本發(fā)明涉及玉米南方銹病抗性的分子鑒定，特別是涉及用于玉米南方銹病抗性分子鑒定的分子標(biāo)記的高通量檢測。
背景技術(shù)：
：玉米南方銹病是一種毀滅性的氣流傳播的玉米病害，主要由多堆柄銹菌(PucciniapolysoraUnderw.)引起。玉米南方銹病主要發(fā)生在熱帶與亞熱帶地區(qū)，近年來在溫帶地區(qū)也時有發(fā)生。病害暴發(fā)時，玉米葉片被病菌橙黃色的孢子所覆蓋，導(dǎo)致葉片很快干枯死亡，對玉米生產(chǎn)造成很大的損失，嚴(yán)重時甚至絕收。采用先進(jìn)的分子育種手段，充分利用玉米資源庫中的抗性資源，進(jìn)行抗病育種和抗病性改良是控制玉米南方銹病最經(jīng)濟有效的途徑。研究表明，在玉米10號染色體短臂上，存在一個抗南方銹病的主效基因簇。這個抗南方銹病的主效基因簇包括來源于對南方銹病免疫自交系P25的抗病主效基因RppP25?；蚨ㄎ唤Y(jié)果表明抗南方銹病基因RppP25位于標(biāo)記P091與M271之間的40kb區(qū)間內(nèi)。因此，亟待開發(fā)適合高通量檢測與玉米南方銹病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記物，以及能夠高通量檢測與玉米南方銹病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記物的試劑盒和方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明根據(jù)包含抗玉米南方銹病基因位RppP25的抗南方銹病主效基因簇位點在中國玉米種質(zhì)資源中的單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)信息，獲得適合高通量檢測玉米抗南方銹病主效基因簇位點多態(tài)性的SNP作為分子標(biāo)記物，并且設(shè)計出了用于檢測所獲得的SNP的標(biāo)記引物，以及相應(yīng)的檢測分型方法，可以用于玉米南方銹病抗性的分子診斷與分子標(biāo)記輔助遺傳改良。一方面，本發(fā)明提供了適合高通量檢測玉米南方銹病抗性的玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25位點的一種或者多種SNP分子標(biāo)記物，所述SNP分子標(biāo)記物選自表3中所列的如下SNP標(biāo)記物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869，以玉米參考基因組B73V3版本染色體10為準(zhǔn)，所述A003135對應(yīng)的位置為3,020,570，等位位點1為T，等位位點2為C；A003857對應(yīng)的位置為2,437,710，等位位點1為A，等位位點2為G；A003858對應(yīng)的位置為2,450,914，等位位點1為C，等位位點2為T；A003859對應(yīng)的位置為2,469,304，等位位點1為A，等位位點2為C；A003864對應(yīng)的位置為4,002,339，等位位點1為A，等位位點2為G；A003865對應(yīng)的位置為4,652,445，等位位點1為T，等位位點2為C；A003866對應(yīng)的位置為4,668,571，等位位點1為A，等位位點2為G；A003869對應(yīng)的位置為4,696,425，等位位點1為G，等位位點2為T。SNP位點等位基因型分型有三種：等位基因1純合型，等位基因2純合型，等位基因1和等位基因2雜合型。另一方面，本發(fā)明提供了用于早期高通量檢測玉米穗軸顏色的方法，所述方法包括從待檢測的玉米品種獲得的核酸樣品中鑒定至少一種選自表3中所列的如下SNP標(biāo)記物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)已知序列的具體SNP位點選擇鑒定方法，所述方法例如可以是：直接測序、等位基因-特異性探針雜交、等位基因-特異性引物延伸、等位基因-特異性擴增。具體的鑒定試劑可以選自例如等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。優(yōu)選地，本發(fā)明中的鑒定試劑包括等位基因特異性引物。所述特異性引物可以是選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQIDNO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQIDNO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQIDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQIDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQIDNO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQIDNO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQIDNO:21)；和(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQIDNO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQIDNO:24)。另外，在已知玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位點的特定SNP標(biāo)記物的前提下，采用引物常規(guī)設(shè)計規(guī)則來設(shè)計擴增該段序列的引物，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是普遍掌握的常規(guī)技能，本發(fā)明的檢測方法不限于采用哪些特異性引物組。