本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種新的水稻抗逆相關(guān)基因OsSCAMP13及其編碼蛋白與應(yīng)用，本發(fā)明還提供了一種獲取OsSCAMP13基因的方法，利用此基因可培育抗旱能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。

背景技術(shù)：

植物的生長(zhǎng)受到眾多環(huán)境因素的影響，其中一些不利的非生物脅迫（包括干旱、鹽害、低溫、高溫等）對(duì)作物的產(chǎn)量造成了極大的影響，因此，利用基因工程技術(shù)，將一些抗逆相關(guān)基因轉(zhuǎn)入到優(yōu)良作物品種中，培育既高產(chǎn)又抗逆且優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物新品種是應(yīng)對(duì)水資源短缺、保障糧食安全的有效途徑之一。深入發(fā)掘并研究植物節(jié)水抗旱基因，是解析植物抗旱機(jī)制的基礎(chǔ)工作，為培育節(jié)水抗旱作物提供理論依據(jù)和基因資源。

細(xì)胞膜上存在兩類(lèi)主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即：載體蛋白（carrier protein）和通道蛋白（channel protein）。載體蛋白能夠與特定溶質(zhì)結(jié)合，通過(guò)自身構(gòu)象的變化，將與它結(jié)合的溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜的另一側(cè)。OsSCAMP13屬于一種分泌的載體蛋白（Secretory carrier membrane proteins，SCAMP），這種蛋白最初被確定為哺乳動(dòng)物的外分泌腺分泌小泡組件，但是后來(lái)發(fā)現(xiàn)它們?cè)谡婧松镏袩o(wú)處不在(Fernandez-Chacon and Sudhof, 2000)。這種蛋白能夠在質(zhì)膜和液泡之間來(lái)回穿梭(Brand and Castle, 1993)。水稻、擬南芥以及豌豆中都發(fā)現(xiàn)了SCAMP，該蛋白在其它植物中也應(yīng)該存在(Fernandez-Chacon and Sudhof, 2000)。SCAMP是否參與了植物抗逆則鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的水稻抗逆相關(guān)基因OsSCAMP13，可響應(yīng)逆境脅迫。

本發(fā)明的另一目的是提供利用水稻基因OsSCAMP13培育抗逆能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明從水稻中分離克隆的一段完整編碼區(qū)段的DNA片段，對(duì)這個(gè)基因編碼的蛋白序列進(jìn)行分析表明，它屬于一個(gè)分泌載體膜蛋白，因此命名為OsSCAMP13。

本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含OsSCAMP13基因的DNA片段，該基因能響應(yīng)脫水、PEG、高鹽、低溫、高溫、H2O2、ABA、GA、KT，發(fā)生表達(dá)變化。

本發(fā)明所述OsSCAMP13基因DNA序列為序列表SEQ ID NO:1所示，或者與SEQ ID NO:1同源度達(dá)90%的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO:1所示序列的亞片段。

本發(fā)明所述OsSCAMP13基因DNA序列還可為序列表SEQ ID NO:2所示，或者與SEQ ID NO:2同源度達(dá)90%的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO:1所示序列的亞片段。

一種抗逆性水稻，其包含有上述OsSCAMP13基因編碼的蛋白。

所述蛋白的氨基酸序列還包含下列之一：

（a）所述氨基酸序列為序列表SEQ ID NO:3所示；

（b）所述氨基酸序列為SEQ ID NO:3序列的同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體或誘導(dǎo)突變體。

OsSCAMP13基因編碼的蛋白還包含上述的OsSCAMP13基因在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的編碼DNA。

本發(fā)明獲得OsSCAMP13基因的方法如下：（1）、采用已克隆的OsSCAMP13基因?yàn)樘结?，從cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。（2）、采用PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)，從基因組，mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到OsSCAMP13基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsSCAMP13基因序列，將OsSCAMP13基因序列與引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體連接后轉(zhuǎn)化植物，可獲得抗逆能力提高的轉(zhuǎn)基因植株。

OsSCAMP13基因在構(gòu)建到表達(dá)載體上時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)啟動(dòng)子。

