專利名稱：對(duì)dna損傷敏感的抑癌基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是人類和小鼠的對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因全長 mRNA序列，分別編碼一個(gè)進(jìn)化上高度同源的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞的特征是基因組不穩(wěn)定性(genomic instability)，DNA損傷修復(fù)異常 和細(xì)胞周期調(diào)控異常是造成基因組不穩(wěn)定性的原因。以基因組DNA為研究對(duì)象的微陣列比 較基因組雜交(microarray-basedcomparative genomic hybridization, Array-CGH)技 術(shù)是目前國際上發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)新基因的強(qiáng)有力手段。Array-CGH技術(shù)將覆蓋全基因組且已 知順序的DNA克隆做成微陣列，代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH檢測(cè)中將中期染色體作為雜交靶，大大提高了 檢測(cè)DNA拷貝數(shù)異常位點(diǎn)的分辨率；再分別提取腫瘤組織和正常組織的基因組DN A，用cy3 和cy5熒光染料分別標(biāo)記腫瘤組織和正常組織的DNA，進(jìn)行雜交檢測(cè)，在雜交系統(tǒng)中加入 Cotl-DNA用于抑制基因組中重復(fù)序列的干擾，并用自動(dòng)化的掃描儀分析雜交靶上熒光信號(hào) 的相對(duì)強(qiáng)弱，最后用自動(dòng)化分析軟件進(jìn)行定量分析。Array-CGH不僅使檢測(cè)染色體異常的分 辨率提高，而且還可以確定腫瘤相關(guān)基因并提供精確的定位。小分子RNA干擾(RNAi)是多數(shù)真核細(xì)胞本身固有的一種自我保護(hù)現(xiàn)象，既能對(duì)抗 病毒基因或人工轉(zhuǎn)基因所表達(dá)的mRNA等外源基因的侵害，又能降解自身異?；虍a(chǎn)生的 mRNA，使靶向基因的轉(zhuǎn)錄水平降低或沉默，對(duì)含有其同源序列的基因表達(dá)進(jìn)行干涉。RNAi過 程中，由雙鏈RNA分子加工成的19-23個(gè)核苷酸的RNAs就稱為siRNA，是誘導(dǎo)基因沉默的第 一步，它與RNAi特異性酶結(jié)合，形成沉默復(fù)合物，特異降解與siRNA同源的靶mRNA，針對(duì)同 一個(gè)靶mRNA的多種siRNA可以協(xié)同起作用。近年來，人們利用這一現(xiàn)象特異性阻斷要研究 的基因，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺失表型，形成RNAi技術(shù)。染色體脆性位點(diǎn)(fragile site)是正?；蚪M中位點(diǎn)特異的不穩(wěn)定區(qū)域，包括 39個(gè)稀有型脆性位點(diǎn)(rare fragile site)和88個(gè)普通型脆性位點(diǎn)(common fragile site, CFS)。正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下不出現(xiàn)染色體脆性位點(diǎn)；當(dāng)細(xì)胞中DNA復(fù)制被部分抑制 時(shí)，在有絲分裂中期染色體中形成缺口或斷裂區(qū)。CFS位點(diǎn)基因具有進(jìn)化上保守、與癌癥發(fā) 生密切相關(guān)、可能參與DNA損傷反應(yīng)信號(hào)調(diào)控等特征，極有可能是腫瘤發(fā)生早期起關(guān)鍵調(diào) 控作用的候選分子標(biāo)志物。尋找確定CFS位點(diǎn)基因的新途徑、發(fā)掘和鑒定新的CFS基因并 闡明其重要功能和分子作用機(jī)制，不僅能發(fā)現(xiàn)癌癥的新型生物標(biāo)志物，并用于癌癥的風(fēng)險(xiǎn) 預(yù)測(cè)和分子診斷研究，探索癌癥防治新方法，還能為抗癌新藥的創(chuàng)制提供具有市場(chǎng)開發(fā)前 景的分子靶標(biāo)。因此發(fā)掘、鑒定和克隆有重要功能的癌癥相關(guān)新基因具有高科技研究和應(yīng) 用的雙重價(jià)值，是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究的制高點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是通過建立小鼠腫瘤模型，利用Array-CGH技術(shù)分析小鼠淋巴瘤基因組 中的DNA缺失和擴(kuò)增區(qū)域，提供一個(gè)功能未知的定位于小鼠七號(hào)染色體末端一個(gè)高頻率缺失的普通型脆性位點(diǎn)的對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，并將該基因編碼一個(gè)新蛋白，為候選抑癌基因。為抗癌新藥的創(chuàng)制提供具有市場(chǎng)開發(fā)前景的分子靶標(biāo)。本發(fā)明所述一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，其編碼蛋白的氨基酸序列在進(jìn) 化上高度保守，在腫瘤基因組中缺失頻率高達(dá)70%，在多種癌細(xì)胞中表達(dá)沉默，并參與DNA 損傷反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)，具有維持細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)的功能，并具有抗腫瘤活性，其鼠與人的核酸序 列分別見序列表1和序列表2。