本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體的涉及一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白及其制備方法和應用。

背景技術：

ABO血型系統的檢測在臨床輸血、器官移植、新生兒溶血檢測等方面有重要意義，同時在人種學、遺傳學、法醫(yī)學、疾病抵抗力(或易感性)等方面都有應用價值。在輸血前，一定要檢查病人(受血者)和輸血人(供血者)的血型，并且要進行交叉配血試驗。為了保證正確的血型鑒定，衛(wèi)生部在2000年發(fā)文(衛(wèi)醫(yī)法[2000]184號)明確規(guī)定：每位供血及受血的個體均要進行ABO血型正反定型。

人類ABO基因位于染色體9q34.1-34.2，ABO基因包含長度大小從28-688bp不等的7個外顯子和長度約為19514bp的6個內含子，其中第6和第7外顯子包括了77％的基因編碼序列，同時也包括了91％的糖基轉移酶催化區(qū)域序列。ABO基因的調控區(qū)域大約總長為18-20kb，產物是糖基轉移酶，這些酶控制ABO血型抗原的生物合成。A和B等位基因編碼一個長為354個氨基酸的蛋白質，ABO抗原的化學結構是糖蛋白，其血清學特異性取決于糖鏈末端3個糖基的結構，形成紅細胞上不同的A、B凝集原，將血型分為O、A、B及AB血型。A型血紅細胞上含A抗原，血清中含抗B抗體；B型血紅細胞上含B抗原，血清中含抗A抗體；O型血紅細胞上則沒有A及B抗原，血清中含抗A及抗B抗體；AB型血紅細胞上含A及B兩種抗原，血清中則不含抗A及抗B抗體。A抗原和抗A抗體，B抗原和抗B抗體會發(fā)生免疫結合反應，使紅細胞發(fā)生凝聚。

目前，ABO血型試驗檢測方法已經成熟的試驗方法有血凝試驗、微柱凝集試驗、基因檢測等方法。其中正反定型的血凝試驗中用到的標準A型、B型和O型紅細胞與抗A、抗B抗體，存在保存期短，保存條件較苛刻(2～8℃，避光)，且容易發(fā)生微生物污染及溶血現象等問題，這些問題容易導致血型鑒定出差錯，甚至出現嚴重輸血事故。微柱凝膠法檢測時則需要特制的凝膠卡，同時需配備專用離心機，檢測成本較高。除以上兩種常用的方法之外，還有磁珠法。磁珠法在使用前，需進行試劑的復溶，復溶后的試劑存放時間較短，一般7天內必須使用完，而且需要專門的磁化程控振蕩器。

而急救、血型普查、陳舊血液樣本的檢測等對血型的檢測提出了更高的檢驗要求。所以開發(fā)更為準確、快速、簡便的血型檢測方法，突破傳統的血型檢測弊端，是亟待解決的問題。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是克服現有技術中的問題，提供一種A抗原基因重組蛋白和B抗原基因重組蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供一種A抗原基因重組蛋白和B抗原基因重組蛋白的制備方法。

本發(fā)明采用的技術方案是：一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白，所述的人血型A抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的人血型B抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法，方法如下：

1)提取人全血中的總DNA；

2)以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，分別得到A抗原PCR擴增產物或B抗原PCR擴增產物；其中，所述的特異性引物是：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量；

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環(huán)；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。

3)將得到的A抗原PCR擴增產物和B抗原PCR擴增產物分別與質粒pMD18-T進行T克隆，得到重組質粒PMD18-T/A和PMD18-T/B；

4)將重組質粒PMD18-T/A及重組質粒PMD18-T/B分別和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，分別制得重組表達載體pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B；

5)將重組表達載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分別轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株；

6)將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株或含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，經誘導表達，純化后，得到A抗原基因重組蛋白或B抗原基因重組蛋白。

所述的誘導表達是：將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株或含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，次日按1:100擴大培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

所述的純化是：將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得純化的A抗原基因重組蛋白或B抗原基因重組蛋白。

本發(fā)明的有益效果為：

1.本發(fā)明，成功構建了重組表達載體pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B，并能在大腸桿菌中表達A抗原基因重組蛋白及B抗原基因重組蛋白；重組蛋白能與A抗體、B抗體血清進行反應，具有良好的反應原性，可用于血型的檢測，具有制備成本低的優(yōu)點。

2.將本發(fā)明制備的A抗原基因重組蛋白及B抗原基因重組蛋白應用于膠體金等，可以制備血型檢測試紙，進行更為準確、快速、簡便的血型檢測，突破了傳統的血型檢測的弊端，可成為一種新的血型檢測方法。滿足急救、血型普查、陳舊血液樣本的檢測等對血型的檢測提出的更高的檢驗要求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明A基因與B基因的RT-PCR產物鑒定圖。