OsSCAMP13基因在構(gòu)建到表達(dá)載體上時(shí)，可以使用增強(qiáng)子OsSCAMP13基因需要與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是，還提供了包含OsSCAMP13基因的重組載體。攜帶OsSCAMP13基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞。

包含本發(fā)明中的OsSCAMP13基因的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)的多種植物，培育抗旱、抗旱的植物品種。

本發(fā)明還提供一種OsSCAMP13基因在水稻抗逆性的應(yīng)用，水稻抗逆性的應(yīng)用中的OsSCAMP13基因克隆自水稻第4染色體的抗旱QTL區(qū)段，在脫水、PEG、高鹽、低溫、高溫、H₂O₂、ABA、GA、KT處理下的基因可響應(yīng)逆境脅迫及外源激素的超表達(dá)，其中，超表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抵抗干旱脅迫的能力。

本發(fā)明的技術(shù)效果是，水稻基因?qū)δ婢钞a(chǎn)生明顯響應(yīng)，可應(yīng)用于在植物抗逆育種，提高植物的抗逆性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的OsSCAMP13基因在苗期冷、熱、鹽、PEG、H2O2和外源ABA、GA、KT處理下的表達(dá)水平。

圖2為本發(fā)明的OsSCAMP13基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的苗期甘露醇、NaCl處理分析。

圖3為本發(fā)明的OsSCAMP13基因超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的成株期干旱脅迫處理。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1

水稻OsSCAMP13基因的克隆

1．幼苗培育

將旱稻品種IRAT109置于30℃萌發(fā)48小時(shí)，然后播種于溫室中，待水稻葉片為3-5片時(shí)，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。

2．RNA提取與第一鏈cDNA合成

RNA的提?。核悠吩谘欣徶杏靡旱鋬龊笱心コ煞蹱?，加入盛有1mL TRNzol-A⁺試劑的2mL EP管，充分振蕩后，室溫放置5min，之后加0.2mL氯仿，劇烈震蕩15s后，室溫放置3min；后在4℃，12000rpm離心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等體積異丙醇沉淀RNA，加100μL RNase-free ddH₂O溶解。電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。

反轉(zhuǎn)錄之前需用DNaseI消化所提取樣品，反應(yīng)體系如下：

37℃反應(yīng)15min后，加入0.25μl 0.1M EDTA（保證終濃度>2mM），70℃溫育10 min終止反應(yīng)，短暫離心后置于冰上備用。

第一鏈cDNA的合成參照Promega 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)A3500操作手冊(cè)，具體步驟如下：

（1）DNaseI消化過(guò)的樣品中依次加入下列各試劑配制20μL 的反應(yīng)體系：

（2）將上反應(yīng)體系于42℃溫育 15 min；

（3）然后95℃加熱5min，使AMV反轉(zhuǎn)錄酶失活并阻止其與DNA結(jié)合；

（4）4℃或冰上放置5 min。

制備好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3．基因的克隆

從水稻第4染色體的抗旱QTL區(qū)段內(nèi)定位到候選基因LOC_Os04g50890，對(duì)水稻基因組及全長(zhǎng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，獲得其對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA（AK058642）。根據(jù)預(yù)測(cè)信息設(shè)計(jì)上下游引物F1:5’- ATGCATCACGACCCCAACC-3’和R1:5’-TCACTTGTTCCCTCTGAAGTACATG-3’，從cDNA中直接克隆獲得了OsSCAMP13基因，回收，連接到pEASY-Blunt Simple載體上，用M13F或M13R作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye, Perkin-Elmer, USA)的方法，在ABI 3730測(cè)序儀(Perkin-Elmer, USA)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果同SEQ ID NO:2比對(duì)確認(rèn)，SEQ ID NO:2為構(gòu)建超表達(dá)載體所用序列。其中SEQ ID NO:1為其DNA序列，SEQ ID NO:2為該基因的CDS序列，CDS翻譯即得該基因的氨基酸序列SEQ ID NO:3。