所述的一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，該基因序列在SKBR3，MCF-7， MDA-MB-468，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，肺癌細(xì)胞系，卵巢癌細(xì)胞系，宮頸癌細(xì)胞系，以及結(jié)腸癌細(xì) 胞系中表達(dá)沉默。所述的一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，該編碼蛋白的氨基酸序列人與鼠相 同氨基酸比例達(dá)65.4%。正常細(xì)胞存在細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)控制功能，在DNA損傷后被激活，阻止細(xì)胞在DNA損傷 修復(fù)完成之前進(jìn)入有絲分裂(M期)。但我們研究發(fā)現(xiàn)用RNAi技術(shù)干擾FATS基因的正常 表達(dá)后，在DNA損傷后細(xì)胞進(jìn)入M期的比例顯著上升，表明細(xì)胞周期G2節(jié)點(diǎn)功能嚴(yán)重受損， 證明FATS基因?qū)τ诰S持基因組穩(wěn)定性有重要作用。上述本發(fā)明提供一個(gè)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，為進(jìn)一 步的腫瘤基因治療和分子機(jī)制研究、以及與FATS蛋白三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的抗癌藥物開發(fā)提 供了一個(gè)新的基礎(chǔ)。


圖1是小鼠的抑癌基因核酸序列；圖2是人源的抑癌基因核酸序列；圖3是蛋白質(zhì)氨基酸順序比對(duì)圖；圖4是RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果；圖5是有絲分裂細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。一.實(shí)驗(yàn)材料來源小鼠模型用p53雜合子近交系C57BL/6小鼠建立。用Y -射線(4Gy)單劑量照射， 4-6月后收集胸腺淋巴瘤組織，提取基因組DNA。人癌細(xì)胞系MDA-MB-231，SKBR3, MCF-7， MDA-MB-468, U20S, H1299, SK0V3/ip-l, HeLa,以及HCT116 購自美國 American Type Culture Collection (ATCC) Cotl-DNA 購自 Invitrogen 公司。二.實(shí)施方法1. Array-CGH 實(shí)驗(yàn)用覆蓋小鼠全基因組的BAC文庫DNA制備DNA芯片，每張玻璃芯片含19000個(gè) 微陣列BAC克隆。提取小鼠胸腺淋巴瘤組織DNA，以正常小鼠的基因組DNA作為對(duì)照， 分別用cy3和cy5熒光染料分別標(biāo)記腫瘤組織和正常組織的DNA，進(jìn)行雜交檢測(cè)，在雜交 系統(tǒng)中加入Cotl-DNA用于抑制基因組中重復(fù)序列的干擾，并用自動(dòng)化的掃描儀ImaGene4.0(BiODiSCOVery公司)分析雜交靶上熒光信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱，最后周自動(dòng)化分析軟件 Excel-Macro進(jìn)行定量分析。如圖1所示，圖中劃線處分別為蛋白質(zhì)翻譯起始密碼和終止密碼。陰影部分是小 鼠FATS基因的最大外顯子序列?；驇?Genbank)收錄號(hào)碼為NM-001081331。
該新基因的人源序列位于人類10號(hào)染色體10q26. 2區(qū)，恰好位于一個(gè)普通型 染色體脆性位點(diǎn)FARlOF內(nèi)，我們將其命名為FATS (Fragile-site Associated Jumor Suppressor)。如圖2所示，圖中劃線處分別為FATS蛋白質(zhì)翻譯起始密碼和終止密碼，藍(lán)色 區(qū)域?yàn)椴煌怙@子間隔，大寫字母區(qū)為蛋白翻譯區(qū)?；驇?Genbank)收錄號(hào)碼為 NM-OO1004298。2.生物信息學(xué)分析通過比較基因組學(xué)分析，用美國國家國家衛(wèi)生研究所網(wǎng)上提供的分析軟件(// www. ncbi. nlm. nih. gov)分析CGH結(jié)果，確認(rèn)FATS基因定位和mRNA核酸序列，并用上述軟 件將人FATS基因和小鼠FATS基因的mRNA表達(dá)序列進(jìn)行比對(duì)。氨基酸順序比對(duì)結(jié)果如圖3所示，黑底白字區(qū)為氨基酸殘基完全相同區(qū)，深灰色 區(qū)為氨基酸殘基保守區(qū)，淡灰色區(qū)為氨基酸殘基半保守區(qū)；FATS蛋白質(zhì)氨基酸序列在人和 小鼠中高度保守。3. RT-PCR 實(shí)驗(yàn)利用美國麻省理工大學(xué)在網(wǎng)上提供的設(shè)計(jì)軟件(//frodo. wi. mit. edu)選擇針對(duì) 人FATS基因的引物序列，合成以下FATS特異的引物5，-CAATAAGCGAAGCCCTGAAG-3，禾口 5’ -TTGGAGAGCTATCCCCAATG-3’。