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)表3中所列的如下SNP標(biāo)記物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869可以設(shè)計出不同的引物對，但都是基于本發(fā)明提供了上述SNP標(biāo)記物這個前提，因此都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供了選自表3中的如下SNP標(biāo)記物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869的一種或者多種在高通量檢測玉米南方銹病抗性中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明提供了篩選玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位點與玉米南方銹病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記物的方法，所述方法包括如下步驟：(1)選擇玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)區(qū)段附近的SNP；(2)根據(jù)所選擇的SNP，基于LGC公司的KASPMasterMix試劑盒設(shè)計對應(yīng)于每個SNP的KASP引物組；(3)以玉米基因組DNA作為模板，利用步驟(2)設(shè)計的KASP引物組進(jìn)行PCR擴增；(4)對經(jīng)PCR擴增后的SNP位點進(jìn)行基因分型，尋找基因分型成功的SNP標(biāo)記物；以及(5)將基因分型成功的SNP標(biāo)記物與有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)量的已知玉米南方銹病抗病表型的樣品進(jìn)行對比，進(jìn)行T-TEST計算，選擇差異達(dá)到顯著水平的P<0.05的SNP分子標(biāo)記物作為與玉米南方銹病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記物。優(yōu)選地，所述與玉米南方銹病抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記物為選自表3中的玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位點的如下SNP標(biāo)記物的一種或者多種：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定選自表3中的如下SNP標(biāo)記物的等位基因特異性引物組：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。所述等位基因特異性引物組可以是根據(jù)LGC公司的KASPMasterMix試劑盒設(shè)計的KASP引物組，例如，可以是選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQIDNO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQIDNO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQIDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQIDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQIDNO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQIDNO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQIDNO:21)；和(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQIDNO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQIDNO:24)。另外，在已知玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25(Rpp25基因)位點的特定SNP標(biāo)記物的前提下，采用引物常規(guī)設(shè)計規(guī)則來設(shè)計擴增該段序列的引物，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是普遍掌握的常規(guī)技能，本發(fā)明的檢測方法不限于采用哪些特異性引物組。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)表3中所列的如下SNP標(biāo)記物：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869可以設(shè)計出不同的引物對，但都是基于本發(fā)明提供了上述SNP標(biāo)記物這個前提，因此都在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定選自表3中的如下SNP標(biāo)記物的試劑盒：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。，所述試劑盒包含選自如下的試劑：等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。優(yōu)選地，所述試劑盒包含等位基因特異性引物組。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述等位基因特異性引物組為選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQIDNO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQIDNO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQIDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQIDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQIDNO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQIDNO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQIDNO:21)；和(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQIDNO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQIDNO:24)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)具體的SNP標(biāo)記物設(shè)計其它適于本發(fā)明用于檢測本發(fā)明的SNP標(biāo)記物的等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針，只要等位基因特異性寡核苷酸、DNA探針和RNA探針能夠與所述SNP標(biāo)記物進(jìn)行等位基因特異性雜交。優(yōu)選地，所述試劑固定在基質(zhì)上。