1.一種人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白,其特征在于,所述的人血型A抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示;所述的人血型B抗原基因重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
2.權(quán)利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法,其特征在于,方法如下:
1)提取人全血中的總DNA;
2)以DNA為模板,通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物,利用PCR方法擴(kuò)增,分別得到A抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或B抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;其中,所述的特異性引物是:
上游引物PA1:5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3';
下游引物PA2:5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3';
上游引物PB1:5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3';
下游引物PB2:5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3';
3)將得到的A抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和B抗原PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與質(zhì)粒pMD18-T進(jìn)行T克隆,得到重組質(zhì)粒pMD18-T/A和pMD18-T/B;
4)將重組質(zhì)粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分別和表達(dá)載體pUCm-4T-1同時(shí)進(jìn)行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切,連接,分別制得重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B;
5)將重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分別轉(zhuǎn)化到Ecoli.BL21表達(dá)宿主菌中,篩選陽(yáng)性表達(dá)菌株;
6)將篩選的含重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/A的陽(yáng)性表達(dá)菌株或含重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/B的陽(yáng)性表達(dá)菌株,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),純化后,得到A抗原基因重組蛋白或B抗原基因重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法,其特征在于,步驟2)中,
PCR反應(yīng)體系為:20μL體系:Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 0.2mmol/L,Taq酶1U,引物各5pmol/L,樣品DNA 100~200ng,超純水余量;
PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min;94℃20s,63℃30s,72℃lmin,進(jìn)行10個(gè)循環(huán);94℃20s,60℃30s,72℃1min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán);72℃延伸5min;4℃保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法,其特征在于,步驟6)中,所述的誘導(dǎo)表達(dá)是:將篩選的含重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/A的陽(yáng)性表達(dá)菌株或含重組表達(dá)載體pUCm-4T-1/B的陽(yáng)性表達(dá)菌株,接種于LB培養(yǎng)基中,37℃過(guò)夜培養(yǎng),次日按1:100擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600nm=0.6時(shí),于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,37℃誘導(dǎo)12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白的制備方法,其特征在于,步驟6)中,所述的純化是:將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液,以12000r/min離心10min,富集菌體,菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液,按1:10的體積比,重懸菌體,冰浴超聲破碎至菌懸液澄清,4℃,12000r/min離心10min,收集上清液,上清液中加入SDS loading buffer,取沉淀物,沉淀物用尿素溶解,8000r/min離心10min,收集上清液,上清液再加入SDS loading buffer,煮沸10min,10000r/min離心10min,得純化的A抗原基因重組蛋白或B抗原基因重組蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重組蛋白在血型檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。