本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)伯氏疏螺旋體病原核酸的PCR方法。

背景技術(shù)：

伯氏疏螺旋體屬于原核生物界（Kingdom Monera）、螺旋體目（Spirochaetidae ）、螺旋體科（Spirochaetaceae）、疏螺旋體屬（Borrelia）（也稱包柔式螺旋體屬）。革蘭氏染色陰性，但不易著色，吉姆薩染、熒光染料染色著色良好，顯微鏡下可看到細(xì)長(zhǎng)的螺旋體。伯氏疏螺旋體具有多個(gè)鞭毛，有大而疏的螺旋3-10個(gè)，長(zhǎng)10-30μm，寬0.2-0.25μm，由表層、外膜、鞭毛、原生質(zhì)四部分組成。在液體培養(yǎng)基中數(shù)個(gè)螺旋體可不規(guī)則地纏繞在一起，呈扭曲狀態(tài)運(yùn)動(dòng)。經(jīng)蜱傳播，可感染禽類等動(dòng)物，可引起禽螺旋體病( Avian Spirochaetosis, AS)。對(duì)人們的食品安全存在威脅，目前為止尚未見針對(duì)該病原的快速檢測(cè)方法，亟需一種快速檢測(cè)伯氏疏螺旋體的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種快速檢測(cè)伯氏疏螺旋體病原的方法，可用于食品安全或肉制品的進(jìn)出口快速檢測(cè)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的采用的具體技術(shù)方案如下：

一種伯氏疏螺旋體的PCR檢測(cè)用引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO.1的上游引物和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的下游引物。

本發(fā)明還提供了一種利用上述引物的檢測(cè)伯氏疏螺旋體非疾病診斷目的的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1）用細(xì)菌核酸提取試劑盒提取待檢樣品的核酸，獲得核酸模板；

2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)

擴(kuò)增體系：每25μL擴(kuò)增體系中包含2×PCR Premix緩沖液12.5μL， 25μmol/L 上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各0.5μL，步驟1）所獲核酸模板溶液1μL，超純水補(bǔ)體積至25μL；

擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72℃延伸5min；

3）將步驟2）中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

4）結(jié)果分析：若有擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶出現(xiàn)則待測(cè)樣品中有伯氏疏螺旋體，否則沒有。

與現(xiàn)有的傳統(tǒng)螺旋體檢測(cè)方法相比，本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)在于：

1、特異性高：一對(duì)引物對(duì)伯氏疏螺旋體的基因組特異性區(qū)域識(shí)別，保證PCR擴(kuò)增的高度特異性，傳統(tǒng)方法則需要分離鑒定、通過(guò)形態(tài)特征和生化試驗(yàn)，進(jìn)行檢測(cè)。

2、檢測(cè)周期短：從采集樣本完成起，4個(gè)小時(shí)即可完成PCR檢測(cè)和結(jié)果的報(bào)告，而傳統(tǒng)方法完成分離鑒定至少7天以上，且伯氏疏螺旋體需要嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)比較困難。

3、穩(wěn)定性高：同一樣品經(jīng)不同的人完成檢測(cè)，結(jié)果的一致性強(qiáng)，尤其適用于大規(guī)模、高通量樣品的檢測(cè)分析，一次可以處理幾十個(gè)樣本。

附圖說(shuō)明

圖1為伯氏疏螺旋體PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖；

圖中：M-DL2000核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.1-陽(yáng)性對(duì)照；1.2-陽(yáng)性樣品；1.3-陰性對(duì)照；

圖2為PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果示意圖；

圖中：M-DNA marker； 2.1-陽(yáng)性對(duì)照；2.2及2.3-陰性對(duì)照； 2.4-伯氏螺旋體，2.5-衣原體；2.6-支原體；2.7-泰勒蟲。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，不當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。

根據(jù)伯氏疏螺旋體的基因組中編碼鞭毛蛋白的fla基因?yàn)閿U(kuò)增的特異性靶基因，用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)了上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，設(shè)計(jì)的引物由生工生物工程(上海)公司合成。序列如下：

SEQ ID NO.1：5′- CTTCTCAAGGCGGAGTTAA -3′；

SEQ ID NO.2：5′- CCTCATCTGTCATTGTAGCA -3′。

實(shí)施例1 病禽中伯氏疏螺旋體的PCR檢測(cè)

采集禽類的全血經(jīng)1000r/min離心10min后，取血清及血細(xì)胞交界處淡白色懸液200～500μL置入1.5 mL離心管中。對(duì)離心管中收集物經(jīng)12000r/min離心10min后棄上清，收集沉淀用于提取核酸；同時(shí)設(shè)立伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)物作為陽(yáng)性對(duì)照；SPF雞血為陰性對(duì)照。