實(shí)施例2

水稻基因OsSCAMP13在逆境脅迫下的表達(dá)分析

1. 逆境脅迫處理

選取飽滿(mǎn)的日本晴種子，蒸餾水清洗，3% NaClO消毒10 min后清洗干凈，30℃催芽，種子露白后轉(zhuǎn)放到發(fā)芽盒內(nèi)水培生長(zhǎng)，三葉期后施加營(yíng)養(yǎng)液（國(guó)際水稻所標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)液）。在28℃，16h/8h的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，至四葉期時(shí)進(jìn)行各種逆境和激素處理：脫水、15% PEG6000、150mM NaCl、10% H₂O₂、4℃、42℃和100μM 脫落酸(ABA) 、100μM 赤霉素(GA) 、100Μm 激動(dòng)素(KT)。分別在脅迫前、脅迫后3h、6h、12h、24h對(duì)逆境處理材料進(jìn)行取樣。在處理前、處理后0.5h、1h、2h、4h、8h、812h、24h對(duì)處理樣品取樣。所有處理和取樣過(guò)程都是在持續(xù)光照的條件下進(jìn)行。

2. RNA提取與第一鏈cDNA合成

同實(shí)施例1。

3.定量PCR分析

基因表達(dá)的定量分析使用Takara公司的SYBR^?Premix Ex Taq^TM（Perfect Real Time）試劑盒和Bio-Rad cfx96定量PCR儀進(jìn)行。根據(jù)OsSCAMP13全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)定量引物。以水稻持家基因actin（GenBank accession No. AY212324）為參照基因，根據(jù)其cDNA序列設(shè)計(jì)引物。所用基因定量前引物為F2:5’- GTGCCAATGGAGGATAAGAA-3’。

基因定量后引物R2:5’- GGCAATGTCATGGTGAATG-3’，Actin F:5’- CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’，Actin R:5’- GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’。20 μL反應(yīng)體系的配制：

反應(yīng)條件為：95℃ 30s，然后在95℃ 5s，60℃ 31s，循環(huán)40次，并增設(shè)Dissociation Stage。設(shè)定在每個(gè)循環(huán)中60℃ 31s時(shí)收集數(shù)據(jù)，其它具體操作按儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。計(jì)算目的基因與參照基因的平均CT值以及△CT值，利用2^-ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果分析，最后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相對(duì)表達(dá)量柱狀圖。

定量分析結(jié)果顯示，如圖1所示，該基因能夠受到脫水、PEG、高鹽、低溫、高溫、H₂O₂、ABA、GA、KT的誘導(dǎo)表達(dá)，因而該基因在逆境應(yīng)答反應(yīng)中可能起著重要的作用。

實(shí)施例3

水稻基因OsSCAMP13超量表達(dá)轉(zhuǎn)化水稻

1．利用GATEWAY重組克隆技術(shù)構(gòu)建含OsSCAMP13基因的超量表達(dá)載體：

以實(shí)施例1中已獲得含有旱稻IRAT109的OsSCAMP13基因的pEASY-Blunt Simple載體為模板，

用前引物

F3:5’-AAAAAGCAGGCTATGCATCACGACCCCAACC-3’，后引物R3:5’-AGAAAGCTGGGTTCACTTGTTCCCTCTGAAGTACATG-3’進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。再利用通用引物attB1 adapter: 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，attB2 adapter: 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，通過(guò)BP反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物片斷克隆到入門(mén)載體pDONR207，篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)LR反應(yīng)，將目的基因重組克隆到GATEWAY超表達(dá)載體pCB4004（該載體是在pCB2004基礎(chǔ)上，將除草劑抗性基因替換為潮霉素抗性基因改造而來(lái)，命名為pCB4004）。具體過(guò)程如下：

（1）第一輪PCR擴(kuò)增

20μl反應(yīng)體系：

擴(kuò)增程序：

Step Time Temperature Cycles

預(yù)變性 2min 98℃ 1X

變性 15s 98℃

退火 30s 60 ℃ 10X

延伸 1 min/kb 72℃

（2）第二輪PCR擴(kuò)增

取上述PCR產(chǎn)物10uL作為模板，加入到下面PCR配置的40uL反應(yīng)體系。

緊接著嚴(yán)格按照下面的循環(huán)來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

Step Time Temperature Cycles

預(yù)變性 1min 98℃ 1X

變性 15s 98℃

退火 30s 45 ℃ 5X

延伸 1 min/kb 72℃

然后設(shè)置下一步的PCR程序。

Step Time Temperature Cycles

變性 15s 98℃

退火 30s 55℃ 25X

延伸 1 min/kb 72℃

最后取5ul電泳檢測(cè)PCR質(zhì)量。

（1） PCR產(chǎn)物的回收

采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

（2）BP重組反應(yīng)