圖2為本發(fā)明PMD18-T/A與PMD18-T/B質粒的PCR鑒定圖。

圖3為本發(fā)明PMD18-T/A與PMD18-T/B質粒的酶切圖。

圖4為本發(fā)明pUCm-4T-1/A與pUCm-4T-1/B質粒的PCR鑒定圖。

圖5為本發(fā)明pUCm-4T-1/A和pUCm-4T-1/B質粒的酶切鑒定圖。

具體實施方式

Trizol plus，PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒，Prime STAR PCR Mix，DL2000Marker、DL5000Marker，ligation mix連接試劑盒，BamHI、XhoI限制性內切酶，IPTG等試劑購于寶生物工程(大連)有限公司。

質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等購自OMEGA。

實施例1人血型A抗原基因重組蛋白

(一)提取人全血中的總DNA

收集4例中國漢族無償捐血者，根據血庫操作規(guī)程，采集靜脈全血，運用快速鹽析法，從全血白膜層抽提基因組DNA，作為DNA模板。

(二)PCR擴增

1、引物設計

根據Genbank登錄號為AY845133的A抗原全基因序列，設計擴增A抗原基因DNA片段的特異性引物，在上下游引物的末端同時引入BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，預期的擴增片段長度約為1887bp。經設計擴增A抗原基因的特異性引物如下：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

PCR擴增

以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，得到A抗原PCR擴增產物。

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量。

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環(huán)；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。

2、RT-PCR產物的檢測

電泳鑒定擴增片段，于2％瓊脂糖凝膠上檢測擴增產物，電壓為10v/cm，電泳20min左右。使用DNA分子標記DL2000(TAKARA,大連寶生物)標記目的片段長度，結果如圖1所示，由圖1可見，擴增片段為1887bp，與預期相符。

3、PCR特異片段的回收和純化

使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices試劑盒(MILLIPORE公司)對擴增產物回收和純化。

(三)構建重組表達載體

1.進行T克隆，構建重組質粒PMD18-T/A

將鑒定正確的PCR特異片段按DNA膠回收試劑盒說明書純化回收產物，將膠回收產物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，膠回收產物7.5μL，混勻，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。

加A后的目的片段與載體pMD18-T的連接反應在離心管中進行。連接反應體系為：

混勻后，16℃水浴反應2～4h或者過夜，得連接產物-重組質粒PMD18-T/A。

將5μL重組質粒PMD18-T/A轉入DH5a感受態(tài)細胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30min；42℃熱激90s，冰浴2min，加入445μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200～250r/min振蕩培養(yǎng)1h，4000r/min離心2min，混勻；將菌液均勻地涂布于含有抗生素的LB瓊脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)到單個菌落出現；挑菌，37℃300r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

菌液PCR篩選陽性克隆：以變渾濁的菌液為模板，PCR擴增A基因。產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果。

重組質粒的酶切鑒定：按照質粒抽提試劑盒(OMEGA)操作步驟進行質粒抽提，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切體系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重組質粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切產物用1％瓊脂糖電泳鑒定，結果如圖2和圖3所示。

鑒定結果：由圖2和圖3可見，A基因連接至T-Vector后，經PCR及酶切鑒定后A基因長度為1887bp，得到了預期的條帶。

2.構建重組表達載體pUCm-4T-1/A

將重組質粒PMD18-T/A和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，制得重組表達載體pUCm-4T-1/A。

連接反應體系：目的基因片段5.5μl，表達載體2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬離，混勻，16℃連接過夜。

重組表達載體pUCm-4T-1/A的轉化和鑒定方法與T克隆步驟中的轉化和鑒定的方法相同，最后測序確認，結果如圖4和圖5。

鑒定結果：將A基因克隆至pUCm-4T-1載體，經PCR及酶切鑒定后均得到預期的條帶，重組質粒pUCm-4T-1/A中A的長度為1887bp，圖4中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/A的BamHⅠ或XhoⅠ酶切產物，圖5中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/A測序結果通過NCBI上Blastn同源性比對分析表明，載體中插入的基因片段大小為1887bp，與預期一致，表明重組表達載體構建成功。

(四)轉化

將重組表達載體pUCm-4T-1/A轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株。

(五)誘導表達

將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，次日按1:100擴大培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

