本發(fā)明涉及一個棉花基因GhJAZ11-D的克隆與功能鑒定。

背景技術(shù)：
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棉花是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一。我國是世界上最大的產(chǎn)棉國和棉花消費國，棉花生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的地位。棉纖維是棉花生產(chǎn)的主要產(chǎn)品，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接決定了棉花生產(chǎn)的產(chǎn)值和效益，因此，一直以來，提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)都是棉花育種的主要目標。

棉花纖維是由胚珠外被上的表皮細胞分化而成的一種無分支的種子表皮毛。每個棉纖維細胞都是單細胞，且在其伸長過程中不具有細胞分裂和多細胞發(fā)育過程，因此，棉纖維細胞是研究細胞分化和伸長的理想材料(Kim and Triplett，2001)。棉纖維細胞分化和發(fā)育過程可分為纖維細胞起始(開花前3天–開花后5天)、快速伸長(開花當(dāng)天–開花后20天)、次生壁沉積(開花后16–40天)和脫水成熟(開花后40–50天)四個不同而又重疊的時期(Basra and Malik，1984)。纖維細胞的起始與伸長直接影響到棉纖維的數(shù)量和長度，而次生壁加厚則影響棉纖維的強度和馬克隆值等性狀。因此，克隆棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因，研究基因產(chǎn)物之間的關(guān)系，解析棉花纖維發(fā)育的分子機制，不僅具有重要的理論意義，而且對棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)改良具有重要的應(yīng)用價值。

棉花纖維發(fā)育過程受到細胞內(nèi)植物激素水平的調(diào)控。采用棉花離體胚珠培養(yǎng)技術(shù)，Beasley和Ting檢測了不同激素對棉花纖維分化及發(fā)育過程中的作用，結(jié)果表明吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)可以促進棉花纖維的起始和伸長，而細胞分裂素和脫落酸(ABA)對纖維的發(fā)育有抑制作用(Beasley and Ting，1973)。后來的研究發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)脂(BR)對纖維起始分化和伸長也是必需的(Sun et al.,2005)。乙烯可以通過促進蔗糖合成酶、微管蛋白和膨脹素相關(guān)基因的表達來促進纖維伸長(Shi et al.,2006)。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，外源的茉莉素(JA)可以抑制棉花纖維的伸長(Tan et al.,2012)。

茉莉素(JA)作為一種重要的植物激素，廣泛分布于植物幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中(Browse，2009)，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物生長發(fā)育和對外界環(huán)境的防御應(yīng)答。研究表明，JA在植物體內(nèi)具有多種生理功能，概括起來有如下兩大方面：(1)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。例如，促進葉片衰老、抑制種子萌發(fā)、抑制幼苗生長和根的伸長，與雌蕊的發(fā)育、表皮毛發(fā)育和與花青素積累相關(guān)等。(2)作為信號分子參與各種生物和非生物脅迫應(yīng)答(Qi et al.,2011；Wasternack，2007)。茉莉素信號通路有三個關(guān)鍵因子：受體COI1，抑制因子JAZ和下游主要正調(diào)控因子MYC2。當(dāng)植物體內(nèi)JA濃度較低時，JAZ與MYC2互作，從而抑制MYC2對下游JA應(yīng)答基因的正調(diào)控作用。而當(dāng)植物受到刺激或發(fā)育需要時，植物體內(nèi)存在較高的JA濃度，JA的活化形式(JA-Ile)被受體COI1識別并結(jié)合，招募JAZ蛋白，形成COI1-JA-Ile-JAZ復(fù)合體，使JAZ被SCF^COI1的E3連接酶泛素化，并以依賴于26S蛋白酶體的形式被降解，從而使MYC2可以結(jié)合到下游JA應(yīng)答基因的啟動子上，促進下游基因表達，從而引發(fā)JA信號通路(Howe，2010)。

JA是擬南芥表皮毛發(fā)育的正調(diào)控因子，JA可以去除其抑制因子JAZ與調(diào)控表皮毛起始的三聯(lián)復(fù)合體WD-Repeat/bHLH/MYB中的bHLH和MYB因子的互作，從而促進表皮毛的發(fā)生(Qi et al.,2011)。同時，JA與GA和IAA之間存在拮抗作用，抑制表皮毛細胞的伸長。在JA信號通路中，JAZ作為關(guān)鍵的抑制因子，發(fā)揮著重要的作用。目前，在擬南芥中，已經(jīng)鑒定了13個家族成員，其蛋白序列中含有3個結(jié)構(gòu)域：NT結(jié)構(gòu)域、ZIM結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域。其中，Jas結(jié)構(gòu)域，含有22個氨基酸，位于JAZ蛋白的C端，序列高度保守，是JAZ蛋白區(qū)別于其他ZIM蛋白的主要特征，該結(jié)構(gòu)域的主要作用是可以與其他轉(zhuǎn)錄因子及JA受體COI1蛋白發(fā)生相互作用(Kazan and Manners,2010；Thini et al.,2007)。因此，JAZ是JA信號通路中的一個關(guān)鍵負調(diào)控因子，以此為切入點，研究植物激素JA在棉花纖維起始和伸長的作用，對于棉花纖維品質(zhì)改良，具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一個新的棉花JAZ基因GhJAZ11-D，分析揭示該基因的生物學(xué)功能，探索其對纖維發(fā)育調(diào)控的作用機制，進而應(yīng)用該基因改良棉纖維品質(zhì)。

在最近的研究中，我們通過公開的四倍體棉花基因組數(shù)據(jù)庫鑒定了30個編碼JAZ蛋白的基因，其中一個基因命名為GhJAZ11-D。該基因含有687bp開放閱讀框，編碼228個氨基酸的JAZ蛋白。GhJAZ11-D蛋白具有NT結(jié)構(gòu)域、保守的ZIM結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析表明，GhJAZ11-D與AtJAZ11和AtJAZ12位于同一進化分支。利用熒光定量RT-PCR技術(shù)對該基因在棉花不同組織和棉纖維不同發(fā)育階段的表達譜進行了分析，結(jié)果表明GhJAZ11-D基因在棉花不同組織以及不同的纖維發(fā)育階段都有一定的表達，而且在纖維起始期高量表達，在之后的纖維伸長期其表達量逐漸上升(圖1)。亞細胞定位分析表明，GhJAZ11-D蛋白定位于細胞核中(圖2)。利用酵母雙雜交技術(shù)驗證GhJAZ11-D與受體GhCOI1蛋白的相互作用，結(jié)果顯示GhJAZ11-D與GhCOI1結(jié)合后形成的二倍體酵母細胞能夠在含有20μM COR的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長，說明在有JA-Ile的類似物COR存在的情況下，GhJAZ11-D與GhCOI1能發(fā)生相互作用(圖3)。利用酵母雙雜交和Pull-down實驗驗證GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白的相互作用，結(jié)果顯示GhJAZ11-D與GhMYC2結(jié)合后形成的二倍體酵母細胞能夠在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長，說明在酵母系統(tǒng)中，GhJAZ11-D能與GhMYC2發(fā)生相互作用(圖4A)；Pull-down實驗證明，His-GhJAZ11-D蛋白與GST蛋白(對照)孵育純化后沒有檢測到信號，相反，His-GhJAZ11-D蛋白與GST-GhMYC2蛋白孵育后，用His抗體進行檢測，同Input一樣，能夠檢測到結(jié)合蛋白信號(圖4B)。以上結(jié)果說明，GhJAZ11-D蛋白與GhMYC2蛋白在體外能發(fā)生相互作用。