BP反應(yīng)的目的在于將含有attB接頭的PCR產(chǎn)物重組到含有attP的供體載體上，以產(chǎn)生入門(mén)克隆。重組反應(yīng)可在室溫配制混勻，0.5mL的離心管中進(jìn)行。反應(yīng)體系如：

Components Sample

attB-PCR product（>10ng） 3μL

pDONR207 vector (150 ng/μL) 1μL

5×BP Clonase Clonase enzyme mix 1μL

25℃溫浴16h左右，隨后將BP反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。重組大腸桿菌需在含慶大霉素平板上生長(zhǎng)。接著挑取單菌落以進(jìn)行PCR驗(yàn)證，最后抽提質(zhì)粒。

（3）LR重組反應(yīng)

重組反應(yīng)可在室溫配制，0.5mL的離心管中進(jìn)行。反應(yīng)體系如下：

Components Sample

Entry clone（50-150ng） 3 μL

Destination vector（150 ng/μL） 1 μL

5×LR Clonase enzyme mix 1 μL

25℃溫浴16h左右，然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化完成的大腸桿菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生長(zhǎng)。接著挑取單菌落，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，然后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與該基因cDNA序列比對(duì)以確認(rèn)序列正確與否，最后提取質(zhì)粒，即可轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

2. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

根癌農(nóng)桿菌（EHA105）感受態(tài)細(xì)胞的制備：

根癌農(nóng)桿菌菌液于28℃培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，4℃離心收集菌體，用500μL、0.1mol/L冰浴CaCl₂重懸，冰浴30 min后離心，去上清，用100μL，0.1 mol/L冰CaC1₂重懸后，于4℃保存。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（凍融法）：

（1）向感受態(tài)農(nóng)桿菌（100μL）中加入5μL植物表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰水浴30 min后，于液氮中速凍冷激2 min；

（2）取出，加入400~800μL YEP培養(yǎng)液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3-5 h；

（3）室溫離心（5000 r/min，5min），保留100μL上清重懸菌體，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含Kan)上，28℃倒置培養(yǎng)2 天直至長(zhǎng)出合適大小的菌落。

（4）挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性菌株。

3．愈傷誘導(dǎo)：種子用無(wú)菌水漂洗15-20min，再用75%的乙醇消毒1min，然后用1.5%有效濃度的次氯酸鈉溶液振蕩消毒20 min。最后再用無(wú)菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干接種在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)2周。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：采用表1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，加入0.3 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 mL 2,4-D (濃度1 mg/mL)，配成1 L溶液，調(diào)pH至5.9，加入7 g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。

4. 繼代培養(yǎng)：把胚性愈傷組織切下，接入繼代培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)2周。

繼代培養(yǎng)基：采用表1的繼代培養(yǎng)基，加入0.5 g脯氨酸、0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2 mL2,4-D（濃度1 mg/mL），配成1 L溶液，調(diào)pH至5.9，加入7 g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。

5. 農(nóng)桿菌浸染和愈傷組織共培養(yǎng)：培養(yǎng)農(nóng)桿菌挑，取陽(yáng)性單菌落，在1 mL含抗生素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)過(guò)夜；取以上培養(yǎng)物，加入50 mL含抗生素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)至OD600=0.6-1.0。將獲得的農(nóng)桿菌菌液離心，將收集到的菌體加入懸浮培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)30 min至OD600=0.6-1.0。然后將愈傷組織放入含有農(nóng)桿菌菌液的懸浮培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)20 min左右。將愈傷組織在滅菌濾紙上晾干，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)5 d。

懸浮培養(yǎng)液：采用表1的懸浮培養(yǎng)液，加入0.08 g水解酪蛋白酶、2 g蔗糖和0.2 mL 2,4-D（濃度1 mg/mL），配成100 mL溶液，調(diào)pH至5.4，分成兩瓶（每瓶50 mL），高溫高壓滅菌。使用之前加入1 mL 50%的葡萄糖和100 μL AS（100 mM）。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：采用表1的共培養(yǎng)培養(yǎng)基，加入0.8 g水解酪蛋白酶、20 g蔗糖和3.0 mL 2,4-D （濃度1 mg/mL），配成1 L溶液，調(diào)pH至5.6，加入7 g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入20 mL 50%的葡萄糖和1 mL AS（100 mM）。

6．篩選培養(yǎng)：共培養(yǎng)3d后，選取好的愈傷組織，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)2周，篩選兩次。

篩選培養(yǎng)基：采用表2的篩選培養(yǎng)基，加入0.6 g水解酪蛋白酶、30 g蔗糖和2.5 mL 2,4-D （濃度1 mg/mL），配成1 L溶液，調(diào)pH至6.0，加入7 g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入1 mL Hn和1 mL Cn（100 ppm）。

7．分化培養(yǎng)：挑取胚性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基，24℃，16 h/8 h光暗培養(yǎng)誘導(dǎo)分化芽（4-6周）。

分化培養(yǎng)基：采用表2的分化培養(yǎng)基，加入2.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L KT、0.2 mg/L NAA、0.2 mg/L IAA、1.0 g水解酪蛋白酶和30 g蔗糖，配成1 L溶液，調(diào)pH至6.0，加入7 g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。

8．生根培養(yǎng)：待芽長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，將幼芽切下，插入生根培養(yǎng)基中，25℃左右，16 h/8 h光暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根。

生根培養(yǎng)基：采用表2的生根培養(yǎng)基，加入30 g蔗糖，配成1L溶液，調(diào)pH值至5.8，加入7 g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。

9．轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)：待根系發(fā)達(dá)后，打開(kāi)試管口，加入無(wú)菌水煉苗2-3d后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始遮蔭避風(fēng)，待植株健壯后進(jìn)行常規(guī)田間或溫室管理培養(yǎng)。

表1 基本培養(yǎng)基成分1

表2 基本培養(yǎng)基成分2

實(shí)施例 4

轉(zhuǎn)基因水稻的苗期甘露醇、NaCl處理

將超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系種子去殼消毒，經(jīng)過(guò)75%酒精處理1 min，1.5%NaClO處理20 min，無(wú)菌水清洗5次，在含有50mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，野生型對(duì)照晚一天播于不含潮霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基上。待發(fā)芽2～3天后挑選發(fā)芽好且長(zhǎng)勢(shì)一致的種子，分別轉(zhuǎn)移到含有0，150 mmol/L甘露醇或150 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室生長(zhǎng)7～10天后觀察表型，并測(cè)量植株的根長(zhǎng)。處理過(guò)程中觀察表型并拍照。

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，無(wú)甘露醇處理的正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株根長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異；在滲透脅迫后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)與野生型植株的根長(zhǎng)達(dá)極顯著差異，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別為8.56cm、9.66cm、9.45cm，而野生型植株為7.71cm。無(wú)NaCl處理的正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株根長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異；在高鹽脅迫后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)與野生型植株的根長(zhǎng)達(dá)顯著或者極顯著差異，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別為7.76cm、8.73cm、8.18cm，而野生型植株為7.06cm。該結(jié)果表明超表達(dá)OsSCAMP13提高了水稻苗期對(duì)高滲脅迫以及高鹽脅迫的抗性。

實(shí)施例 5

轉(zhuǎn)基因水稻成株期干旱脅迫。

將轉(zhuǎn)基因及野生型ZH11種子于30℃萌發(fā)48小時(shí)，發(fā)芽后，將其播種于PVC管中，每根管中播種1粒種子。保持正常水分使其生長(zhǎng)，至幼穗分化期去除管中積水并不再補(bǔ)充，使其慢慢進(jìn)入干旱脅迫。如圖3所示，干旱脅迫20天左右，野生型ZH11葉片干枯卷葉并出現(xiàn)白穗，而轉(zhuǎn)基因植株則能夠正常生長(zhǎng)。該結(jié)果表明超表達(dá)OsSCAMP13提高了水稻成柱期對(duì)干旱脅迫的抗性。

