使用的MicroRNA基因敲除動(dòng)物是否可靠。主要實(shí)施方法如下：

1.培育基因敲除特定MicroRNA的小鼠；

2.通過查閱文獻(xiàn)，找到該種MicroRNA含量豐富的動(dòng)植物組織；

3.將上述動(dòng)植物組織制成食物喂食給特定MicroRNA基因敲除型小鼠；

4.在喂食后三小時(shí)、六小時(shí)、十二小時(shí)、二十四小時(shí)取出小鼠血，檢測(cè)其中的MicroRNA含量。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

通過喂食待驗(yàn)證的MicroRNA基因敲除動(dòng)物特定食物之后，一定時(shí)間后取出喂食后動(dòng)物血樣，在其中檢測(cè)到了被敲除基因所編碼的MicroRNA?？梢缘贸鼋Y(jié)論：被敲除的MicroRNA可以通過食物進(jìn)入MicroRNA基因敲除動(dòng)物體內(nèi)，MicroRNA基因敲除動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性不高。

本發(fā)明將含有MicroRNA-451的食物喂食給MicroRNA-451基因敲除型小鼠，繼而在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到該種MicroRNA。喂食之后，小鼠紅細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，說明食源性MicroRNA可以通過消化道進(jìn)入小鼠體內(nèi)，并發(fā)揮功能，因此mm-451基因敲除型小鼠不能排除食源性MicroRNA-451的干擾，可靠性不高。本發(fā)明提供一種判斷MircroRNA基因敲除動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性的方法，將被使用MicroRNA基因敲除動(dòng)物開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)廣泛應(yīng)用，具有極大的科學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1是喂食富含MicroRNA-451血液之后，miR-144/451-/-基因敲除型小鼠體內(nèi)MicroRNA-451含量變化情況；

圖2是不同基因型小鼠鑒定凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

一種根據(jù)本方法判斷miR-144/451-/-基因敲除型的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

S1：準(zhǔn)備好相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑

(1)本實(shí)施例涉及的實(shí)驗(yàn)試劑如下表所示：

(2)本實(shí)施例涉及的主要自配試劑如下表所示：

(3)本實(shí)施例中應(yīng)用到的PCR引物：

(3.1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR用引物：

miR-451上游引物5’-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’

下游引物為GeneCopoeia公司All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit中的通用引物。

(3.2)基因型鑒定引物：

miR451上游引物：5’-TTCTGCCTGTAACTCTGGATCCCTAAGAGA

miR451下游引物-1：5’-GGGTACCCAGACTAGTACATCATCTATA

miR451下游引物-2：5’-ATCCCCTCGAGGGACCTAATAACTTC

S2：揚(yáng)州大學(xué)非編碼RNA中心由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)附屬費(fèi)城兒童醫(yī)院引進(jìn)β-globin-/+和miR-144/451-/-基因敲除雄性小鼠各兩只，揚(yáng)州大學(xué)比較中心C57/BL6雌性小鼠若干只，目前已繁殖得到大量的基因敲除β-地中海貧血鼠，miR-144/451基因敲除鼠和miR-144/451基因敲除的β-地貧鼠模型。

S3：按照SPF(Specific Pathogen Free無特定病原體)級(jí)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)小鼠。濕度控制在40％-70％，溫度控制在20-25℃，用已滅菌處理的飼料、墊料和飲水一周更換二到三次。

S4：合籠方式為1只基因敲除的雄鼠和1-5只基因敲除的雌鼠交配進(jìn)行繁殖，發(fā)現(xiàn)雌鼠有懷孕表現(xiàn)如陰栓或腹部呈梨形立即分籠生育并及時(shí)記錄小鼠父母系來源。

S5：小鼠DNA提?。喝?周齡的小鼠尾部末端組織，大小約0.5cm，放入1.5ml EP管中，每管加l00μl裂解液，95℃靜置20min。冷卻后加入l00μl中和液混勻，取以上的含鼠DNA的上清液用于PCR進(jìn)行小鼠基因型鑒定。

S6：小鼠DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：引物由上海生工生物工程有限公司提供。PCR反應(yīng)體系：下列反應(yīng)物構(gòu)成20μl的反應(yīng)體系。鼠尾DNA 2μl，引物(20μmol)μ1，DNA聚合酶混合物(Taq DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2和反應(yīng)緩沖液)10μl，雙蒸水7μl。混勻離心后置于PCR儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增：預(yù)變性，95℃，5分鐘；變性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1分鐘；循環(huán)；72℃，5分鐘。

S7：進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：取瓊脂糖粉末0.75g加入50ml的TAE電泳緩沖液中，微波爐中加熱至沸騰，將溶解澄清的瓊脂物室溫冷卻至60℃加入Goldview 5μl或EB 3μl混勻，緩緩倒入已置好梳子的膠板中，室溫放置30min待凝膠完全凝固后輕輕拔出梳子。將制備好的1.5％瓊脂糖凝膠放入電泳槽，加入1×TAE溶液至高出凝膠表面。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物10μl加樣到膠孔中。電壓100V電泳，時(shí)間為30分鐘。

S8：凝膠成像：電泳結(jié)束后，取出凝膠置于凝膠成像分析儀下拍照，小鼠電泳基因型片段為：β-地中海貧血小鼠鑒定是，一條大小為567bp(base pair，堿基)的條帶為野生型正常鼠，一條大小為1000bp的條帶為純合子β-地中海貧血小鼠；出現(xiàn)以上兩條條帶的為β-地中海貧血雜合子。miR-144/451野生型小鼠為290bp；純合子190bp；雜合子(-/+)250bp和190bp。

S9：喂食：使用帶有抗凝劑的玻璃毛細(xì)管從miR-144/451野生型小鼠小內(nèi)眥靜脈取血200微升，使用12#灌胃器將野生型小鼠的血液喂食給miR-144/451基因敲除型小鼠；

S10：提取樣本：在喂食3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后，分別使用帶有抗凝劑的玻璃毛細(xì)管從miR-144/451基因敲除型小鼠小內(nèi)眥靜脈取血200微升；

S11：提取樣本中的RNA：每0.1mL步驟10)得到的全血加入裂解液Trizolreagent 1ml，大力混勻，靜置5到10分鐘；加入200μl氯仿，劇烈搖晃15s，靜置5分鐘；4℃，12000g離心15min；將上清轉(zhuǎn)入新的EP管，加入500μl異丙醇，顛倒混勻后室溫沉淀10min；4℃，12000g離心20min；棄上清，加入1ml75％乙醇；4℃，12000g離心5min；棄上清，室溫靜置至干燥加入20μlDEPC水溶解；55℃水浴5min；

S12：反轉(zhuǎn)錄RNA:配置反應(yīng)液體系：步驟11)中得到的總RNA 1ng、RTase Mix 1μl、5xReaction Buffer 5μl，使用ddH₂O將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25μl；混勻后加溫至37℃，而后保溫60分鐘，再加溫至85℃，保溫10分鐘；

S13:全血DNA的PCR：下列反應(yīng)物構(gòu)成20μl的PCR反應(yīng)體系：步驟12)得到的全血DNA 2μl、上游引物2μl、下游引物2μl、DNA聚合酶混合物10μl、雙蒸水7μl；混勻離心后置于PCR儀設(shè)定條件循環(huán)擴(kuò)增：預(yù)變性，95℃，5分鐘；變性，95℃，40秒；退火，60.5℃，40秒；延伸，72℃，1min；循環(huán)，72℃，5分鐘；

S14:使用U6作為內(nèi)參，判斷miR-451的表達(dá)水平。