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述試劑排列在陣列上。另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定表3中的一種或者多種如下SNP標(biāo)記物的試劑在早期鑒定玉米穗軸顏色中的應(yīng)用：A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869。優(yōu)選地，用于鑒定用于鑒定表3中的一種或者多種如下SNP標(biāo)記物的試劑選自：等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。優(yōu)選地，所述等位基因特異性引物為選自如下的引物組：(1)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQIDNO:1)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQIDNO:2)，通用引物：TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQIDNO:3)；(2)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQIDNO:4)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQIDNO:5)，通用引物：TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQIDNO:6)；(3)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQIDNO:7)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQIDNO:8)，通用引物：GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQIDNO:9)；(4)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQIDNO:10)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQIDNO:11)，通用引物：CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQIDNO:12)；(5)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQIDNO:13)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQIDNO:14)，通用引物：TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQIDNO:15)；(6)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQIDNO:16)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQIDNO:17)，通用引物：GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQIDNO:18)；(7)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQIDNO:19)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQIDNO:20)，通用引物：TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQIDNO:21)；和(8)特異引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQIDNO:22)，特異引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQIDNO:23)，通用引物：TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQIDNO:24)。除非另有定義，否則在本文中使用的所有技術(shù)術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員通常理解的相同的意義?！癝NP”，即“單核苷酸多態(tài)性”是指基因組中單個核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性?！暗任换颉笔侵肝挥谝粚ν慈旧w的給定基因座位置上的一對基因。SNP等位基因就是表征所述SNP的兩個核苷酸?！暗任换蛱禺愋怨押塑账帷笔侵概c包含單核苷酸變異的等位基因靶核苷酸雜交的寡核苷酸?！暗任换蛱禺愋噪s交”是指當(dāng)?shù)任换蛱禺愋怨押塑账崤c其靶核酸雜交時，所述等位基因特異性寡核苷酸與包含單核苷酸變異的等位基因靶核苷酸特異性堿基配對。“等位基因特異性引物”是指能用于擴增包含單核苷酸變異的等位基因靶核苷酸的特異性引物。本發(fā)明所鑒定的SNP分子標(biāo)記物、用于檢測所述SNP分子標(biāo)記物的引物以及相應(yīng)的檢測分型方法具有通量高，成本低，準(zhǔn)確率高的特點，為分子標(biāo)記法輔助選擇不同玉米南方銹病抗病的玉米后代提供了新的技術(shù)手段，可以用于玉米南方銹病抗病的分子鑒定。附圖說明圖1顯示了KASP法檢測樣品中成功分型的各基因型點簇分布圖。圖2顯示了玉米染色體10上根據(jù)本發(fā)明鑒定的8個SNP標(biāo)記物與玉米南方銹病抗病主效基因RppP25的物理連鎖關(guān)系(B73參考基因組V3版本)。具體實施方式下面結(jié)合實施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克隆：實驗室手冊(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實施例1玉米南方銹病抗病主效基因RppP25(RppP25基因)位點的SNP分子標(biāo)記物的選擇RppP25基因位于玉米染色體10的3,130,061至3,133,063區(qū)段內(nèi)(參考玉米基因組B73V3版本的位置)，從中玉金標(biāo)記玉米56KSNP芯片上，在2,100,671和4,992,947區(qū)間內(nèi)選擇8個SNP位點進(jìn)行標(biāo)記物開發(fā)，見表1。