構(gòu)建了CaMV 35S啟動子驅(qū)動的GhJAZ11-D過量表達載體，轉(zhuǎn)化棉花，獲得過量表達JAZ11-D轉(zhuǎn)基因棉花植株。RT-PCR分析表明，轉(zhuǎn)基因棉花纖維中GhJAZ11-D表達水平都有不同程度的升高(圖5A)。觀察其植株的生長情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株比野生型株高變高，節(jié)間距變長(圖5B)。進一步觀察其10天胚珠的大小，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花的胚珠相對野生型變小(圖5C)。待棉花成熟，收取成熟纖維，測量分析發(fā)現(xiàn)纖維長度相對野生型變長，整齊度指數(shù)相對野生型升高，馬克隆值相對野生型更接近于最佳值(圖5D和5E)。以上都說明提高GhJAZ11-D基因表達可以促進棉花纖維伸長，提高纖維品質(zhì)。因此，推測GhJAZ11-D可能通過參與JA信號通路而調(diào)控棉花棉花纖維發(fā)育，進而影響棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1.提供了一個新的棉花JAZ11-D基因序列及cDNA序列。該基因在棉花纖維發(fā)育起始和伸長發(fā)育中都有較高水平的表達，表明該基因可能在控制棉纖維起始和伸長發(fā)育過程中起重要作用。

2.GhJAZ11-D蛋白定位于細胞核中，可以和JA信號通路受體GhCOI1和關(guān)鍵調(diào)控因子GhMYC2相互作用。

3.與野生型相比，過量表達GhJAZ11-D導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉花植株高度增加，胚珠變小，棉纖維長度增加，纖維品質(zhì)有所改善，這表明GhJAZ11-D基因可能通過參與JA信號調(diào)控而在棉纖維細胞伸長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，從而影響棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)。

本發(fā)明通過以下附圖和實施作進一步闡述，但不限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明：

圖1.熒光定量RT-PCR分析GhJAZ11-D在棉花組織中的表達。

R：根；H：下胚軸；S:莖；C：子葉；L：葉片；P：花瓣；A：花藥；0O：開花當(dāng)天胚珠。3O：開花后3天胚珠和纖維；6f：開花后6天纖維；9f：開花后9天纖維；12f：開花后12天纖維；15f：開花后15天纖維；18f：開花后18天纖維；20f：開花后20天纖維。

圖2.GhJAZ11-D蛋白在棉花細胞中的亞細胞定位分析。

構(gòu)建GhJAZ11-D與綠色熒光蛋白(eGFP)基因融合表達載體(GhJAZ11D:GFP)，轉(zhuǎn)化棉花，獲得轉(zhuǎn)化愈傷組織，在共聚焦顯微鏡觀察棉花愈傷組織細胞的GFP熒光，發(fā)現(xiàn)GFP熒光信號主要分布在細胞核中。A，顯微鏡明視野下的棉花愈傷組織細胞圖像；B，愈傷組織細胞中GFP熒光信號；C，圖A與圖B的重合圖像。

圖3.GhJAZ11-D與GhCOI1蛋白相互作用驗證

構(gòu)建pGBKT7-GhJAZ11-D和pGADT7-GhCOI1酵母表達載體，分別轉(zhuǎn)化酵母Y187和AH109菌株。利用酵母雙雜交技術(shù)，將帶有pGBKT7-GhJAZ11-D的Y187酵母細胞與帶有pGADT7-GhCOI1的AH109酵母細胞接合生殖，分析子代二倍體在SD/-Leu/-Trp基本培養(yǎng)基上生長情況(左圖)及SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/20μM COR選擇培養(yǎng)基上生長情況(右圖)。如右圖的結(jié)果所示，GhJAZ11-D與GhCOI1蛋白能夠發(fā)生相互作用，而GhJAZ11-D與pGBK7空載體(對照)不能發(fā)生相互作用。

圖4.GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白相互作用驗證。

A，酵母雙雜交技術(shù)驗證GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白相互作用。構(gòu)建pGBKT7-GhJAZ11-D和pGADT7-GhMYC2酵母表達載體，分別轉(zhuǎn)化酵母Y187和AH109菌株。將帶有pGBKT7-GhJAZ11-D轉(zhuǎn)化酵母Y187與帶有pGADT7-GhMYC2的轉(zhuǎn)化酵母AH109接合生殖，分析子代二倍體在SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長情況(左圖)及SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長情況(右圖)。如右圖的結(jié)果所示，GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白能夠發(fā)生相互作用，而GhJAZ11-D與pGBK7空載體(對照)不能發(fā)生相互作用。本實驗中pGADT1作為負對照。

