本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域，具體涉及豬肌抑素基因編輯位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因轉(zhuǎn)移技術(shù)根據(jù)外源基因整合的位點(diǎn)特異性可分為兩大類，一類是非定點(diǎn)的，即導(dǎo)入的外源基因在靶細(xì)胞基因組中整合的位點(diǎn)一般是隨機(jī)的，包括顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染等：另一類則是定點(diǎn)的，即外源基因?qū)氚屑?xì)胞后整合到預(yù)先確定的位點(diǎn)或?qū)?xì)胞內(nèi)靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾，這就是依賴于同源重組的基因打靶技術(shù)。將外源基因精準(zhǔn)敲入豬體細(xì)胞的基因組中，一直都是極為困難的，因?yàn)樵缙趦H基于同源重組的基因打靶技術(shù)效率極低，應(yīng)用受到很大的限制。直到近年來人工核酸內(nèi)切酶(engineeredendonuclease,EEN)的出現(xiàn)，才徹底改變了這一現(xiàn)狀。鋅指核酸內(nèi)切酶(zincfingerendonuclease,ZFN)是第一代人工核酸內(nèi)切酶。鋅指是一類能夠結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)，很多轉(zhuǎn)錄因子中都含有鋅指結(jié)構(gòu)。ZFN是將鋅指蛋白的DNA結(jié)構(gòu)域和FokI核酸內(nèi)切酶中的非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域組合形成的一種嵌合體蛋白，其既具有鋅指蛋白結(jié)合DNA的能力又具有核酸內(nèi)切酶FokI切割DNA雙鏈的能力(KimYG,ChaJ,ChandrasegaranS.Hybridrestrictionenzymes:zincfingerfusionstoFokIcleavagedomain.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(3):1156-1160.)。利用ZFN可以在各種復(fù)雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。到目前為止，ZFN已經(jīng)成功應(yīng)用于豬、牛、大鼠、小鼠、斑馬魚、家蠶、果蠅、海膽、擬南芥、煙草、玉米等生物(UrnovFD,RebarEJ,HolmesMC,etal.Genomeeditingwithengineeredzincfingernucleases.NatRevGenet,2010,11(9):636-646.)。但是，由于ZFN制備流程復(fù)雜，成本昂貴，而且其技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司所控制，所以推廣應(yīng)用十分有限。2009年，科學(xué)家將一種水稻的致病菌(Xanthamonas)編碼的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcriptionactivator-likeeffector,TALE)與DNA的堿基對(duì)應(yīng)關(guān)系解密(MoscouMJ,BogdanoveAJ.AsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectors.Science,2009,326(5959):1501；BochJ,ScholzeH,SchornackS,etal.BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors.Science,2009，326(5959):1509-1512.)。第二代人工核酸酶——類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)應(yīng)運(yùn)而生。和ZFN相似，TALEN主要由TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組合而成，TALE蛋白含有多個(gè)33-35個(gè)氨基酸組成的重復(fù)肽段，而每一個(gè)肽段都能夠識(shí)別一個(gè)堿基。2010年，首次報(bào)道TALEN蛋白在酵母中應(yīng)用成功(LiT,HuangS,ZhaoX,etal.ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes.NucleicacidsRes,2011,39(14):6315-6325.)。之后，TALEN在植物、小鼠、斑馬魚、豬、牛等動(dòng)植物中得到了迅速的推廣與應(yīng)用(JoungJK,SanderJD.TALENs:awidelyapplicabletechnologyfortargetedgenomeediting.NatRevMolCellBiol,2013,14(1):49-55.)