用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，電泳檢測(cè)質(zhì)量，紫外分光定量。以相同量RNA作 為起始模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。用PCR儀GeneAmp9700上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為 94°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)30次。用瓊脂糖凝膠電 泳分析結(jié)果，參見圖4，mRNA表達(dá)水平，以GAPDH管家基因的mRNA表達(dá)水平作為對(duì)照，圖4 中1. FATS 基因在乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)、2. SKBR3、3. MCF-7、4. MDA-MB-468、5.神經(jīng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U20S)、6.肺癌細(xì)胞系(H1299)、7.卵巢癌細(xì)胞系(SK0V3/ip_l)、8.宮頸癌 細(xì)胞系(HeLa),9.結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116)。FRA10F所在的10q26q區(qū)域與腫瘤有很強(qiáng)的相關(guān)性，證據(jù)表明10q26在黑色素瘤、 神經(jīng)膠質(zhì)瘤和子宮內(nèi)膜癌中均是高頻率雜合子丟失(loss ofheterozygosity, L0H)位點(diǎn)。 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果還表明FATS基因在多種癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著下降或不表達(dá)。以上 結(jié)果證實(shí)FATS不僅是脆性位點(diǎn)新基因，而且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。4.制備針對(duì)FATS基因的特異性干擾RNAFATS 特異性干擾 RNA(siRNA)用 Block-iT RNAi topo 轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen 公司)制備。首先用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增一段160bp FATS特異性序列，所用引物順序?yàn)?(5' -CTCAGCCTCCGCTGTAGTTC-3‘和 5' -CCTTCCAGTGACCACCTTGT-3‘)，模板來自小鼠心 臟cDNA。PCR產(chǎn)物與T7啟動(dòng)子linkers連接，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分別產(chǎn)生正義和反義的RNA模板 并進(jìn)行退火形成雙鏈RNA。最后經(jīng)Dicer酶消化和純化，得到FATS_siRNA混合物。稀釋至 0. 1 μ g/ μ 1并分裝儲(chǔ)存于-80C。
5.用RNA干擾技術(shù)分析FATS基因表達(dá)缺陷對(duì)基因組穩(wěn)定性影響用FATS特異小分子干擾RNA(SiRNA)轉(zhuǎn)染正常胚胎成纖維細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞 用非特異性siRNA轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后，用Y-射線(IOGy)照射細(xì)胞引入DNA損傷，接著與 nocodazole (0. 2 μ g/ml)孵育24h，在熒光顯微鏡下觀察進(jìn)入分裂期的細(xì)胞數(shù)，至少分析 200個(gè)細(xì)胞(P < 0.01)，參見圖5。SEQUENCE LISTING〈110〉天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院〈120〉對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列
<130>DNA<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2425<212>DNA<213>2 Ambystoma laterale χ Ambystoma jeffersonianum〈220〉〈221〉鼠〈222〉⑴·· (2425)〈223〉〈400〉1tacagaagaa gagaggccct gacagggtca gaatgctgaa gtcagagctg gtggccagcc 60ttccagtgtt caacacactc ctgggagcct tacctccaca agcccaggct gagagacact 120ggcatcacag aacacaagaa tgatatcacc tgtggtcatt tcccggctga ttgatgaaaa 180gaaatctatg gaaaatggag caatattgcc acaagccatt gctcagcctc agctgtgtcc 240cacaaagcca gctttggcca ggcgcgatgg agtgagcatg cacaggcgat ttgctttatc 300tccagacaga ctgggaattt tgactccatc agatgatcaa