本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種檢測22q11.2微缺失的特異性引物、探針、檢測試劑盒及方法。

背景技術(shù)：
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染色體22q11.2微缺失綜合征(syndrome，22q11.2DS)，是指由人類染色體22q11.21-22q11.23區(qū)域雜合性缺失引起的一類臨床癥候群，在新生兒中的發(fā)病率約為1：4000，是最為常見的染色體微缺失綜合癥。染色體22q11.2微缺失綜合征普遍性是次于它的染色體缺失綜合征的10倍。超過90％的22q11.2微缺失患兒屬于新發(fā)突變，剩余的10％的患兒則是受到父母遺傳的影響。

22q11.2DS主要包括DiGeorge綜合征(DiGeorge syndrome，DGS)，腭心面綜合征(Velocardiofacial syndrome，VCFS)等臨床綜合征。22q11.2DS臨床表現(xiàn)形式多樣，包括心臟畸形、胸腺和甲狀腺發(fā)育不良、顱面先天性畸形、復發(fā)性感染、發(fā)育遲緩、新生兒低血鈣癥以及學習障礙等。由于外顯率和表達量差異，22q11.2DS臨床表現(xiàn)多樣，缺失相同片段的個體差異顯著，其癥狀從輕度，重度，甚至致死都有，容易造成臨床診斷困難，遲診或漏診。

染色體22q11.2微缺失綜合征的發(fā)病分子機制和染色體22q11.2區(qū)域4個低拷貝數(shù)的重復序列(low copy number repeats，LCR)的存在密切相關(guān)。22q11.2上的LCR序列是基因組上和人染色體缺失綜合征相關(guān)的最大最復雜同源性最高的LCR序列。這4個LCR序列同源性高，在細胞的減數(shù)分裂過程中容易發(fā)生不平等的交叉互換(非等位基因同源重組)，從而導致22q11.2微缺失的形成。

大多數(shù)(近85％)22q11.2微缺失患者在22號染色體的長臂11.2的位置缺失一個約3Mb的大片段，這個3Mb的區(qū)域包括45個功能基因。余下的22q11.2微缺失患者大多數(shù)只缺失鑲嵌于這3Mb內(nèi)的1.5Mb的片段。

TBX1基因位于22號染色體(22q11.2常見缺失的1.5Mb片段上)，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族T-box大家族，T-box家族各成員共享一個特異保守的DNA結(jié)構(gòu)區(qū)域。T-box基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子是胚胎發(fā)育所必需的。在胚胎發(fā)育階段，T-box基因及其轉(zhuǎn)錄因子在心臟腔室的形成，瓣膜的發(fā)育以及心臟傳導系統(tǒng)的主體部分。在人類的T-box家族中，至少有7個亞型成員在心臟中表達，其中TBX1研究最多較為成熟的亞型之一。TBX1基因缺失可導致胚胎階段心臟流道和主動脈弓異常。

22q11.2微缺失，由于缺失片段太小，只有3Mb或者1.5Mb，采用細胞學的方法很難鑒定。隨著生物分子技術(shù)的發(fā)展，目前，在常見的缺失區(qū)域針對N25或TUPLE1設(shè)計探針，采用FISH技術(shù)檢測22q11.2微缺失已經(jīng)應用到臨床實驗室。另外，熒光定量技術(shù)(realtime fluores-cence quantitative PCR，qPCR)，通過擴增目的基因片段以及內(nèi)參基因片段，計算所測得的兩者Ct值(達到自主設(shè)定的熒光閾值的PCR循環(huán)數(shù))之差，從而確定目的基因的拷貝數(shù)，也可以檢測22q11.2微缺失。芯片技術(shù)--比較基因組雜交技術(shù)(array comparative genomic hybridization，aCGH)等都可以檢測22q11.2微缺失綜合征。