B，pull-down實驗分析驗證GhJAZ11-D與GhMYC2的相互作用。His-GhJAZ11-D和GST-GhMYC2蛋白分別在大腸桿菌中表達純化(詳見實施方式)，然后進行pull-down分析。結(jié)果表明，GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白能夠發(fā)生相互作用(GST為負對照)。

圖5.過量表達GhJAZ11-D轉(zhuǎn)基因棉花表型分析。

A，熒光定量RT-PCR分析GhJAZ11-D基因在野生型和轉(zhuǎn)基因棉花株系(L32和L44)5DPA(左圖)和10DPA(右圖)纖維中的表達(DPA表示開花后的天數(shù))。B，野生型(WT)和GhJAZ11-D轉(zhuǎn)基因棉花株系(L32和L44)成熟纖維長度比較。C，野生型(WT)和GhJAZ11-D轉(zhuǎn)基因棉花株系(L32和L44)開花10天后種子(胚珠)的大小比較。D，野生型(WT)和GhJAZ11-D轉(zhuǎn)基因棉花株系(L32和L44)成熟纖維品質(zhì)檢測分析。結(jié)果表明GhJAZ11-D在棉花纖維中的過量表達可以促進棉花纖維伸長，提高纖維品質(zhì)。

具體實施方式：

一個棉花JAZ家族基因GhJAZ11-D全長序列的克隆鑒定及功能分析：

1. GhJAZ11-D基因及cDNA序列的分離鑒定

利用擬南芥JAZ家族基因和蛋白序列，通過比較分析，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)公開的陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST查詢，鑒定獲得30個棉花JAZ蛋白的基因，其中包括一條命名為GhJAZ11-D的基因序列。按照上述公共基因組數(shù)據(jù)庫中的該基因序列設(shè)計引物，以棉花基因組DNA為模板，采用PCR技術(shù)擴增獲得該基因的DNA全長序列，如SEQ ID NO.1所示，總長4559bp。根據(jù)該基因序列，設(shè)計引物，通過RT-PCR技術(shù)，以棉花纖維細胞總RNA為模板，分離獲得GhJAZ11-D全長cDNA序列，如SEQ ID NO.2所示，總長1044bp。

2.定量RT-PCR分析GhJAZ11-D基因的表達

利用RNA提取試劑盒(Qiagin)提取純化棉花不同組織和纖維的總RNA提取提取棉花纖維的總RNA。實時熒光定量RT-PCR研究基因的表達按照Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,Yang WC,2005.The Cotton ACTIN1gene is functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation.Plant Cell 17:859–875進行。首先，將棉花不同組織(根、下胚軸、莖、子葉、葉子、花瓣、花藥、開花后0天胚珠、開花后3天纖維、6天纖維、9天纖維、12天纖維、15天纖維、18天纖維、20天纖維)的總RNA(2μg/樣)用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)反轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后，以cDNA為模板，用基因特異的引物(GhJAZ11-D RT-P1和GhJAZ11-D RT-P2)和Real-time PCR Master Mix(TOYOBO,Japan)進行定量PCR反應(yīng)。以棉花GhUBI1基因作為RT-PCR反應(yīng)的內(nèi)標，計算目標基因表達水平的相對值。每一實驗都重復(fù)3次，統(tǒng)計分析實驗結(jié)果，見圖1，結(jié)果表明GhJAZ11-D基因在棉花不同組織以及不同的纖維發(fā)育階段都有一定的表達，而且在纖維起始期高量表達，在之后的纖維伸長期其表達量逐漸上升。

3. GhJAZ11-D蛋白的亞細胞定位分析

構(gòu)建pCAMBIA2300-GhJAZ11-D-eGFP植物表達載體，將該載體通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入LBA4404農(nóng)桿菌中，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化愈傷組織細胞。將培養(yǎng)3個月的棉花愈傷組織細胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光，進行亞細胞定位分析，見圖2，亞細胞定位分析表明，GhJAZ11-D蛋白定位于細胞核中。