。TALEN不僅可以像ZFN一樣對(duì)復(fù)雜的基因組進(jìn)行精細(xì)的修飾，而且其構(gòu)建更加簡(jiǎn)單，特異性也更高，因此TALEN出現(xiàn)不久就在很大程度上替代了ZFN。2012年，TALEN被《科學(xué)》(Science)雜志評(píng)為十大科學(xué)突破之一(Breakthroughoftheyear.Therunners-up.Science,2012,338(6114):1525-1532.)。無論是ZFN還是TALEN,這兩種人工核酸酶都是嵌合體，都是由經(jīng)過人工設(shè)計(jì)的、序列特異性的DNA結(jié)合元件和非特異性的DNA切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合而成的。TALEN與ZFN的作用機(jī)制都是先對(duì)DNA雙鏈分子靶序列進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂(double-strandbreak,DSB)，然后DSB激活細(xì)胞自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，從而對(duì)該DNA進(jìn)行定點(diǎn)改造。2013年初，一種繼ZFN和TALEN之后的第三代基因定點(diǎn)編輯技術(shù)clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)閃亮登場(chǎng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要是基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，細(xì)菌利用此系統(tǒng)可以特異性識(shí)別入侵的外源DNA并利用Cas蛋白對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行斷裂和降解，從而抵抗病毒感染。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的工作原理：crRNA(CRISPR-derivedRNA)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與tracrRNA(trans-activatingRNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，然后DSB激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，通過兩種方式對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)，即非同源末端連接(non-homologousendjoining,NHEJ)或者同源重組修復(fù)(homology-directedrepair,HDR)，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組(包括內(nèi)源基因的敲除或外源基因的定點(diǎn)敲入)的目的。NHEJ是一種非保真的、容易出現(xiàn)遺傳突變的修復(fù)機(jī)制，往往使得核酸鏈被剪切的區(qū)域發(fā)生基因突變，導(dǎo)致編碼的基因Knockdown或Knockout。而HDR則是一種高保真的修復(fù)機(jī)制，不容易出現(xiàn)突變，往往通過供體DNA與基因組DNA之間的同源重組造成靶位點(diǎn)的糾正或者靶向插入外源基因Knockin。CRISPR/Cas9技術(shù)擁有ZFN和TALEN所不具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：1.CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需合成一個(gè)sgRNA(編碼sgRNA的序列不超過100bp)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，所以操作起來更加簡(jiǎn)單快捷。2.CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，sgRNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配，Cas9才能對(duì)DNA進(jìn)行剪切，因此其靶向精確性性更高。3.CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因修飾率更高，對(duì)基因調(diào)控方式更多樣(敲除、插入、抑制、激活等)。4.CRISPR/Cas9系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)周期更短，可節(jié)省大量時(shí)間和成本。6.CRISPR/Cas9系統(tǒng)更容易得到純合子突變體，而且可以在不同的位點(diǎn)同時(shí)引入多個(gè)突變(MussolinoC,CathomenT.RNAguidesgenomeengineering.NatBiotechnol,2013,31(3):208-209；Wang,H.,etal.