本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易的掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心

<120> OsSCAMP13基因及編碼蛋白與抗逆性的應(yīng)用及獲取方法

<130> OsSCAMP13

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4371

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

cgttggatcc ctcgtgctcc gcaatctcag ccgtccgttt ccccctatag tcccccttac 60

ctccccttct acagttctac gaagtacgat ccaaacacca gcggcgaagg cgacgaagac 120

gagggcaaaa acaccagaag gggaaaactt ttgctctccc ggcgatctcg agatctctca 180

agatggtaat cccccatcca atttctctct acttttcctc ggatttgcgc cgcactcccg 240

atcgatgtct tcgacgcggt taactgcgat ggatttgcgc gagatcggat cctatggtct 300

agaatttcga gtcgattagg cttttttttg ggtggtgttt tgcgttgggt gatttcagat 360

tggaagtaga acggggggac gaggattctg agaagaatct actggtcttt gtcgtactga 420

atgctctcga tttcctcctg ttttgatcgc gtctgtgtgg tttggtctgg tcaggtggtg 480

ctgcaaccag atccgtttct gagcgagttg acgagcatgt acgagcggag cacggagaag 540

ggatctgtct gggtcaccat gaagcgatgt gagtgcgcgc tttcatctgg caatctggtt 600

tgtgatttgg gtggctgaag aactgatgct tgagttgatg ggggttgttt gatatgtgca 660

gcatcgatga agtgccaggc aaggttgaag aagatggcgg cgaagggaga ggcagtggag 720

taccggtgcc tcgtccgtgc caccgatggc aagaagaaca tctgcaccgc ggtacagtga 780

ctgtcctatt gtcctttgct gtgctgattt tgaattatta ttttgcttat ggttgttagt 840

tttgtgcata atggttaccg attatctggt attcgatgct aattatgcca ccaggcggta 900

agtgaggaat gtgaatatga cattaggcgc ttttggtatt gcactaaaac ctctcggata 960

tgaaatttcg gtactgagcc agtttatttg gtattcaagt cagcaaggta tattgtttta 1020

agagatagat aaaagtatgg aactgtagaa gtgctgcaat aagtatgatc caaactgtga 1080

actgtatata tagtgaacat atattgtaga ttggtctatg tagaagatat acagtacgtt 1140

ggtttcttgc ttaagcttct cacaagcatc ctttcgcggt aacatgtgta ggcactcgtg 1200

aagcatgatc ataaacagcg aggtaccgta gaatcagatg cttactcata ggacatctta 1260

actcgcatcc tattgaagta gaatgtgtaa cataatcata agttggaaca gactatacta 1320

tcacatgctt agttgtagca tggtaaattg ataataaaca tgaatgaact ttgttcaata 1380

gacaaactag ccaagaaaac gtttagtgcc attcatggtg ttaatattgc atgtttgcct 1440

gccctacact accgcagtct cattttcatc ctatgctaag ataactctca agttggtgta 1500

gatattgagt atgaaactca tttgtgtgct cttgccaagt tttgattgca ttaagtagtg 1560

aggtttctca ttaattgcac catcttgcat tttctgaaag cgtcatcaag ttgtttgagc 1620

ttaaatttat atggtgaaag tattgtttct aatgataaga ctgtagtatc gatgggcatc 1680

cactggccac tttttcccat gtgattaatc tttaccacca aacagttggg tcgataatct 1740

ttttccacaa gagtaagaac gccatgataa gttcagagtc ccaagatcta tgttctgaac 1800

agtttatttt ctcctctacc ctatatgtgg tgaaaattca catggtgatg tgaggtattc 1860

catatgaagg ctaaaaagtt ggtgattata tctcccatgc tgttcatgta gatacagaat 1920

aatagctggt ttggaaccat gtgtgtccat atctatttgt ccctgctaaa ttacatttgt 1980

caaagctcgc ccaatggagc atttatttgc ccctgctatt gcaataatgc ctcctagggg 2040

tcgatagtgc aattacgagc tgaggtaaac tactatattt acttagatgt tagtgatact 2100