4.酵母雙雜交技術(shù)驗證GhJAZ11-D與GhCOI1蛋白相互作用

構(gòu)建pGBKT7-GhJAZ11-D載體和pGADT7-GhCOI1載體，分別轉(zhuǎn)化酵母Y187和AH109細胞。將檢測得到的陽性酵母菌落進行小規(guī)模的酵母結(jié)合實驗，將二倍體子代酵母細胞涂布在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/20μM COR選擇培養(yǎng)基上。如果在上述選擇培養(yǎng)基上能夠生長，表明GhJAZ11-D與GhCOI1之間能夠依賴于JA-Ile的類似物COR相互作用。否則，表明兩者不能相互作用，結(jié)果見圖4。如圖4結(jié)果所示，GhJAZ11-D與GhCOI1蛋白能夠發(fā)生相互作用，而GhJAZ11-D與pGBK7空載體(對照)不能發(fā)生相互作用。

5.酵母雙雜交和pull-down技術(shù)驗證GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白相互作用

(1)酵母雙雜交實驗:構(gòu)建pGBKT7-GhJAZ11-D載體和pGADT7-GhMYC2載體，分別轉(zhuǎn)化酵母Y187和AH109細胞。將檢測得到的陽性酵母菌落進行小規(guī)模的酵母結(jié)合實驗，將二倍體子代酵母細胞涂布在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp選擇培養(yǎng)基上。如果在選擇培養(yǎng)基上能夠生長，表明GhJAZ11-D與GhMYC2之間能夠相互作用。否則，表明兩者不能相互作用。結(jié)果顯示GhJAZ11-D與GhMYC2結(jié)合后形成的二倍體酵母細胞能夠在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長，說明在酵母系統(tǒng)中，GhJAZ11-D能與GhMYC2發(fā)生相互作用。

(2)pull-down實驗:構(gòu)建pET32a-GhJAZ11-D和pPGH-GhMYC2載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3細胞，誘導(dǎo)表達蛋白。將表達純化的His-GhJAZ11-D蛋白及GST蛋白(對照)與還原型谷胱甘肽-瓊脂糖柱子一起冰上振蕩孵育1h；同樣，His-GhJAZ11-D蛋白和GST-GhMYC2蛋白也與還原型谷胱甘肽-瓊脂糖柱子在相同條件下孵育。孵育完成后，用GST蛋白純化方法進行純化，隨后取20μL上清液進行SDS-PAGE電泳分析，His-GhJAZ11-D蛋白作為對照(Input)，完成后進行Western-blotting分析，將His抗體作為一抗，鼠抗作為二抗。如果出現(xiàn)與對照(Input)一樣大小的條帶(蛋白信號)，說明GhJAZ11-D與GhMYC2蛋白在體外能發(fā)生相互作用。否則，則說明兩者不能相互作用。pull-down實驗結(jié)果表明：GhJAZ11-D蛋白與GhMYC2蛋白在體外能發(fā)生相互作用。

6. GhJAZ11-D過量表達(OE)轉(zhuǎn)基因棉花表型分析

構(gòu)建CaMV 35S啟動子驅(qū)動的pBI-GhJAZ11-D植物表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。利用農(nóng)桿菌浸染棉花下胚軸外植體，共培養(yǎng)2天后，將下胚軸外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)并篩選轉(zhuǎn)化愈傷組織。將該愈傷組織經(jīng)過8–10個月的繼代培養(yǎng)后，誘導(dǎo)分化出胚性愈傷組織和體細胞胚，體細胞胚進而萌發(fā)再生出轉(zhuǎn)基因棉花小植株。將再生的棉花小植株移栽至土中，生長發(fā)育至開花結(jié)實。提取棉花基因組DNA，利用PCR技術(shù)檢測鑒定陽性的轉(zhuǎn)基因棉花植株。提取開花5天和10天后的棉花纖維RNA，利用定量RT-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因棉花中GhJAZ11-D基因表達水平。然后，選擇不同表達水平的轉(zhuǎn)基因棉花株系進行表型及遺傳分析，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，GhJAZ11-D在棉花纖維中的過量表達導(dǎo)致纖維長度顯著增加，品質(zhì)有所改善。

說明書核苷酸和氨基酸序列表

＜110＞ 華中師范大學(xué)