現(xiàn)有技術(shù)檢測22q11.2DS的技術(shù)FISH檢測22q11.2微缺失耗時長，熒光定量檢測雜合缺失樣本，正常樣本和雜合缺失樣本只存在一個拷貝數(shù)的差別，也即1個循環(huán)Ct的差別，受擴增效率影響并且對實驗技術(shù)操作過高，aCGH技術(shù)價格昂貴，單個樣本價格在2千元左右。因此現(xiàn)有方法都無法滿足大規(guī)?；蚝Y查的要求。

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的，一種絕對的全新的核酸定量技術(shù)?？梢詫⒎磻w系分成近2萬個微滴反應單元，使得模版DNA極端被稀釋，每個微滴反應單元不包含或者包含一個到多個目標核酸序列，目標核酸序列的數(shù)量符合泊松分布。根據(jù)每個微滴反應單元的信號的有無，PCR結(jié)果判定為陽性或陰性。陽性可以理解為1，陰性可以理解為0，因此稱為數(shù)字PCR。微滴數(shù)字PCR可用于拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測22q11.2微缺失的特異性引物、探針、檢測試劑盒及方法。利用特異性引物和探針，通過微滴式數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合Taqman技術(shù)，將22q11.2DS患者從先天性心臟病患兒中篩選出來，對臨床治療和預后進行指導，也可用于產(chǎn)前篩查達到優(yōu)生優(yōu)育的目的。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一個位于典型22q11.2微缺失的1.5Mb區(qū)域的與心臟發(fā)育相關(guān)的基因TBX1，以及一個內(nèi)參基因RPP30組合。

通過查找美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術(shù)中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(NCBI)網(wǎng)站上TBX1和RPP30基因的序列，結(jié)合文獻確定22q11.2微缺失特異缺失的1.5Mb序列，設(shè)計用于針對目標基因TBX1和內(nèi)參基因RPP30的特異性引物和探針。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種檢測22q11.2微缺失的特異性引物，其特征在于，所述的特異性引物的序列如下：

TBX1-F：5’-TCGCGGACCTGTTTTTCGTA-3’(如SEQ ID NO.1所示)，TBX1-R：5’-TCTCTGGTGCTAGATGCCCT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；RPP30-F：5’-GATTTGGACCTGCGAGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)，RPP30-R：5’-GGTTGGCCAGGCGCGAAG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

用上述特異性引物對樣本DNA進行多重PCR擴增，能夠同時擴增出上述2個基因的片段。設(shè)計這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的，優(yōu)選的，特異性引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測22q11.2微缺失的探針，其特征在于，所述的探針的序列如下：

TBX1：5’-ATGTTTGCTCTGGCGGCGTG-3’(如SEQ ID NO.5所示)；RPP30：5’-CTGACCTGAAGGCTCT-3’(如SEQ ID NO.6所示)；探針的5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團，兩個探針的5’端標記的熒光基團是不同的熒光基團。

優(yōu)選，探針TBX1的5’端標記的熒光基團為FAM，3’端標記的淬滅基團為BHQ1，探針RPP30的5’端標記的熒光基團為HEX，3’端標記的淬滅基團為MGB。

上述探針能夠?qū)BX1基因的拷貝數(shù)進行測定。所設(shè)計的特異性探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解。

上述的特異性引物或探針，用于微滴數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合Taqman技術(shù)檢測22q11.2微缺失。本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有上述的特異性引物和/或探針的檢測試劑盒。

優(yōu)選，包括2×ddPCR Supermix for Probes、微滴生成油、上述的特異性引物和/或探針、陰性對照和陽性對照。

優(yōu)選，所述的陰性對照為正常樣本DNA，所述的陽性對照為22q11.2微缺失陽性樣本DNA。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測22q11.2微缺失的檢測方法，其特征在于，提取待測樣本的基因組DNA為模板，利用上述的特異性引物和上述的探針進行微滴數(shù)字PCR擴增，檢測微滴的熒光信號，得到目標基因TBX1和內(nèi)參基因RPP30的拷貝數(shù)，計算TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值，如果比值為0.40-0.62之間，則判斷樣本為22q11.2微缺失陽性樣本。