表1與RppP25基因相連鎖的SNP位點信息(染色體位置為玉米參考基因組B73V3版本位置)位點名稱染色體號染色體位置(V3)等位位點1等位位點2SYN17244103,020,570TCSYN17617102,437,710AGPZE-110002424102,450,914CTPZE-110002524102,469,304AGPZE-110004402104,002,339AGSYN4482104,652,445TCSYN4502104,668,571AGSYN4481104,696,425GT根據(jù)市售獲得的LGC公司的KASPMasterMix檢測試劑盒，采用Primer3引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計，設(shè)計結(jié)果見表2，共設(shè)計了8個KASP標(biāo)記物引物組，每個標(biāo)記物引物組包含特異引物1、特異引物2和通用引物，其中特異引物1和特異引物2的5’端分別連接了Allele-1tail和Allele-2tail。Allele-1tail和Allele-2tail這兩條加尾序列分別標(biāo)記了FAM和HEX熒光基團，具體序列顯示如下：Allele-1tail：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAllele-2tail：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT表2標(biāo)記物引物組設(shè)計實施例2高通量檢測玉米南方銹病抗病主效基因RppP25位點的SNP分子標(biāo)記物采用實施例1設(shè)計的8個KASP引物組，以玉米基因組DNA作為模板，經(jīng)PCR擴增后對SNP位點進(jìn)行分析。1.提取樣品基因組DNA：按TIANGEN公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP-305)，并按照試劑盒說明書提取供試玉米樣品基因組DNA，具體步驟如下：(1)在液氮中研磨100mg新鮮或20℃冷凍的樣品材料；(2)將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)裝有700μl，65℃預(yù)熱的緩沖液GP1的離心管中，所述緩沖液GP1中含有終濃度為0.1wt％的巰基乙醇，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65℃水浴20分鐘，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；(3)加入700μl氯仿，充分混勻，12,000rpm離心5min；注：若提取富含多酌或淀粉的植物組織，可在第3步前，用酚:氯仿(1:1)進(jìn)行等體積抽提；(4)小心的將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管，加入700μl的緩沖液GP2，充分混勻；(5)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3，12,000rpm離心30s，棄掉廢液；(6)向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液GD(使用前檢查是否己加入無水乙醇)，12,000rpm離心30s，棄掉廢液；(7)向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(使用前檢查是否己加入無水乙醇)，12,000rpm離心30s，倒掉廢液；(8)重復(fù)步驟(7)；(9)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(10)將吸附柱CB3放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量50-200μl洗脫緩沖液TE(pH值在7.0-8.5之間)，室溫放置2-5min。12000rpm離心2min收集DNA溶液；以及(11)用紫外分光光度計檢測DNA的含量及純度，結(jié)果顯示所測樣品A260/280介于1.8～2.0之間，表明所提取的DNA純度較高。2.PCR擴增：以步驟1制得的基因組DNA為模板，DNA稀釋及轉(zhuǎn)板在TECAN液體自動化工作站上進(jìn)行；PCR整個過程在DouglasScenfiticArrayTape平臺上完成；在Nexar工作站上將DNA和PCRmix加入384PCR反應(yīng)ArrayTape中；在Soellex水浴中完成PCR反應(yīng)；在Araya上完成檢測熒光強度，讀取數(shù)據(jù)；在Intellics管理系統(tǒng)中完成程序設(shè)定和數(shù)據(jù)分析；引物的核苷酸序列如表2所示。PCR反應(yīng)體系為3μl，組分如下：PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15min；第一步擴增反應(yīng)，94℃預(yù)變性20秒，65℃-55℃60秒，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低1℃；第二步擴增反應(yīng)，94℃預(yù)變性20秒，55℃60秒，35個循環(huán)。在Araya熒光閱讀儀上讀取熒光信號。數(shù)據(jù)讀取使用DouglasScenfitic公司Intellics軟件進(jìn)行。結(jié)果分析使用DouglasScenfitic公司Intellics軟件進(jìn)行。3.基因分型SNP位點等位基因型分型有三種：等位基因1純合型，等位基因2純合型，等位基因1和等位基因2雜合型。如上述2所述，對PCR擴增反應(yīng)獲得的結(jié)果進(jìn)行分析。參見圖1，SNP位點等位基因1純合型(簇1)、SNP位點等位基因2純合型(簇2)、等位基因1和等位基因2雜合型(簇3)，分別組成分型明確的三個群，陰性對照(簇4)沒有明顯擴增，這樣的基因型點簇分布圖對應(yīng)基因分型成功的標(biāo)記物，8個標(biāo)記物均為基因分型成功的標(biāo)記物(參見表3)。表3分型結(jié)果標(biāo)記物名稱位點名稱分型結(jié)果A003135SYN17244成功A003857SYN17617成功A003858PZE-110002424成功A003859PZE-110002524成功A003864PZE-110004402成功A003865SYN4482成功A003866SYN4502成功A003869SYN4481成功4.基因型與表型的關(guān)聯(lián)按照表4對上述分型成功的8個標(biāo)記物的三種等位基因分型(等位基因1純合型，等位基因2純合型，等位基因1和等位基因2雜合型)分別賦予數(shù)字2，0和1。