(2013)."One-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Cas-mediatedgenomeengineering."Cell153(4):910-918.)。CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)，在短短兩三年之內(nèi)，技術(shù)不斷改進(jìn)，發(fā)展成為生物學(xué)領(lǐng)域最受青睞的研究工具之一。基因打靶是通過同源重組技術(shù)將外源基因定點(diǎn)整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的，具有技術(shù)成熟、修飾準(zhǔn)確、效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)?；虼虬屑夹g(shù)目前已被廣泛認(rèn)為是一種理想的特定修飾與改造生物體遺傳物質(zhì)的最佳方法，其中包括了多種不同的基因敲除和敲入系統(tǒng)，特別是條件性和誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對(duì)基因在時(shí)間和空間上的靶位修飾更加明確、效果更加精確可靠。將CRISPR/Cas9技術(shù)和基因打靶聯(lián)合起來，核酸內(nèi)切酶Cas9定點(diǎn)切割靶DNA后產(chǎn)生DNA斷口，再利用打靶載體的同源臂進(jìn)行精確的同源重組，相對(duì)提高了該位點(diǎn)的短片段同源重組的效率。本人于2016年5月12日檢索PubMed，以關(guān)鍵詞“CRISPR/Cas9”查詢，檢出文獻(xiàn)1680篇，其中2011年僅發(fā)表1篇，2012年發(fā)表3篇，2013年發(fā)表78篇，2014年發(fā)表316篇，2015年發(fā)表718篇，2016年截止到2016年5月12日已發(fā)表564篇。以關(guān)鍵詞“myostatinCRISPR/Cas9”查詢，檢出文獻(xiàn)為5篇，其中僅有一篇文章是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)豬MSTN基因進(jìn)行高效突變(Wang,K.,etal.(2015)."EfficientGenerationofMyostatinMutationsinPigsUsingtheCRISPR/Cas9System."SciRep5:16623.)。本研究是對(duì)豬MSTN第3外顯子進(jìn)行打靶，根據(jù)打靶后統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，該位點(diǎn)打靶效率高達(dá)86.7％，與基于胚胎干細(xì)胞(ES)的同源重組技術(shù)即俗稱的“傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)”相比，打靶效率有了極大的提高。肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)，又稱GDF-8，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族。MSTN基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中相當(dāng)保守，基因編碼區(qū)均含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，僅有若干個(gè)單核苷酸的突變或錯(cuò)義突變。MSTN基因編碼一種能夠?qū)∪馍L起負(fù)調(diào)控作用、化學(xué)本質(zhì)為糖蛋白的生長因子，可影響畜禽產(chǎn)肉率、改善肉質(zhì)性狀，并廣泛分布在骨骼肌中。因此，在畜牧業(yè)上，MSTN基因的多態(tài)可作為選擇肌肉性狀和胴體性狀的分子標(biāo)記。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷改進(jìn)，使得對(duì)豬MSTN基因進(jìn)行編輯變得更為簡(jiǎn)單快捷，該技術(shù)的應(yīng)用范圍包括：一方面，對(duì)豬MSTN基因進(jìn)行完全性基因敲除，可培育出肌肉發(fā)達(dá)的瘦肉型豬，從而提高了養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益；另一方面，進(jìn)行基因定點(diǎn)插入，點(diǎn)突變研究和人源化研究。對(duì)進(jìn)一步研究MSTN基因的功能及其與某些疾病的相互聯(lián)系具有十分重大的意義。