核酸提取：向收集的沉淀中，加入500 μL抽提緩沖液（100 mmol/L氯化鈉，10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，25 mmol/L EDTA pH 8.0，終濃度10 g/L SDS和終濃度0.1 g/L 蛋白酶K）懸浮后，55 ℃水浴中反應(yīng)2 h，同時(shí)設(shè)立伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)物作為陽(yáng)性對(duì)照；SPF雞血為陰性對(duì)照。

以上還可以選擇采集禽類小腸、脾、肝、腎、心、肺等組織臟器，提取核酸。

加入等體積的苯酚：三氯甲烷：異戊醇（苯酚：三氯甲烷：異戊醇比例為25:24:1）反復(fù)12000 r/min離心10 min，將上層液體轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5 mL離心管中，加入1/10體積3 mol/L的乙酸鈉和2倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃放置2 h（或更長(zhǎng)時(shí)間）。12000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入500 μL 70%冷乙醇洗滌一次，盡量棄去上清。待離心管中液體自然干燥后，加入50 μL雙蒸水溶解沉淀，即為DNA模板，-70℃保存?zhèn)溆?。核酸提取可使用等效的商品化?xì)菌核酸提取試劑盒。

PCR擴(kuò)增體系的配置和擴(kuò)增參數(shù)：

擴(kuò)增體系：每25μL擴(kuò)增體系中包含2×PCR Premix緩沖液12.5μL， 25μmol/L SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.2的下游引物各0.5μL，核酸提取步驟中所獲核酸溶液1μL，超純水補(bǔ)體積至25μL；

擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72℃延伸5min；

電泳檢測(cè)步驟是：

配制50x TAE電泳緩沖液：其pH 8.5，所含成分40mMTris堿，40mM醋酸，1mMEDTA。

制膠：將50x TAE 電泳緩沖液稀釋50 倍，配制成1 x TAE 電泳緩沖液，稱取1.5克瓊脂糖微波爐加熱使其溶于100mL 的1 X TAE 電泳緩沖液中，加入1 滴lmg ／mL溴化乙錠，按樣品數(shù)選擇合適的梳子制備凝膠。

電泳：取5μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣到1.5％瓊脂糖點(diǎn)樣孔中，同時(shí)使用DL2000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，按5v/cm的電壓計(jì)算所用電壓，電泳時(shí)間25分鐘，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察。

陽(yáng)性對(duì)照：即以伯氏疏螺旋體參考菌株核酸為模板進(jìn)行的擴(kuò)增，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。

陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，參照DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，待檢樣品出現(xiàn)225bp的特異條帶，伯氏疏螺旋體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如圖1所示。

實(shí)施例2 伯氏疏螺旋體的PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

取衣原體、支原體和泰勒蟲三種感染禽后癥狀相似的三種病原做為特異性實(shí)驗(yàn)供試菌株。

核酸的提取，取以三種供試病原的純培養(yǎng)分別提取核酸作為PCR擴(kuò)增的模板。獲得核酸溶液備用。

PCR擴(kuò)增體系的配置和擴(kuò)增參數(shù)：

擴(kuò)增體系：每25μL擴(kuò)增體系中包含2×PCR Premix緩沖液12.5μL， 25μmol/L SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各0.5μL，核酸提取步驟中所獲核酸溶液1μL，超純水補(bǔ)體積至25μL；

擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)于72℃延伸5min；

電泳檢測(cè)步驟是：

配制50x TAE電泳緩沖液：其pH 8.5，所含成分40mMTris堿，40mM醋酸，1mMEDTA。

制膠：將50x TAE 電泳緩沖液稀釋50 倍，配制成1 x TAE 電泳緩沖液，稱取1.5克瓊脂糖微波爐加熱使其溶于100mL 的1 X TAE 電泳緩沖液中，加入1 滴lmg ／mL溴化乙錠，按樣品數(shù)選擇合適的梳子制備凝膠。

電泳：取5μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣到1.5％瓊脂糖點(diǎn)樣孔中，同時(shí)使用DL2000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，按5v/cm的電壓計(jì)算所用電壓，電泳時(shí)間25分鐘，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察。

陽(yáng)性對(duì)照：即以伯氏疏螺旋體參考菌株核酸為模板進(jìn)行的擴(kuò)增，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，見圖2中2.4條帶。

陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，參照DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，衣原體、支原體和泰勒蟲三種感染禽后癥狀相似的三種病原無(wú)擴(kuò)增，見圖2中2.5,2.6和2.7條帶，說(shuō)明該方法對(duì)檢測(cè)伯氏疏螺旋體是特異的。

廢棄物處理：

依照當(dāng)?shù)鼗驀?guó)家的傳染性與潛在傳染性廢棄物處理規(guī)范來(lái)處理使用或未經(jīng)使用過(guò)的試劑以及污染的廢棄物。

<110> 重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> 一種伯氏疏螺旋體的PCR檢測(cè)用引物和檢測(cè)方法

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.1

cttctcaagg cggagttaa 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO.2

cctcatctgt cattgtagca 20