本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類被子植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族基因的發(fā)現(xiàn)、其編碼蛋白轉(zhuǎn)錄抑制活性的檢測、以及其在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。首先是在擬南芥中證實所述基因編碼一個全新的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族，通過氨基酸序列同源比對發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于被子植物中，通過基因敲除可以提高植物的抗逆性，從而可以應(yīng)用于植物改良。

背景技術(shù)：

逆境脅迫，包括鹽堿、干旱、冷害等非生物脅迫和病蟲害侵染等生物脅迫等影響植物的生長發(fā)育，是農(nóng)林生產(chǎn)的最大制約因素之一。因此通過基因改良的方法提高植物對逆境的抗性是目前分子育種中的最為常用的方法。脫落酸(ABA)是最為重要的植物激素之一，與種子萌發(fā)、根系發(fā)育、植株衰老等生長發(fā)育過程密切相關(guān)，尤為重要的是，ABA在調(diào)控植物的對非生物脅迫的適應(yīng)方面起著非常重要的作用，外源ABA處理可以提高植物對非生物脅迫的抗性。隨著對ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的解析，人們發(fā)現(xiàn)包括ABA受體PYR/PYL/RCAC、蛋白磷酸酶PP2C、蛋白激酶SnRK2等參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。PYR/PYL/RCAC受體蛋白在和ABA結(jié)合后會與下游的PP2C結(jié)合并抑制其磷酸酶活性，從而解除對SnRK2的抑制作用，導(dǎo)致其磷酸化，磷酸化的SnRK2可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活A(yù)BA響應(yīng)基因的表達(dá)。而鹽堿、干旱、冷害等非生物脅迫可以促進(jìn)ABA的合成，從而激活A(yù)BA信號途徑，誘導(dǎo)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。

到目前為止，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括MYB、NAC、bZIP等多個家族的轉(zhuǎn)錄因子參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而過量表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因可以增強(qiáng)植物的抗逆性，因此在植物的分子育種中具有潛在的應(yīng)用價值。但是，基因的過量表達(dá)涉及到轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管問題，這嚴(yán)重制約了已知參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的商用價值。本發(fā)明中涉及到的是一類新型的受ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族基因，ABA-induced transcription repressors(AITRs),發(fā)明人首先證明擬南芥的AITRs是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子家族，通過利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BALST發(fā)現(xiàn)其是一類植物特有的蛋白家族，而通過同源比對發(fā)現(xiàn)在Phytozome網(wǎng)站所列出的所有被子植物中都存在，在包括水稻、玉米、高粱、谷子、番茄、馬鈴薯、黃瓜、大豆、油菜等43中被子植物中總共發(fā)現(xiàn)168個AITRs編碼基因，而對大豆、番茄等植物的AITRs進(jìn)行分析證明其具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，說明AITRs是被子植物特有的一個參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新型的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族，過表達(dá)或敲除AITRs基因能夠影響植物對ABA及逆境脅迫的響應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首次證明擬南芥的AITRs是一個新型的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族，并通過同源比對從43中被子植物中找到共計168個同源蛋白，對大豆和番茄的AITRs檢測表明其具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，說明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的是一個植物特有的在被子植物中保守的轉(zhuǎn)錄因子家族。敲除擬南芥基因的AITRs基因影響植物對ABA及逆境脅迫的耐受增強(qiáng)，從而確定其參與負(fù)調(diào)控植物對非生物脅迫的響應(yīng)，敲出植物的相應(yīng)AITRs基因可增強(qiáng)植物對非生物脅迫的抗性。

所以，本發(fā)明的主要目的是提供了一個可用于基因改良提高植物對非生物脅迫抗性的轉(zhuǎn)錄因子基因家族。

為了鑒定新型的參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，本發(fā)明人首先利用已有的一些基因組及芯片分析數(shù)據(jù)，找到大量受ABA誘導(dǎo)的基因，對相關(guān)基因編碼蛋白分析發(fā)現(xiàn)其中一個蛋白的氨基酸序列中具有轉(zhuǎn)錄因子Aux/IAAs及ERFs所具有的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域LxLxL，同源比對發(fā)現(xiàn)擬南芥中共有6個基因編碼類似蛋白，我們分別將其命名為AITR1/At3g27250、AITR2/At3g48510、AITR3/At5g40790、AITR4/At5g40800、AITR5/At5g50360及AITR6/At5g63350。定量RT-PCR結(jié)果表明所有6個基因的表達(dá)都受到ABA的誘導(dǎo)，而利用擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)所有6個AITRs都定位于細(xì)胞核中，且都能夠抑制報告基因的表達(dá)，表明其是一個受ABA誘導(dǎo)的新型的轉(zhuǎn)錄因子家族基因。

利用AITRs的全長氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站基因BLAST，發(fā)明人未在植物以外的物中發(fā)現(xiàn)同源蛋白，說明其是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族。再通過利用AITRs的全長氨基酸序列在Phytozome網(wǎng)站BLAST各個不同植物，申請人發(fā)現(xiàn)AITRs同源蛋白只存在于被子植物中，從包括水稻、玉米、高粱、谷子、番茄、馬鈴薯、黃瓜、大豆、油菜等42中植物中總共發(fā)現(xiàn)162個同源蛋白編碼基因。