atgttttttt ccttcaatac tatttatagg acagtcattt gcaatacttt tttttttgta 2160

attttgatga aaactggata tctgagttga ctaattacat gttcgtagtt ttgatgaaat 2220

aatggatatt tgaactgatt aatgatggat ttattcatct ttctgaagcc ataaacatta 2280

gccatactta tttgagatgc gtaaattatt ctcctgtcac ttccttagct ttttgggcta 2340

cccaataagt ctaacttaaa aagctcgcca tgtctttcag ctctctgcaa aggagtacct 2400

gaagttccaa gcttcatatg ccacagttct taaagcccat atgcacgctt tgaagaagag 2460

ggagaggaaa gacaagaaga aggctgcaga ggttgagaag ataccagaga aggcaccgaa 2520

gaagcagaag aaagcaccgt cttcaaagaa atctgcaggg tccaagtcgt aagttactga 2580

aagaatttgc taagcccttt tttggccaca ggcctgagta agatgggtgt agtcaagaca 2640

ttatcctcca ttttactctt attcatgtct gcgagatgaa gcatgtgaat acctttatag 2700

agctgtgccg tcgacattag caatttttga agcagctttg gttgtctaga tgtaagccgc 2760

cctggaattt tctatttcta tcatagaaag gcatctctta aactgtgcct gatctgatcg 2820

tcaagttagt gcaactttca attgacagaa ttacgtctgg aacatgaagt tatgcaacta 2880

agactgcaga aggaaattgc agaactgtta tctggatgtc tgtgttcctt caattttgtt 2940

tttctggttg gggagaaaaa gtgtgaaggt atgtctgtgt cacgattccc acatgcaagt 3000

ggtgatcaga atataagcag attccatgtt taggttggtg cataagcaaa cggcgtacta 3060

ctatgggcct atttggtaga gcttcaactc tggattttag ctctaggagt tgggtctgga 3120

gtggagttgt agagctgcct gaacctagct ctatctctga gattttcacc cttctatttt 3180

aagtggagct gaggtgccaa acaggcccta tctctcagca attgctgcat caacatggag 3240

cattggaggg ccgtatgccc gtatcctgtg tatgggcaca gcattgtcgg ttcctagcta 3300

tttgttctgc catcccccgg tcccaactga ttctcgtatc ggtccagaca agtccaaaag 3360

ctccaagctc cagtttttac accatttcgt ttttctttaa cacggttaga atttataaac 3420

catatcatgt ggtggtattt ttgtccagag attcacctca gaagtggcga atttttatcg 3480

taccaattgc agagacgaat ctttgctgag taggaggcag caaccactat gagcagccgt 3540

caccatccaa ccggacaaaa tccatcaaaa aataacccaa agaaatcaaa acaaaagcga 3600

gcacccaccg atgatcactc actgatctct catcaccaaa cgcctccgac ctcgctcgcg 3660

tcgcgcgccg cgcacccatc cccccggcct cgccaccacc cactcccgat cgcccccgtc 3720

gccacccacc ccctcagaaa tctcatcttt tccgcctcct ctcgccaacc aaacccgcga 3780

aacccccaca aacgacggtg gtgaaagaag atgagagggc tactcgcgtg cgccacgctc 3840

gcccgccgcg ccgccggcgc gacgtcgacg gcgcggcggc acctggcggg cgcggccgag 3900

gcggcggagg cggagctgaa gaagacggcg ctgtacgact tccacgtcgc gcacggcggg 3960

aagatggtgc cgttcgccgg gtggagcatg cccatccagt acaaggacac catcatggac 4020

tccaccctca actgccgcgc caacggcagc ctcttcgacg tctcccacat gtgcggcctc 4080

agcctccacg gccgccaggc catccccttc ctcgagtccc tcgtcgtcgc cgacgtcgcg 4140

gcgctcaagg acggcaccgg gacgctcacc gtcttcacca acgaccgcgg cggcgccatc 4200

gacgactccg tcgttaccaa ggtcaccgac cagcacatct acctcgtcgt caacgccggg 4260

tgcagggaca aggatctcgc ccacattggg gagcacatgg aggccttcaa caagaagggc 4320

ggcgacgtca agtggcacgt ccacgatgag cgctcgcttc ttgcattgca g 4371

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgcatcacg accccaaccc gttcgacgag ggcaacgccg acgacaaccc cttctccaat 60