因此，本發(fā)明的目的在于鑒定MSTN基因的高效編輯位點(diǎn)，并分析其打靶效率，為構(gòu)建MSTN基因內(nèi)源性敲除或定點(diǎn)敲入外源基因的轉(zhuǎn)基因豬提供新途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請(qǐng)以pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體為骨架構(gòu)建插入有豬肌抑素基因(MSTN)編輯靶位點(diǎn)(864-883)的Cas9gRNA表達(dá)載體T21，并將其與帶有靶位點(diǎn)附近同源臂的打靶載體dT2按照一定的摩爾比例轉(zhuǎn)染豬腎PK15細(xì)胞，以G418篩選單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。為方便篩選陽性克隆，打靶載體dT2設(shè)計(jì)有綠色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP)雙熒光蛋白，如果發(fā)生精確的同源重組，而非隨機(jī)整合的話，則細(xì)胞應(yīng)該只發(fā)綠色熒光。同時(shí)，打靶載體dT2含有neo基因，可用G418輔助篩選。本發(fā)明的目的是：提供一個(gè)可高效敲除豬肌抑素基因(MSTN)的編輯位點(diǎn)(864-883)。該編輯位點(diǎn)可用于Cas9介導(dǎo)的豬MSTN基因打靶，將肌抑素功能失活，創(chuàng)建肌抑素缺失轉(zhuǎn)化體，操作步驟包括：(1)構(gòu)建含有編輯靶位點(diǎn)(864-883)的Cas9gRNA表達(dá)載體T21和帶有雙熒光蛋白的打靶載體dT2；(2)將上述2種載體按照一定摩爾比例轉(zhuǎn)染豬腎PK15細(xì)胞；(3)G418加壓篩選僅發(fā)綠色熒光的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；(4)PCR鑒定同源重組的真實(shí)性；(5)測(cè)序驗(yàn)證重組邊界的準(zhǔn)確序列。利用本發(fā)明提供的編輯位點(diǎn)(864-883)，可以在核酸內(nèi)切酶Cas9的介導(dǎo)下以較高效率進(jìn)行雙鏈斷裂，從而提高打靶載體和目的基因的同源重組效率，將帶有選擇性標(biāo)記的外源基因定點(diǎn)整合于豬基因組內(nèi)。該編輯位點(diǎn)(864-883)位于豬肌抑素基因(MSTN)的3號(hào)外顯子區(qū)，可高效的敲除MSTN基因并定點(diǎn)整合有neo和EGFP選擇性標(biāo)記。本發(fā)明將提供一種方便、高效的策略來構(gòu)建MSTN基因敲除的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，對(duì)促進(jìn)內(nèi)源基因敲除或外源基因定點(diǎn)整合技術(shù)在轉(zhuǎn)基因豬研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用具有十分重要的作用。除非特別指出或是單獨(dú)定義，本文所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員共知的、無歧義的相同含義。本文所提及的所有已公開的專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)均已通過完整引用的方式并入本申請(qǐng)中。附圖說明圖1編輯位點(diǎn)(864-883)在豬基因組上的準(zhǔn)確位置豬肌抑素基因MSTN編輯位點(diǎn)T2是一段長23bp的已知DNA序列，序列為：GGATTTTGAAGCTTTTGGATGGG，該位點(diǎn)在豬基因組的準(zhǔn)確定位是15號(hào)染色體MSTN編碼區(qū)3號(hào)外顯子上。圖2插入有引導(dǎo)序列的Cas9gRNA表達(dá)載體示意圖及編輯位點(diǎn)序列。上圖為Cas9gRNA表達(dá)載體示意圖，以pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體為骨架，帶有hSpCas9基因、CRISPRArray和tracrRNA序列的一個(gè)表達(dá)載體。下圖所示為編輯位點(diǎn)(864-883)序列。圖3dT2質(zhì)粒及酶切的電泳圖。M為1kbDNAladder(TaKaRaM1181/M1182)，右側(cè)依次為未經(jīng)酶切的質(zhì)粒、經(jīng)NsiⅠ和XhoⅠ雙酶切后的產(chǎn)物?？梢?，原始質(zhì)粒及酶切后產(chǎn)物與預(yù)期一致。圖4基因打靶示意圖。如果為同源重組，則neo和EGFP選擇性標(biāo)記整合至MSTN的864-883位點(diǎn)。檢測(cè)打靶后的整合情況分別用T2-Up和MKR這對(duì)引物檢測(cè)5’arm(預(yù)期PCR產(chǎn)物的長度約為759bp)，用EGFP-QF1和T2-Down這對(duì)引物檢測(cè)3’arm(預(yù)期PCR產(chǎn)物的長度約為1.7kb)。圖5電穿孔轉(zhuǎn)染后可能陽性的克隆斑的顯微照片。由左往右，依次為轉(zhuǎn)染后可能陽性的PK-15克隆斑在明場(chǎng)(bright)、綠色熒光蛋白(GFP)激發(fā)波長和紅色熒光蛋白(RFP)激發(fā)波長下的顯微照片。明場(chǎng)下可見PK-15細(xì)胞的大小、形態(tài)均正常。