＜120＞ 棉花GhJAZ11-D基因鑒定及應(yīng)用

＜160＞ 3

＜210＞ 1

＜211＞ 4559bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 棉花 (Gossypium hirsutum)

＜400＞ 1

agtgtagatc taacctaaat aagcttgaat agccttttga agatcgggat acttctttcc 60

ggcacattcc ttgagcatcg actcgaaagc ccggctcaca aatccaccag ccgccatttc 120

gatctaagcc ggtgcttcga acacgataat tccggagttc ccttctctct caccctacta 180

aataaaaaaa taataatgcc gaaatggagg aattaagcaa tgatttttaa aaaagttgaa 240

gcagatcgtt gaagaagata gttaggatct acgagtgtat gatagcagaa ataatataaa 300

caacatacaa aaatgaatgt taccgcgctt tgttctaaga gggactaaat ttggagaaga 360

aattagaaaa agaaaagata ttgaagatct ggatacaaaa gagcagagca gatcagatca 420

gatgagatct gttgaaaatt gaattgatga tgatattctt ttacgaatat gagcgattac 480

tgggctttta gttgtgatga gcccagacga tgctcggttt tggcgtccaa aacagaacta 540

ataacgagca gatgatttgg agaatctttg gattaatttt tgttttattc aagatttgac 600

ctaaactttt cttacttttt cattttcatt aagctagatt ttgtttttaa catctttagt 660

attaaataag gttttgatta ttctcaactt aaatatttaa cttatttttt atattacacc 720

ttacaatata ctcgttatac tcacaatatt gttgcgaagt ttaaaaaaaa atcaattttt 780

tttatttttt cattttctct tgtatatatc tcttagttga ttgttgttaa actttttttt 840

atcattttca tttcaattat ttgagagaga gaaagagagc acttaagatt ttctagattt 900

tttagataac ttcttttctt tattgtttac ctcttttctt tgtattgtaa aagctatttg 960

agatatttta gatatcttca aaagcaaaat caacaaattt ttgtaggggt caaaattaaa 1020

ttgtaatttt tacgatagta aaaatatatt tttttaaatg attaaatcaa aattttatca 1080

tttttagagg aaccaatatg taattttatc tttattaatt taaaatttaa aaattttaaa 1140

tagacagaat ggaaaatttt tcatattagg ggaggcctgg gccttaccat cccccctaga 1200

tttgccccta tataggatct agttaagcca taaaaatttg gggaaggatt taccttagca 1260

tcatgaaaaa attacagatt gtaaatgtta tatattctcc ttgagaggta tcgattcaaa 1320

tataatcaat tgagaaatct ttagttgaga tatattaaag tgaatgtagg taattggggc 1380

agaataatta taaatcgaaa tgttcaagtt tttcatttat ttactcattc tttataaaat 1440

tttataaaga attttaaaat atcaattcac ccctcttgat attttcgagt ctaacaattg 1500

ttattctaat acaatatcaa atttttacat agtactaaca ttttagatta tcaaaacaaa 1560

cacaccatta gtttatcaaa ccatgtctaa aacacaaatc aataataaaa agattaaaac 1620

taataataag attgacacaa aatttaaaga cttaatattc taatagaaaa tattatacaa 1680

actataaaca gtcacccttg taattataac tcattgtgtg agtttttggc atgattatct 1740

aaatcgggcc aaatcgatcc attagattga gaattaatta aaatatcgat acggaaaaaa 1800

gctttagact aactgaattg tgaattagta caaatagatt gaattaacaa tggaataaat 1860

tgagataatt attaatattt ttatttttat aaatttataa taaattattt aattaaaccg 1920

ttaccttata aattcgacca tcaatccagg gtaaaaaaag agtccagggt cctgaatgat 1980

tgacacgttc caatcatcaa aacaaccacg acccttggat tggttcacgt gctttcactt 2040

tcacgtactt ttttattaat atattttatt cttttaaaat tccaaacaaa caatgtacct 2100

ttttttttta ttgatttcat ttccatatat ctttaaaacc aaattttggt ctgcctatag 2160

caagagtgaa aaaaatttta aaatttatca acgaaaagaa aggtcaaaag tctggtttcc 2220

atggaagaag aagctgaatc acgcgaggaa gtcaagccta acgtcgtcgt taaagagact 2280

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tttctttccc agaaaatatc ccataactgg taagctttaa ttgtattcat tccgtaaaaa 2400