(六)純化

將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得A抗原基因重組蛋白。

產物經大連寶生物檢測，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

實施例2人血型B抗原基因重組蛋白

(一)提取人血中的總DNA

收集4例中國漢族無償捐血者，根據血庫操作規(guī)程，采集靜脈全血，運用快速鹽析法，從全血白膜層抽提基因組DNA，作為DNA模板。

(二)PCR擴增

1、引物設計

根據Genbank登錄號為AY845133的B抗原全基因序列，設計擴增B抗原基因DNA片段的特異性引物，在上下游引物的末端同時引入BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，預期的擴增片段長度約為188bp。經設計擴增B抗原基因的特異性引物如下：

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

2、PCR擴增

以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，得到B抗原PCR擴增產物。

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量；

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環(huán)；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。

3、RT-PCR產物的檢測

電泳鑒定擴增片段，于2％瓊脂糖凝膠上檢測擴增產物，電壓為10v/cm，電泳20min左右。使用DNA分子標記DL2000(TAKARA,大連寶生物)標記目的片段長度，結果如圖1所示，由圖1可見，擴增片段為1887bp，與預期相符。

4、PCR特異片段的回收和純化

使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices試劑盒(MILLIPORE公司)對擴增產物回收和純化。

(三)構建重組表達載體

1.進行T克隆，構建重組質粒PMD18-T/B

將鑒定正確的PCR特異片段按DNA膠回收試劑盒說明書純化回收產物，將膠回收產物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，膠回收產物7.5μL，混勻，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。

加A后的目的片段與載體pMD18-T的連接反應在離心管中進行。連接反應體系為：

混勻后，16℃水浴反應2～4h或者過夜，得連接產物-重組質粒PMD18-T/B。

將5μL重組質粒PMD18-T/B轉入DH5a感受態(tài)細胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30min；42℃熱激90s，冰浴2min，加入445μL LB液體培養(yǎng)基，37℃200～250r/min振蕩培養(yǎng)1h，4000r/min離心2min，混勻；將菌液均勻地涂布于含有抗生素的LB瓊脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)到單個菌落出現；挑菌，37℃300r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

菌液PCR篩選陽性克?。阂宰儨啙岬木簽槟０澹琍CR擴增B基因。產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果。

重組質粒的酶切鑒定：按照質粒抽提試劑盒(OMEGA)操作步驟進行質粒抽提，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切體系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重組質粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切產物用1％瓊脂糖電泳鑒定，結果如圖2和圖3所示。

鑒定結果：由圖2和圖3可見，B基因連接至T-Vector后，經PCR及酶切鑒定后B基因長度為1887bp，得到了預期的條帶。

2.構建重組表達載體pUCm-4T-1/B

將重組質粒PMD18-T/B和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，制得重組表達載體pUCm-4T-1/B。

連接反應體系：目的基因片段5.5μl，表達載體2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬離，混勻，16℃連接過夜。

重組表達載體pUCm-4T-1/B的轉化和鑒定方法與T克隆步驟中的轉化和鑒定的方法相同，最后測序確認，結果如圖4和圖5。

鑒定結果：將B基因克隆至pUCm-4T-1載體，經PCR及酶切鑒定后均得到預期的條帶，重組質粒pUCm-4T-1/B中B的長度為1887bp，圖4中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/B的BamHⅠ或XhoⅠ酶切產物，圖5中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/B測序結果通過NCBI上Blastn同源性比對分析表明，載體中插入的基因片段大小為1887bp，與預期一致，表明重組表達載體構建成功。

(四)轉化

將重組表達載體pUCm-4T-1/B轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株。

(五)誘導表達

將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，次日按1:100擴大培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

(六)純化

將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得B抗原基因重組蛋白。

產物經大連寶生物檢測，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

<110> 何偉

<120> 一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白及其制備方法和應用

<160> 2

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> A抗原基因重組蛋白

<400> 1

1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA

61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG

121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC

181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG

241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGAAGTCCC

301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG

361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG

421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT

481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCGGGAACGG GAACCCGGCC

541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA

601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC

661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC

721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG

781 CACTATCCCA CGCAGCACGT GCAGTTCTGGGTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG

841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG

901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG

961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG

1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT

1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA

1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC

1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC

1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC

1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT

1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC

1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG

1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC

1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG

1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC

1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC

1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG

1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC

1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA

<210> 2

<211> 1887

<212> DNA

<213> B抗原基因重組蛋白

<400> 2

1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA

61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG

121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC

181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG

241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGCAGTCCC

301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG

361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG

421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT

481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCCGGAACGG GAACCCGGCC

541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA

601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC

661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC

721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG

781 CACTATCCCA CGGAGCACGT GCAGTTCTGG GTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG

841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG

901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG

961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG

1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT

1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA

1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC

1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC

1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC

1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT

1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC

1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG

1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC

1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG

1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC

1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC

1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG

1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC

1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA