本發(fā)明屬于食品檢測和動物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒定牛肉的方法，適用于鑒定未知樣品是否是牛肉或是否含有牛肉成份。
背景技術(shù)：
隨著我國居民生活水平的提高，僅國內(nèi)生產(chǎn)的肉類遠(yuǎn)不能滿足市場需求，需要從國外進(jìn)口一部分肉類。這些因素為國內(nèi)外不法商販乘虛而入創(chuàng)造了條件。為保障消費者合法權(quán)益，確立有效的肉源性成份鑒定方法十分必要。
PCR (polymerase chain reaction)，即DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是20世紀(jì)80年代發(fā)明的集高度特異性、靈敏性、高效性為一體的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于涉及生物的諸多領(lǐng)域，包括物種鑒定、法學(xué)鑒定、藥品/食品/飼料等諸多樣品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分為傳統(tǒng)PCR和實時熒光定量PCR (qPCR)。
在實際工作中傳統(tǒng)PCR和實時定量PCR均在使用，前者通常耗時長，后者雖檢測時間短，卻存在試劑、耗材及檢測設(shè)備昂貴的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鑒定牛肉的方法。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：一種鑒定牛肉的方法，包括以下步驟：
步驟1：設(shè)計特異性識別牛細(xì)胞色素b基因片段的1對引物；
步驟2：將牛肉總DNA的濃度調(diào)至20 ng/μL作為樣品PCR檢測的模板；
步驟3：使用步驟1的引物和步驟2的模板，借助TaqDNA聚合酶PCR擴增牛細(xì)胞色素b基因特定片段；
步驟4：通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟3的PCR擴增產(chǎn)物；
步驟5：根據(jù)步驟4的電泳檢測結(jié)果，判斷樣品是否是或者是否含有牛肉或牛的其他組織成份。
所述牛細(xì)胞色素b基因片段的1對引物，上游引物堿基序列：5′-aatacactacacatccgacac-3′，下游引物堿基序列：5′-gacccgtaatataagcctcg -3′，濃度均為2 pmol/μL。
所述Taq DNA聚合酶PCR擴增羊線粒體基因特定片段的PCR反應(yīng)體系為10μL，其中10×Buffer：1μL；10 mmol/L dNTPS：0.4μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；5 U/μL Taq：0.1μL；滅菌純水7μL。
所述Taq DNA聚合酶PCR擴增牛細(xì)胞色素b基因特定片段的PCR程序為：94℃變性/25 s，63℃退火/25 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，30次循環(huán)。
所述根據(jù)步驟4的電泳檢測結(jié)果，判斷樣品是否是或含有牛肉或牛的其他組織成份，若出現(xiàn)162 bp PCR產(chǎn)物，表明檢測樣品是或含有牛肉或牛的其他組織成份；反之不是或不含有牛肉或牛的其他組織成份。
本發(fā)明的有益效果：使用自行設(shè)計的識別牛細(xì)胞色素b基因片段的一組引物，結(jié)合TaKaRa公司的rTaq DNA聚合酶，解決了實時定量PCR成本高的問題。該發(fā)明可直接用于鑒定牛肉成份的試劑盒生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例中以牛肉、豬肉、豬肝和羊肉為模板，使用特異性識別牛細(xì)胞色素b基因片段的引物，實施Taq PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜。
具體實施例
現(xiàn)結(jié)合實施例，進(jìn)一步說明使用本發(fā)明的引物結(jié)合Taq DNA聚合酶鑒定牛肉的良好效果。本發(fā)明使用杭州朗基MG96+型PCR儀，但并不限制使用其他公司的儀器。
制備完全相同的4組，分別以牛肉\豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板，其他條件相同，共計4管10μL PCR反應(yīng)體系：其中10×Buffer：1μL；10 mmol/L dNTPS：0.4μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；5 U/μL Taq：0.1μL；滅菌純水7μL。PCR程序如下：94℃變性/25 s，63℃退火/25 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，30次循環(huán)。PCR完成后，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行實驗結(jié)果檢測。
結(jié)果表明，僅在以牛肉總DNA為模板的PCR樣品中檢測到一條位于100-250 bp中間位置的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果162 bp相吻合，而以豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板進(jìn)行PCR擴增的樣品中，沒有檢測到任何條帶，表明本發(fā)明設(shè)計的引物優(yōu)良特異性。