aaaggagaca aatgtttctt tccggatctg ggtcttgata tatagctgtt taattatact 2460

cgatttgatg ttttaaaatg gaagtcttga tacatagtga aatttagtgc ttaattcatt 2520

accctaatct catctgtaga ggacaaattg aacatggttt taaaatgtac tactagtagt 2580

tttttttatt gatgttaaat ggtttgggct ggatttagtt agtgttaatc acttggaagc 2640

tttgaattcc cattgtataa aaaacggcga cctgatttct ttttatggta gtatttaaaa 2700

aaaacaaaaa aaaagggttt gtttggttat attttaggtt cgcatggtta cttactttag 2760

agggcttcca attctctctc tctctatatg tgtgtgtgtg tgtgtattcc cttttgatga 2820

aacctaggag atgttcatat gtcatattga aatttatact tatcggtgac tgactcagtt 2880

gagcatatgg tattcgattg tattgaagtt atagattcca taagaaaaat atatattagg 2940

aagtgcacat gcttgttcta tgttgtgttt cctcttcttt tcttttcttt tttttcattt 3000

aaaaccattt tgttatagcg aaaaattgta aagtattcaa gtgtcaccgt cttgacctga 3060

cccaacttgc agggcatcag gtgtgttgcg atagtataat cctttttggg cacccacagg 3120

tccctcaagg ttttgctacc ttcatatgtg actagccctc aaggtcccgc aggacagggc 3180

cgtatcatga tagcctaaac ctcctgttcg catatcattc tttgaagcaa aaattgttat 3240

ttttttctct attgcatcgc atgtagactt tacccctaaa gtaaattgtg cccagtagat 3300

ctttctcatc catgagtgaa gcaaaagggc acattagtca tatttctgca cacttctata 3360

atgttgtaag attttattct gctgttgtac tagttcccta ccgattctgg catctggagt 3420

aaataccaca agccttgctc aatcccaact caccatcttc tatggcggaa aagtttctgt 3480

atttgatgca atttccgctg aaaaggttgg cctttactta acattttaga atgttactat 3540

gttttggtag gatgagattt ttattccaaa gttaaccatc gatccatgtc tgtcagattc 3600

aagaaattat gcttattgct gctgctgtgg ctgctgctga tgttggctct gttgacatga 3660

agaatgctgc aaccgattat gccaccattt cacctgctct tacaaggtgt ccttcacttc 3720

aaagtactgc aactgctttg gcttcgccac aggcacagtt gtatcctttc cccaggacat 3780

cttttagcaa actgcaagct ggtaattcaa ataattacga ggttcaaatg caaaatattc 3840

tatgattttc atttttggtg catgtaagct aataatgtgg catcatgatt atgtgaatat 3900

caattggatc agaactacca attgcaagga gacactcact tcagcgtttt cttgagaagc 3960

ggcgggacag gtactcctcc gatcgtactc catcatttta ctgtttactt tataccccta 4020

agctatggca agtgtagtta tgtgtctgtt cccttttgta ggctggtgaa caagaaccca 4080

tatcctggtc catcaacacc aaaaatggtt gatggcacca aagctgacgt gagtgccaca 4140

acttcaccag agtctggctg cttcaaggca tcacccattc gtcaagaaga tatccaacca 4200

aaagctccag ctcatgttgc gtaaagctaa gcatatagga ttccttatat atatatattt 4260

gataaaaact gaatctagct ctgttattgt aagttacaaa gtgcagagga atacatctga 4320

tctgccactg gagttaggtg tggatagcaa gtgtacaatt aaacaggtct catggtagga 4380

tctgtccact tgtttcccta ttgccttctt gggcagcagt tttgatgttt cctaaacctg 4440

gacaccctct ctctgatctg cctgacaaat aacatttgcc atgtatgtat gattctctct 4500

gttctatggg tatgcaaaga ctgctaattt gtgtgtaacg tgttccaact ttgtacaat 4559

＜210＞ 1

＜211＞ 1044bp

＜212＞ DNA

＜213＞ 棉花 (Gossypium hirsutum)