gggggaggtg gtggtggcgg cggcggcagc aggcagcagt acgggttccg ccccacggag 120

cccgccggct tcggcgccgg caggggggac gccaccgtcg atgtcccgct cgacaccatg 180

ggcgactcca agagcaaggc aagggagctc tcatcgtggg aaacagatct gaagcggcgg 240

gaggcggata tcaaaaggag ggaggaagcg ctgaggaatg ctggagtgcc aatggaggat 300

aagaactggc caccattctt cccgatcatt caccatgaca ttgccaatga gataccggct 360

aatttgcaga aattgcagta tctcgcgttc gcaagctggc ttggtatcgt gctttgcctc 420

tcatggaact tcatcgctgt catagtctgt tggatcaagg agggagattc gaagctgttt 480

ttccttgcca ctatctatgc cttgcttgga attcccctct cgtacttgat atggtatagg 540

cctctctacc gtgctatgag gactaacagt gcgttcagtt ttggatggtt ctttctctgt 600

tacttgatcc acattggctt ttgcattatt gctgccattg ccccgccaat tgtgtttcat 660

ggaaaatcat taacgggcat actggctgcc atagacacct tttctgagca tgtgataatt 720

gggatctttt actttgtggg gttcgcgctg ttttgcttgg agacactgct gagcattgga 780

gttcttcaga gagtgtacat gtacttcaga gggaacaagt ga 822

<210> 3

<211> 273

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 3

Met His His Asp Pro Asn Pro Phe Asp Glu Gly Asn Ala Asp Asp Asn

1 5 10 15

Pro Phe Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln

20 25 30

Gln Tyr Gly Phe Arg Pro Thr Glu Pro Ala Gly Phe Gly Ala Gly Arg

35 40 45

Gly Asp Ala Thr Val Asp Val Pro Leu Asp Thr Met Gly Asp Ser Lys

50 55 60

Ser Lys Ala Arg Glu Leu Ser Ser Trp Glu Thr Asp Leu Lys Arg Arg

65 70 75 80

Glu Ala Asp Ile Lys Arg Arg Glu Glu Ala Leu Arg Asn Ala Gly Val

85 90 95

Pro Met Glu Asp Lys Asn Trp Pro Pro Phe Phe Pro Ile Ile His His

100 105 110

Asp Ile Ala Asn Glu Ile Pro Ala Asn Leu Gln Lys Leu Gln Tyr Leu

115 120 125

Ala Phe Ala Ser Trp Leu Gly Ile Val Leu Cys Leu Ser Trp Asn Phe

130 135 140

Ile Ala Val Ile Val Cys Trp Ile Lys Glu Gly Asp Ser Lys Leu Phe

145 150 155 160

Phe Leu Ala Thr Ile Tyr Ala Leu Leu Gly Ile Pro Leu Ser Tyr Leu

165 170 175

Ile Trp Tyr Arg Pro Leu Tyr Arg Ala Met Arg Thr Asn Ser Ala Phe

180 185 190

Ser Phe Gly Trp Phe Phe Leu Cys Tyr Leu Ile His Ile Gly Phe Cys

195 200 205

Ile Ile Ala Ala Ile Ala Pro Pro Ile Val Phe His Gly Lys Ser Leu

210 215 220

Thr Gly Ile Leu Ala Ala Ile Asp Thr Phe Ser Glu His Val Ile Ile

225 230 235 240

Gly Ile Phe Tyr Phe Val Gly Phe Ala Leu Phe Cys Leu Glu Thr Leu

245 250 255

Leu Ser Ile Gly Val Leu Gln Arg Val Tyr Met Tyr Phe Arg Gly Asn

260 265 270

Lys