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高通量檢測玉米南方銹病抗性基因分型的方法及其試劑盒與流程

文檔序號:12346684閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.用于高通量檢測玉米南方銹病抗性的玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25位點的一種或者多種SNP分子標記物,所述SNP分子標記物為選自如下的SNP標記物:A003135、A003857、A003858、A003859、A003864、A003865、A003866和A003869,以玉米參考基因組B73V3版本染色體10為準,所述A003135對應的位置為3,020,570,等位位點1為T,等位位點2為C;A003857對應的位置為2,437,710,等位位點1為A,等位位點2為G;A003858對應的位置為2,450,914,等位位點1為C,等位位點2為T;A003859對應的位置為2,469,304,等位位點1為A,等位位點2為C;A003864對應的位置為4,002,339,等位位點1為A,等位位點2為G;A003865對應的位置為4,652,445,等位位點1為T,等位位點2為C;A003866對應的位置為4,668,571,等位位點1為A,等位位點2為G;A003869對應的位置為4,696,425,等位位點1為G,等位位點2為T。

2.用于高通量檢測玉米南方銹病抗性的方法,其特征在于所述方法包括從待檢測的玉米品種獲得的核酸樣品中鑒定至少一種權利要求1限定的SNP標記物,所述方法選自:直接測序、等位基因-特異性探針雜交、等位基因-特異性引物延伸、等位基因-特異性擴增。

3.根據(jù)權利要求2的方法,其特征在于所述等位基因-特異性引物延伸中采用的等位基因特異性引物為選自如下的引物組:

(1)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2),通用引物:TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3);

(2)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5),通用引物:TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6);

(3)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ ID NO:7),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ ID NO:8),通用引物:GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9);

(4)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ ID NO:10),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11),通用引物:CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12);

(5)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ ID NO:13),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ ID NO:14),通用引物:TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15);

(6)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17),通用引物:GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18);

(7)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20),通用引物:TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21);和

(8)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23),通用引物:TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。

4.權利要求1限定的一種或者多種SNP分子標記物在鑒定玉米南方銹病抗性中的應用。

5.用于篩選玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25位點與玉米南方銹病抗性相關的SNP分子標記物的方法,其特征在于所述方法包括如下步驟:(1)選擇玉米南方銹病抗病主效基因Rpp25區(qū)段附近的SNP;(2)根據(jù)所選擇的SNP,基于LGC公司的KASP Master Mix試劑盒設計對應于每個SNP的KASP引物組;(3)以玉米基因組DNA作為模板,利用步驟(2)設計的KASP引物組進行PCR擴增;(4)對經(jīng)PCR擴增后的SNP位點進行基因分型,尋找基因分型成功的SNP標記物;以及(5)將基因分型成功的SNP標記物與有統(tǒng)計學意義數(shù)量的已知玉米南方銹病抗性表型的樣品進行對比,進行T-TEST計算,選擇差異達到顯著水平P<0.05的SNP分子標記物作為與玉米南方銹病抗性相關的SNP分子標記物。

6.根據(jù)權利要求5的方法,其特征在于所述SNP為權利要求1限定的SNP。

7.用于鑒定權利要求1限定的SNP標記物的引物組。

8.根據(jù)權利要求7的引物組,其特征在于所述引物組選自:

(1)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2),通用引物:TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3);

(2)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5),通用引物:TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6);

(3)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ ID NO:7),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ ID NO:8),通用引物:GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9);

(4)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ ID NO:10),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11),通用引物:CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12);

(5)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ ID NO:13),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ ID NO:14),通用引物:TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15);

(6)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17),通用引物:GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18);

(7)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20),通用引物:TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21);和

(8)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23),通用引物:TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。

9.用于鑒定權利要求1限定的SNP標記物的試劑盒,所述試劑盒包含選自如下的試劑之一:等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。

10.根據(jù)權利要求9的試劑盒,所述等位基因特異性引物為選自如下的引物組:

(1)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2),通用引物:TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3);

(2)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5),通用引物:TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6);

(3)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ ID NO:7),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ ID NO:8),通用引物:GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9);

(4)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ ID NO:10),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11),通用引物:CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12);

(5)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ ID NO:13),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ ID NO:14),通用引物:TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15);

(6)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17),通用引物:GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18);

(7)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20),通用引物:TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21);和

(8)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23),通用引物:TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。

11.根據(jù)權利要求9的試劑盒,其特征在于所述試劑盒中的試劑固定在基質上或排列在陣列上。

12.用于鑒定權利要求1限定的一種或者多種SNP分子標記物的試劑在檢測玉米南方銹病抗性中的應用,所述用于鑒定權利要求1限定的一種或者多種SNP分子標記物的試劑選自:等位基因特異性寡核苷酸、等位基因特異性引物、DNA探針和RNA探針。

13.根據(jù)權利要求12的應用,其特征在于所述等位基因特異性引物為選自如下的引物組:

(1)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GAGGACGAGGACGACGCG(SEQ ID NO:1),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGAGGACGAGGACGACGCA(SEQ ID NO:2),通用引物:TGCACATGTCAGCCTCAAGACC(SEQ ID NO:3);

(2)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGGCGTCAAGTGCGATCTCT(SEQ ID NO:4),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGCGTCAAGTGCGATCTCC(SEQ ID NO:5),通用引物:TGCTCCTCACAGGATACATGAAGAAT(SEQ ID NO:6);

(3)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GACTAATAGCTGCATACCACTCAG(SEQ ID NO:7),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-TAGACTAATAGCTGCATACCACTCAA(SEQ ID NO:8),通用引物:GAGACCCTATTACTCGTATTGTTGGCA(SEQ ID NO:9);

(4)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAA(SEQ ID NO:10),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-ATGACAGCAGCTAGCAGTGAAAG(SEQ ID NO:11),通用引物:CAGAGCTAAGTGAGACAGTGAGAGT(SEQ ID NO:12);

(5)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-ACAGTGATATCTGCAGAAGCTATGT(SEQ ID NO:13),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTGATATCTGCAGAAGCTATGC(SEQ ID NO:14),通用引物:TTTTGTGGTCCTCACCTTCTTTCTCTT(SEQ ID NO:15);

(6)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAATGGGGAAAGCTGGATCAAC(SEQ ID NO:16),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAATGGGGAAAGCTGGATCAAT(SEQ ID NO:17),通用引物:GTTTTGCACGGCGCATTGTGAAGA(SEQ ID NO:18);

(7)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CCGGGAGACAAGCAACGACA(SEQ ID NO:19),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGGAGACAAGCAACGACG(SEQ ID NO:20),通用引物:TCGCTAGAGCCTCTGGACTACAT(SEQ ID NO:21);和

(8)特異引物1:FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GGTTGGGACACACCAGTTAGG(SEQ ID NO:22),特異引物2:HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GGGTTGGGACACACCAGTTAGT(SEQ ID NO:23),通用引物:TGTTTCGCCACTCTGGCATCCTAT(SEQ ID NO:24)。

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