優(yōu)選，所述的微滴數(shù)字PCR擴增，其ddPCR反應體系為20μL，包括1×ddPCR Supermix for Probes，待測樣本基因組DNA 20ng，權(quán)利要求1所述的特異性引物TBX1-F、TBX1-R、RPP30-F和RPP30-R的終濃度均為250nmol/L，權(quán)利要求2所述的探針TBX1和RPP30的終濃度均為400nmol/L，余量為ddH₂O。

優(yōu)選，所述的微滴數(shù)字PCR擴增，其PCR反應條件為：95℃，10分鐘；95℃，30秒，58℃，20秒，65℃，40秒，共40個循環(huán)；98℃，10分鐘。

本發(fā)明的第五個目的是提供上述的特異性引物和/或上述的探針在檢測22q11.2微缺失中的應用。

本發(fā)明的有益效果是：(1)陽性檢測準確率高達100％，重復性好，沒有假陽性；(2)通量高，一次可以對96個樣本進行檢測；(3)靈敏度高，低至0.3125ng的DNA起始量，仍能做到精確檢出；(4)檢測所需時間短，從樣本DNA提取到檢測結(jié)果出來最快只需要4個小時；(5)價格優(yōu)惠。

附圖說明：

圖1是微滴熒光信號分布圖；其中A區(qū)域的黑點是通道FAM的陽性油滴，顯示的是FAM標記的目標基因TBX1陽性油滴；D區(qū)域的黑點是通道HEX的陽性油滴，顯示的是HEX標記的內(nèi)參基因RPP30陽性油滴；B區(qū)域的黑點是既包含目標基因TBX1又包含內(nèi)參基因RPP30的雙重陽性油滴，C區(qū)域的黑點為陰性油滴，表示不包含目標基因TBX1或內(nèi)參基因RPP30的油滴；TBX1陽性油滴、RPP30陽性油滴、TBX1和RPP30的雙重陽性油滴以及陰性油滴分別聚集在A、D、B、C 4個不同區(qū)域；

圖2是微滴數(shù)字PCR檢測先天性心臟病患兒樣本的TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值；其中，1-14為先天性心臟病患兒樣本，P為22q11.2微缺失陽性樣本，N是正常樣本；

圖3是微滴數(shù)字PCR檢測不同濃度正常樣本DNA模板的TBX與RPP30的拷貝數(shù)；其中，橫坐標表示不同濃度的正常樣本DNA模板，縱坐標表示可檢測到的拷貝數(shù)，TBX表示TBX的拷貝數(shù)，RPP30表示RPP30的拷貝數(shù)。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

一、基因組DNA提?。?/p>

1 試劑和儀器

1.1 試劑和耗材：血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit,DP304-02；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，天根公司)含：緩沖液GA；裂解液GB；緩沖液GD；漂洗液PW；洗脫緩沖液TE；蛋白酶K(20mg/mL)；吸附??；收集管(2mL)；1.5mL無菌收集管，無水乙醇。

1.2 儀器：Eppendorf 5430R離心機，恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科技儀器)，振蕩儀(大龍興創(chuàng)公司)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)。

2 待測人基因組DNA模板的準備

2.1 EDTA抗凝管采集人外周血全血500μL，使用天根公司的血液基因組DNA提取試劑盒(主要成分為：緩沖液GA；裂解液GB；緩沖液GD；漂洗液PW；洗脫緩沖液TE；蛋白酶K；吸附柱CB3；收集管；1.5mL無菌收集管)提取全血基因組DNA為待測人基因組DNA模板，具體步驟如下：

2.1.1 將200μL外周血轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，加入20μL蛋白酶K溶液，混勻；

2.1.2 加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃恒溫加熱10分鐘，裂解細胞；

2.1.3 加200μL無水乙醇，充分混勻15秒，簡短離心，去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

2.1.4 將所得混合溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱CB3中，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱CB3放回收集管；

2.1.5 向吸附柱CB3內(nèi)加500μL已經(jīng)加入適量無水乙醇的緩沖液GD，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱CB3放回收集管；

2.1.6 向吸附柱CB3內(nèi)加600μL已經(jīng)加入適量無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱CB3放回收集管；

2.1.7 重復2.1.6；

2.1.8 繼續(xù)12000rpm離心2分鐘，倒掉離下的廢液，將吸附柱CB3放回收集管，徹底晾干吸附材料中的漂洗液；

2.1.9 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管，向吸附膜中間懸空滴加50μL的洗脫緩沖液TE，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將DNA溶液收集到離心管中。

2.2 取2μL的DNA溶液，采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)對提取的DNA濃度質(zhì)量進行測定，將提取的基因組DNA模板稀釋到20ng/μL。

二、微滴數(shù)字PCR：

微滴數(shù)字PCR反應包括PCR體系配制，微滴生成，微滴PCR擴增和信號讀取4個步驟。

1 儀器和耗材：微滴生成儀(美國伯樂公司，Bio-Rad)，PCR儀T-100(Bio-Rad)，油滴讀數(shù)儀(QX200Droplet Reader,Bio-Rad)，PX1熱封儀(PCR Plate Sealer，Bio-Rad)，微滴生成耗材[DG8 cartridge、holder、膠墊gasket、錫質(zhì)封板膜(Pierceable Foil Heat Seal,Cat.#1814040)，Bio-Rad]，96孔板(Bio-Rad)，plate holder(Bio-Rad)。

2 序列查找和引物探針設(shè)計：

在NCBI網(wǎng)站查找目標基因TBX1和內(nèi)參基因RPP30基因序列，結(jié)合文獻確定22q11.2微缺失特異缺失的1.5Mb序列，設(shè)計合成特異性引物和探針。

目標基因TBX1的特異性引物和探針的具體序列為：TBX1-F：5’-TCGCGGACCTGTTTTTCGTA-3’，TBX1-R：5’-TCTCTGGTGCTAGATGCCCT-3’；TBX1：5’-FAM-ATGTTTGCTCTGGCGGCGTG-BHQ1-3’。

內(nèi)參基因RPP30的特異性引物和探針的具體序列為：RPP30-F：5’-GATTTGGACCTGCGAGC-3’，RPP30-R：5’-GGTTGGCCAGGCGCGAAG-3’；RPP30：5’-HEX-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-3’。

3 微滴數(shù)字PCR反應微滴的生成

3.1 PCR反應體系配制：PCR反應體系總體積20μL，其中加入2×ddPCR Supermix for Probes(Cat.#186-3024，Bio-Rad)10μL，基因組DNA模板1μL(總量20ng)，引物TBX1-F、TBX1-R、RPP30-F和RPP30-R及探針TBX1和RPP30加入同一PCR管，使各引物的終濃度均為250nmol/L，各探針的終濃度均為400nmol/L，補ddH₂O至20μL。

3.2 將一個新的DG8 cartridge放入holder中，注意缺口放置方向；

3.3 將20μLPCR反應體系加入到DG8 cartridge中間一排的8個孔內(nèi)，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭位置再打出余下液體，以免引入氣泡；

3.4 在DG8 cartridge最底下一排8個孔中各加入70μL微滴生成油(DG Oil)；

3.5 蓋上膠墊(gasket)，注意兩邊的小孔都要鉤牢；

3.6 將以上holder輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態(tài)，一般2分鐘之內(nèi)完成；

3.7 微滴生成于cartridge最上面一排孔內(nèi)，用槍頭小心緩慢吸取，微滴吸取體積為40μL，吸取微滴時將holder放平，槍頭以與孔壁呈30～45°角放入，輕觸孔底，約5秒吸取40μL，再同樣緩慢地打入96孔板相應位置孔內(nèi)(約5秒)，槍頭貼近孔壁接近孔底，注意封上蓋以防油揮發(fā)，每次棄去已使用過的cartridge和膠墊；

3.8 用預熱好的PX1熱封儀對96孔板進行封膜，推薦的運行程序為：180℃，10秒；采用錫質(zhì)封板膜封好膜，在30分鐘內(nèi)進行PCR反應，或者放于4℃冰箱4小時之內(nèi)進行PCR。