＜400＞ 2

atggaagaag aagctgaatc acgcgaggaa gtcaagccta acgtcgtcgt taaagagact 60

aatggagata ttgtcggcga taacgatgca ggaaaattgg gtaccattga aacccctgat 120

tttctttccc agaaaatatc ccataactgt tccctaccga ttctggcatc tggagtaaat 180

accacaagcc ttgctcaatc ccaactcacc atcttctatg gcggaaaagt ttctgtattt 240

gatgcaattt ccgctgaaaa gattcaagaa attatgctta ttgctgctgc tgtggctgct 300

gctgatgttg gctctgttga catgaagaat gctgcaaccg attatgccac catttcacct 360

gctcttacaa ggtgtccttc acttcaaagt actgcaactg ctttggcttc gccacaggca 420

cagttgtatc ctttccccag gacatctttt agcaaactgc aagctgaact accaattgca 480

aggagacact cacttcagcg ttttcttgag aagcggcggg acaggctggt gaacaagaac 540

ccatatcctg gtccatcaac accaaaaatg gttgatggcg ccaaagctga cgtgagtgcc 600

acaacttcac cagagtctgg ctgcttcaag gcatcaccca ttcgtcaaga agatatccaa 660

ccaaaagctc cagctcatgt tgcgtaaagc taagcatata ggattcctta tatatatata 720

tttgataaaa actgaatcta gctctgttat tgtaagttac aaagtgcaga ggaatacatc 780

tgatctgcca ctggagttag gtgtggatag caagtgtaca attaaacagg tctcatggta 840

ggatctgtcc acttgtttcc ctattgcctt cttgggcagc agttttgatg tttcctaaac 900

ctggacaccc tctctctgat ctgcctgaca aataacattt gccatgtatg tatgattctc 960

tctgttctat gggtatgcaa agactgctaa tttgtgtgta acgtgttcca actttgtaca 1020

ataaagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1044

＜210＞ 1

＜211＞ 228

＜212＞ PRT

＜213＞ 棉花 (Gossypium hirsutum)

＜400＞ 3

Met Glu Glu Glu Ala Glu Ser Arg Glu Glu Val Lys Pro Asn Val

1 5 10 15

Val Val Lys Glu Thr Asn Gly Asp Ile Val Gly Asp Asn Asp Ala

20 25 30

Gly Lys Leu Gly Thr Ile Glu Thr Pro Asp Phe Leu Ser Gln Lys

35 40 45

Ile Ser His Asn Cys Ser Leu Pro Ile Leu Ala Ser Gly Val Asn

50 55 60

Thr Thr Ser Leu Ala Gln Ser Gln Leu Thr Ile Phe Tyr Gly Gly

65 70 75

Lys Val Ser Val Phe Asp Ala Ile Ser Ala Glu Lys Ile Gln Glu

80 85 90

Ile Met Leu Ile Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Asp Val Gly Ser

95 100 105

Val Asp Met Lys Asn Ala Ala Thr Asp Tyr Ala Thr Ile Ser Pro

110 115 120

Ala Leu Thr Arg Cys Pro Ser Leu Gln Ser Thr Ala Thr Ala Leu

125 130 135

Ala Ser Pro Gln Ala Gln Leu Tyr Pro Phe Pro Arg Thr Ser Phe

140 145 150

Ser Lys Leu Gln Ala Glu Leu Pro Ile Ala Arg Arg His Ser Leu

155 160 165

Gln Arg Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asp Arg Leu Val Asn Lys Asn

170 175 180

Pro Tyr Pro Gly Pro Ser Thr Pro Lys Met Val Asp Gly Ala Lys

185 190 195

Ala Asp Val Ser Ala Thr Thr Ser Pro Glu Ser Gly Cys Phe Lys

200 205 210

Ala Ser Pro Ile Arg Gln Glu Asp Ile Gln Pro Lys Ala Pro Ala

215 220 225

His Val Ala

228