綠色熒光蛋白(GFP)激發(fā)波長下可見該克隆斑發(fā)出明亮的綠色熒光，而紅色熒光蛋白(RFP)激發(fā)波長下無明顯可見的紅色熒光，證明neo和EGFP選擇性標(biāo)記已經(jīng)整合至基因組中，而RFP沒有整合進(jìn)去，很可能就是所需要的陽性克隆。圖65’同源重組邊界的確認(rèn)。在整合位點(diǎn)的5′arm設(shè)計(jì)跨界引物，擴(kuò)增豬基因組DNA與外源基因neo之間的片段，反證外源基因的插入位置。1號(hào)泳道為DL2000DNALadder，2號(hào)泳道和3號(hào)泳道為未修飾豬基因組DNA為模板，4號(hào)泳道為水模板，5－9號(hào)泳道為50ng克隆斑所提的基因組DNA為模板。電泳及測(cè)序結(jié)果顯示在所挑選的克隆斑即轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，PCR擴(kuò)增出759bp的特異片段，而在所有陰性對(duì)照中均無該片段。證明外源基因的插入位置與理論分析相符。圖73’同源重組邊界的確認(rèn)在整合位點(diǎn)的3′arm設(shè)計(jì)跨界引物，擴(kuò)增豬基因組DNA與外源基因EGFP之間的片段，反證外源基因的插入位置。1號(hào)泳道為DL2000DNALadder，2號(hào)泳道和3號(hào)泳道為未修飾豬基因組DNA為模板，4號(hào)泳道為水模板，5－9號(hào)泳道為50ng克隆斑所提的基因組DNA為模板。電泳及測(cè)序結(jié)果顯示在所挑選的克隆斑即轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，PCR擴(kuò)增出1701bp的特異片段，而在所有陰性對(duì)照中均無該片段。證明外源基因的插入位置與理論分析相符。圖8打靶效率統(tǒng)計(jì)表經(jīng)過G418篩選后的細(xì)胞，逐漸形成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的克隆斑，挑選只發(fā)綠色熒光的單克隆至12孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量足夠多時(shí)，用胰酶消化后取部分提基因組供檢測(cè)用。最后，統(tǒng)計(jì)表明：只發(fā)綠色熒光的單克隆有30個(gè)，其中有26個(gè)克隆經(jīng)檢測(cè)發(fā)生了同源重組即選擇性標(biāo)記的外源基因整合至預(yù)期的T2位點(diǎn)，打靶效率高達(dá)86.7％。這充分表明該編輯靶位點(diǎn)T2可以高效敲除MSTN基因。具體實(shí)施方式本發(fā)明是以pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體為骨架構(gòu)建插入有豬肌抑素基因(MSTN)編輯靶位點(diǎn)T2的Cas9gRNA表達(dá)載體T21，并將其與帶有靶位點(diǎn)附近同源臂的打靶載體dT2按照一定的摩爾比例轉(zhuǎn)染豬腎PK15細(xì)胞，以G418輔助篩選，最后僅挑選只發(fā)綠色熒光的單克隆并進(jìn)行PCR檢測(cè)和測(cè)序分析以確認(rèn)5’arm和3’arm是否插入到預(yù)期的靶位點(diǎn)。以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的闡釋。需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做出限制或限定。實(shí)施例1插入有豬肌抑素基因(MSTN)編輯靶位點(diǎn)T2的Cas9gRNA表達(dá)載體T21的構(gòu)建(1)主要試劑與材料來源pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(MammalianExpression,CRISPRhumanizedS.pyogenesCas9)載體購自Addgene，打靶載體dT2為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)。AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶均購自Fermentas。重組載體按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超純質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行。DNA割膠回收試劑盒購自Qiagen公司。測(cè)序委托深圳華大基因有限公司完成。(1)Cas9gRNA表達(dá)載體是以購買的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體為骨架，然后按照固定的oligo設(shè)計(jì)模式插入所需的引導(dǎo)序列即可。引導(dǎo)序列5’CACCGGATTTTGAAGCTTTTGGATGGG3’和5’AAACCCCATCCAAAAGCTTCAAAATCC3’及測(cè)序引物Cas9-S：5’gagggcctatttcccatgattcc3’(位于U6啟動(dòng)子上游)，均由上海英駿生物科技有限公司合成，以干粉形式分裝、運(yùn)輸、保存。