ggactggaga cagaaccgct 360gtctacaggg gacaatctag gcaaaggttc ccacagcggt ttctcgtcta tcaccattac 420tgcccgacgt gtgggccctc cagccagcag cttggtatgg gacactttta gggacccact 480gtgtcccaag tgcaaagcca aggatgctct gttccaagag cccccagttc tggctggtga 540tgcccatctc tgtcagcaca atagaccctt cacctgtaca gagtccccca gcaatggctc 600cgtagagggg atgaaggttt tccaggctca ctcaaggctg agtgcaaggc aggactactg 660ggtcacccac acgaatgaca atgaggacag tttttcttca gacaattcac catcgagaaa 720agtcccactg gtgttcagtt cttgtgtcca cttccgggtg tctcagcagt gtcccaatgc 780catttactat ttggacaagt ctctttctgt tccccttgag cgacctcaaa ttgctagccc 840caaaatgcac aggtctgtcc tgtctctcag cctccgctgt agttcccacc agttaacagc 900agatggagta gacagctcag ctaatggaga gccaatcagc acagctctat cacaggaact 960ctcggaggga aagcaggacc tcctaggtcc acaatggggc cagccacaag gtggtcactg 1020gaaggagagc ccagcattgg tgccagtaca tttggggagt ggcacatgcc ctcggactgg 1080ctcccctcca ctggaaaatg tcaaatttgc agacgtggga aggaaccagg tcccagtacg 1140aaaggagaaa gaggaccatg caacatgtac cagtagcagc cacaccaacc aactctccat 1200
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aaaaaaa309權(quán)利要求
一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，其特征是該編碼蛋白的氨基酸序列在進(jìn)化上高度保守，在腫瘤基因組中缺失頻率高達(dá)70％，在多種癌細(xì)胞中表達(dá)沉默，并參與DNA損傷反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)，具有維持細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)的功能，并具有抗腫瘤活性，其人與鼠核酸序列分別見序列表1和序列表2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，其特征是該基因序列 在SKBR3，MCF-7，MDA-MB-468，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，肺癌細(xì)胞系，卵巢癌細(xì)胞系，宮頸癌細(xì)胞 系，以及結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)沉默。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，其特征是該編碼蛋白 的氨基酸序列人與鼠相同氨基酸比例達(dá)65.4%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一段對(duì)DNA損傷敏感的抑癌基因序列，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該序列位于腫瘤基因組中的一個(gè)高頻缺失區(qū)域，在多種癌細(xì)胞中表達(dá)異常。該編碼蛋白的氨基酸序列在進(jìn)化上高度保守，在腫瘤基因組中缺失頻率高達(dá)70％，在多種癌細(xì)胞中表達(dá)沉默，并參與DNA損傷反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)，具有維持細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)的功能，并具有抗腫瘤活性，用小分子RNA干擾技術(shù)抑制FATS基因的表達(dá)后，導(dǎo)致正常細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性被破壞，表現(xiàn)為DNA損傷后細(xì)胞周期G2節(jié)點(diǎn)功能受損。本發(fā)明為進(jìn)一步的腫瘤基因治療和分子機(jī)制研究、以及與FATS蛋白三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的抗癌藥物開發(fā)提供了一個(gè)新的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101798572SQ200910067829
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日
發(fā)明者李政 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院