表4標(biāo)記物基因型數(shù)字化參見表5，對88份已知表型樣品的玉米南方銹病表型與基因型進(jìn)行對比，在表型分組之間對標(biāo)記物結(jié)果進(jìn)行T-TEST計算，P<0.05說明兩組間差異達(dá)到顯著水平，分別計算了高抗&抗病/高感&感病和高抗/高感表型和基因型的P值，P值<0.05的標(biāo)記物作為可用標(biāo)記物。參見表6，表4所示的8個標(biāo)記物的P值均小于0.05，因此均可以用來區(qū)分玉米高抗&抗病/高感&感病和高抗/高感(參見表表5、表6與圖2)。圖2顯示了玉米染色體10上玉米南方銹病表型與基因型成功關(guān)聯(lián)的8個標(biāo)記物與玉米南方銹病抗病主效基因RppP25的物理連鎖關(guān)系(基因組位V3)。8個標(biāo)記物分布在GRMZM2G060884兩側(cè)1.6M范圍之內(nèi)(圖2)。表6基因型和玉米南方銹病表型的關(guān)聯(lián)性表5表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)對比注：“0”、“1”和“2”是根據(jù)附表1基因型數(shù)字化后的結(jié)果，“\”是表示沒有檢測或失敗沒有分型結(jié)果，“HR”、“R”、“S”和“HS”分別表示玉米南方銹病高抗、抗、感和高感表型。序列表<110>中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司<120>高通量檢測玉米南方銹病抗性基因分型的方法及其試劑盒<130>PM2089YJ66CN<160>24<170>PatentInversion3.5<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>1gaaggtgaccaagttcatgctgaggacgaggacgacgcg39<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2gaaggtcggagtcaacggattggaggacgaggacgacgca40<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3tgcacatgtcagcctcaagacc22<210>4<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>4gaaggtgaccaagttcatgctgggcgtcaagtgcgatctct41<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaggtcggagtcaacggattggcgtcaagtgcgatctcc40<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>6tgctcctcacaggatacatgaagaat26<210>7<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>7gaaggtgaccaagttcatgctgactaatagctgcataccactcag45<210>8<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>8gaaggtcggagtcaacggatttagactaatagctgcataccactcaa47<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9gagaccctattactcgtattgttggca27<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>10gaaggtgaccaagttcatgctgatgacagcagctagcagtgaaaa45<210>11<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>11gaaggtcggagtcaacggattatgacagcagctagcagtgaaag44<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>12cagagctaagtgagacagtgagagt25<210>13<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>13gaaggtgaccaagttcatgctacagtgatatctgcagaagctatgt46<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>14gaaggtcggagtcaacggattcagtgatatctgcagaagctatgc45<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>15ttttgtggtcctcaccttctttctctt27<210>16<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>16gaaggtgaccaagttcatgctcaatggggaaagctggatcaac43<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>17gaaggtcggagtcaacggattgcaatggggaaagctggatcaat44<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>18gttttgcacggcgcattgtgaaga24<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>19gaaggtgaccaagttcatgctccgggagacaagcaacgaca41<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>20gaaggtcggagtcaacggattcgggagacaagcaacgacg40<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>21tcgctagagcctctggactacat23<210>22<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>22gaaggtgaccaagttcatgctggttgggacacaccagttagg42<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>23gaaggtcggagtcaacggattgggttgggacacaccagttagt43<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>24tgtttcgccactctggcatcctat24當(dāng)前第1頁1 2 3