引物用滅菌后的ddH2O稀釋為10μmol/L的溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?1)操作步驟。－限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9載體，反應(yīng)體系如下:成分初始濃度用量終濃度BufferTangoTM10×3μl1×AgeI10units/μl1μl0.33unit/μlEcoRI10units/μl1μl0.33unit/μlpX330質(zhì)粒1000ng/μl3μl100ng/μl總體積30μl在冰上將以上成分依次加入，充分混勻。放在37℃水浴鍋中酶切過夜。－按照Qiagen公司DNA回收試劑盒的步驟回收上述酶切產(chǎn)物。－將回收的酶切產(chǎn)物連接，反應(yīng)體系如下：在冰上將以上成分依次加入，充分混勻。放在37℃水浴鍋中連接過夜。結(jié)束后置于冰上，用于轉(zhuǎn)化。－轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化體系如下：成分用量連接產(chǎn)物10μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞100μl總體積110μl將以上成分混勻，冰浴30min；42℃熱激90s；加入不含有氨芐抗生素的液體LB培養(yǎng)基500μl，置于37℃搖床以200rpm/min的轉(zhuǎn)速復(fù)蘇45min；在臺(tái)式離心機(jī)上以8000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心，將菌體沉淀下來，然后去除450μlLB培養(yǎng)基；將剩余的100μl樣品涂布在。氨芐青霉素LB平板上，置于37℃溫箱過夜培養(yǎng)16h。挑取細(xì)菌單克隆送深圳華大測(cè)序。實(shí)施例2電穿孔轉(zhuǎn)染后豬轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選(1)主要試劑與材料來源豬腎PK15細(xì)胞系購自ATCC。無內(nèi)毒素質(zhì)粒制備按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超純質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行。G418抗生素購自Sigma。DMEM、DPBS、胎牛血清、DMSO購自Invitrogen。電轉(zhuǎn)緩沖液實(shí)驗(yàn)室自行配制。BTX2001細(xì)胞電融合儀購自美國BTX公司。(2)操作步驟－細(xì)胞鋪板：電穿孔前一天，將PK15細(xì)胞用胰酶消化為單細(xì)胞懸液后，按照0.25-1×106細(xì)胞/孔鋪于6孔板，生長過夜。－消化細(xì)胞：根據(jù)細(xì)胞密度和數(shù)量取適量的胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞(對(duì)于PK15，一般6孔板需要加入0.25％胰酶溶液0.5-1mL/孔，39℃培養(yǎng)箱孵育5-10min，在顯微鏡下觀察到有少量細(xì)胞開始脫落即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化)，反復(fù)吹打使貼壁細(xì)胞完全脫離下來并分散成單細(xì)胞。－收集、重懸細(xì)胞：將細(xì)胞懸液收集到潔凈無菌的離心管中，先用DPBS重懸細(xì)胞，2400rpm離心3－5min，棄上清，再用電轉(zhuǎn)緩沖液將細(xì)胞重懸，再次離心(為了確保將細(xì)胞徹底洗滌干凈，可以用電轉(zhuǎn)緩沖液洗細(xì)胞兩次)。棄上清，加入適量電轉(zhuǎn)緩沖液和質(zhì)粒，輕輕吹打使細(xì)胞、質(zhì)粒和電轉(zhuǎn)液充分混勻。－電擊：提前開啟電轉(zhuǎn)儀預(yù)運(yùn)行1-2分鐘并設(shè)置好電壓、電擊時(shí)間和電擊次數(shù)等參數(shù)(100V,3ms,1pulse)，吸取適量的細(xì)胞混合液加入潔凈的電擊杯(電擊杯直徑10mm對(duì)應(yīng)樣品總體積50μL)盡量混勻，避免氣泡，然后將電擊杯放入電擊卡槽里，放置電擊杯時(shí)一定要使電擊杯金屬面和卡槽電極緊貼，關(guān)上蓋子，按Automaticstart進(jìn)行電擊。－培養(yǎng)：電擊完成后可見wait指示燈停止閃爍后，取出電擊杯，用細(xì)長的吸頭吸出樣品轉(zhuǎn)入提前預(yù)熱好的非選擇性培養(yǎng)基內(nèi)。做好相關(guān)的標(biāo)記，將培養(yǎng)板放入39℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，關(guān)閉儀器電源并清洗電擊杯(清水－蒸餾水－酒精－干燥)。培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)胞生長情況，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染效率，拍照記錄。