利用RT-PCR發(fā)現(xiàn)大豆和番茄的AITRs基因的表達(dá)也是受ABA誘導(dǎo)，擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染體系也同樣證實大豆和番茄的AITRs具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，表明AITRs是在被子植物中保守的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族。

在pZP211雙元表達(dá)載體中插入克隆得到的的AITR1-AITR6基因，并且轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染擬南芥獲得了過量表達(dá)植株。利用從TAIR訂購的T-DNA插入突變體中，篩選到4個AITRs基因的敲除突變體，利用雜交獲得了相應(yīng)的雙及三突變體。利用AITRs基因的過表達(dá)及敲除突變體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)敲出突變體對ABA及鹽堿等非生物脅迫的敏感性下降，說明其參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物對非生物脅迫的抗性，而敲出相關(guān)AITRs基因可提高植物對非生物脅迫的抗性。

本發(fā)明提供了一個參與調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物對非生物脅迫抗性的植物特有的新型的轉(zhuǎn)錄因子家族，敲出相關(guān)AITRs基因可提高植物對非生物脅迫的抗性。

本發(fā)明提供了可用于通過分子育種進(jìn)行基因候選編輯基因，可用于培育抗逆性增強(qiáng)的植物新品種。

附圖說明

圖1.擬南芥AITRs基因的表達(dá)受到ABA的誘導(dǎo)；

圖2.擬南芥AITRs是新的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族；

圖3.只有被子植物中才有AITRs同源蛋白；

圖4.大豆和番茄的AITRs也是受ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制因子；

圖5.擬南芥AITRs基因敲除突變體對ABA及非生物脅迫響應(yīng)降低。

具體實施方式

在下面的具體實施例子中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：

擬南芥AITRs的獲得

根據(jù)發(fā)明人所測的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)六個功能未知相關(guān)基因At3g27250、At3g48510、At5g40790、At5g40800、At5g50360和At5g63350的表達(dá)都受到ABA誘導(dǎo)，qRT-PCR結(jié)果也證明外源ABA處理可以誘導(dǎo)6個基因的表達(dá)，并且這些基因在ABA合成突變體aba1-5中的表達(dá)顯著降低(附圖1)。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)At3g27250的氨基酸序列中具有轉(zhuǎn)錄抑制域LxLxL，利用擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染檢測發(fā)現(xiàn)所有6個基因編碼的蛋白都定位于細(xì)胞核中，也都能夠抑制報告基因的表達(dá)。為了反應(yīng)其特性，發(fā)明人將其依次命名為ABA-induced transcription repressor1(AITR1)、AITR2、AITR3、AITR4、AITR5和AITR6(附圖2)。結(jié)果表明：AITRs是一個新的轉(zhuǎn)錄因子家族。

實施例2：

不同植物中AITRs的獲得

利用AITR1的氨基酸全序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST檢測，發(fā)現(xiàn)只有植物中才有其同源蛋白。利用AITR1的氨基酸全序列在phytozome網(wǎng)站對每一種植物進(jìn)行BLAST檢測發(fā)現(xiàn)，只有被子植物中才有其同源蛋白編碼基因(附圖3)，并且所有被子植物中都有數(shù)目不等的同源蛋白編碼基因，在除擬南芥外的其它42中植物中共發(fā)現(xiàn)162個同源蛋白編碼基因。包括擬南芥在內(nèi)的43種不同植物的AITRs的編碼基因的相關(guān)信息相見表1。結(jié)果表明：AITRs是在一個在被子植物中保守蛋白家族。

表1.AITRs在被子植物中的分布

Table 1.AITRs in angiosperms

實施例3：

大豆和番茄AITRs的轉(zhuǎn)錄活性檢測

為了檢測其它植物中的AITRs基因是否也同樣受ABA的誘導(dǎo)，發(fā)明人以番茄為例進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)3個番茄的AITRs基因的表達(dá)受到ABA的誘導(dǎo)。發(fā)明人又進(jìn)一步利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)3個番茄的AITRs也都是定位于細(xì)胞核中，并且能夠抑制報告基因的表達(dá)。同樣，6個大豆的AITRs也是轉(zhuǎn)錄抑制因子(附圖4)。結(jié)果說明：AITRs是一個在被子植物中保守的新型的轉(zhuǎn)錄抑制因子家族。

實施例4：

擬南芥AITRs在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物抗逆性中的作用

為了驗證AITRs基因的功能，發(fā)明人構(gòu)建了擬南芥6個AITRs基因的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物，并從訂購的T-DNA插入突變體中鑒定篩選到了其中4個基因的敲除突變體，然后又利用有性雜交構(gòu)建了雙及三突變體。利用這些轉(zhuǎn)基因植株及突變體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)突變體對ABA及非生物脅迫的敏感性降低(附圖5)。結(jié)果說明：敲除AITRs基因可以提高植物對非生物脅迫的抗性。