－G418篩選：培養(yǎng)24h后，將貼壁良好的細(xì)胞用胰酶消化為單細(xì)胞懸液，按照1:20的密度分盤，傳至10cm培養(yǎng)皿，逐漸根據(jù)細(xì)胞死亡情況調(diào)整G418的添加量，持續(xù)培養(yǎng)直到單個(gè)細(xì)胞成長為肉眼可見的克隆斑。－克隆斑分離采用胰酶點(diǎn)消化法分離單克隆細(xì)胞。將2μl胰酶吸到單克隆細(xì)胞上，消化30s后輕輕吸打，將細(xì)胞吸起，傳至12孔板中。12孔板培養(yǎng)基內(nèi)含有100μg/ml的G418，用以維持單克隆細(xì)胞的生長。待細(xì)胞蔓延整個(gè)6孔板后，即可凍存、采樣，用于后續(xù)分析。附：電轉(zhuǎn)緩沖液配方：實(shí)施例3選擇性標(biāo)記插入位置的確認(rèn)與打靶效率統(tǒng)計(jì)分析(1)主要試劑與材料來源TaKaRaLATaq及其配套的緩沖液(10×buffer)，dNTP，MgSO4均購自東洋紡生物科技有限公司。哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒購自康為世紀(jì)。測(cè)序委托深圳華大基因有限公司完成。檢測(cè)陽性克隆5’arm的一對(duì)特異性引物為T2-Up和MKR，預(yù)期PCR產(chǎn)物的長度約為759bp，檢測(cè)3’arm的一對(duì)特異性引物為EGFP-QF1和T2-Down，預(yù)期PCR產(chǎn)物的長度約為1.7kb。引物由上海英駿生物科技有限公司合成，以干粉形式分裝、運(yùn)輸、保存。引物用滅菌后的ddH2O稀釋為10μmol/L的溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)操作步驟－按照康為世紀(jì)提供的哺乳動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒說明書制備單克隆細(xì)胞系的基因組DNA，電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，將濃度調(diào)整至20ng/μl。－5’armPCR檢測(cè)：PCR的反應(yīng)體系為：在冰上將以上成分依次加入，充分混勻。放入PCR儀中按照下述條件運(yùn)行：－將PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳并委托深圳華大基因有限公司測(cè)序，確認(rèn)選擇性標(biāo)記基因是否在編輯靶位點(diǎn)的5’arm區(qū)正確整合。－3’armPCR檢測(cè)：PCR的反應(yīng)體系為：在冰上將以上成分依次加入，充分混勻。放入PCR儀中按照下述條件運(yùn)行：－將PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳并委托深圳華大基因有限公司測(cè)序，確認(rèn)選擇性標(biāo)記基因是否在編輯靶位點(diǎn)的3’arm區(qū)正確整合。－統(tǒng)計(jì)打靶效率：經(jīng)過G418篩選后的細(xì)胞，逐漸長成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的克隆斑，挑選只發(fā)綠色熒光的單克隆至12孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量足夠多時(shí)，用胰酶消化后取部分提基因組供PCR檢測(cè)用，剩下部分細(xì)胞若為陽性則凍存。實(shí)驗(yàn)中一共挑選到30個(gè)只發(fā)綠色熒光的單克隆，其中有26個(gè)克隆經(jīng)檢測(cè)發(fā)生了同源重組即選擇性標(biāo)記的外源基因整合至預(yù)期的T2位點(diǎn)，則統(tǒng)計(jì)的打靶效率為86.7％。這充分表明該編輯靶位點(diǎn)T2可以高效敲除MSTN基因，且外源的選擇性標(biāo)記基因可經(jīng)同源重組定點(diǎn)整合到預(yù)期設(shè)計(jì)的編輯靶位點(diǎn)上。SEQUENCELISTING<110>湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所<120>豬肌抑素基因編輯位點(diǎn)864-883及其應(yīng)用<130><160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>豬<400>1ggattttgaagcttttggatggg23<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>2caccggattttgaagcttttggatggg27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3aaaccccatccaaaagcttcaaaatcc27<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4gagggcctatttcccatgattcc23當(dāng)前第1頁1 2 3