4 微滴PCR擴增：取封膜的96孔板上PCR儀(美國Bio-Rad公司的T-100)擴增。PCR反應條件為：95℃10分鐘；95℃30秒，58℃20秒，65℃40秒，40個循環(huán)；最后98℃10分鐘。

5 信號讀?。?/p>

5.1 將完成PCR擴增的96孔板放入plate holder中組裝好，注意板斜角方位，組裝好之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中；

5.2 打開QuantaSoft軟件，建議每次實驗之前做一次系統(tǒng)清洗，若一周以上未使用建議先做一次填充再做系統(tǒng)清洗。之后對96孔板中樣品信息進行設(shè)置，主要是實驗名稱、實驗類型以及探針信息等，完成后即可運行儀器，讀取微滴信號，進行結(jié)果分析。結(jié)束后結(jié)果會被自動分析，人工核實后保存結(jié)果。

微滴信號的讀取原理是，微滴發(fā)生器將含有熒光探針、核酸模板等的反應體系和油滴顆粒充分混合，分成上萬個納升級的油包水微滴，每個微滴不含待測目標基因或者至少含有一個待測目標基因，每個微滴作為一個獨立的PCR反應器，經(jīng)過PCR擴增后，采用微滴分析儀逐個對每個微滴分別進行FAM和HEX兩個熒光信號檢測。有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0。通過FAM和HEX通道的陽性或者陰性油滴數(shù)，根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算出FAM標記的目標基因TBX1和HEX標記的內(nèi)參基因RPP30的拷貝數(shù)。

三、結(jié)果分析：

分析軟件QuantaSoft軟件展示的微滴PCR檢測中的微滴熒光信號分布圖(如圖1所示)，表示了所有微滴的熒光信號讀取結(jié)果。A區(qū)域的黑點是通道FAM的陽性油滴，顯示的是FAM標記的目標基因TBX1陽性油滴；D區(qū)域的黑點是通道HEX的陽性油滴，顯示的是HEX標記的內(nèi)參基因RPP30陽性油滴；B區(qū)域的黑點是既包含目標基因TBX1又包含內(nèi)參基因RPP30的雙重陽性油滴；C區(qū)域的黑點為陰性油滴，表示不包含目標基因TBX1或內(nèi)參基因RPP30的油滴。TBX1陽性油滴、RPP30陽性油滴、TBX1和RPP30的雙重陽性油滴以及陰性油滴分別聚集在A、D、B、C 4個不同區(qū)域。

根據(jù)油滴讀數(shù)儀(QX200Droplet Reader)讀取的熒光信號，計算目標基因TBX1和內(nèi)參基因RPP30的拷貝數(shù)，從而獲得TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值(即目標基因TBX1的拷貝數(shù)與內(nèi)參基因RPP30的拷貝數(shù)的比值)。

根據(jù)大量樣本測試，我們設(shè)置了一個閾值，如果TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值為0.80-1.12，則表示目標基因TBX1和內(nèi)參基因RPP30的拷貝數(shù)相同都是正常的2個拷貝。如果TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值為0.40-0.62，則表示目標基因TBX1比內(nèi)參基因RPP30的拷貝數(shù)少一個拷貝，只有1個拷貝，為22q11.2微缺失陽性樣本。

對14個先天性心臟病患兒樣本進行微滴數(shù)字PCR檢測是否存在22q11.2微缺失，同時以1個22q11.2微缺失陽性樣本作為陽性對照，以1個正常樣本(無22q11.2微缺失樣本)作為陰性對照，得到TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值如圖2所示。由圖2可見，樣本5和樣本13的TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值分別為0.469和0.57，說明存在一個TBX1的拷貝數(shù)缺失，樣本5和樣本13為22q11.2微缺失陽性樣本。結(jié)果與常規(guī)測序結(jié)果相同。

四、靈敏性檢測：

1.取正常人外周血基因組DNA，經(jīng)分光光度計測試濃度后，將濃度調(diào)整為20ng/μL；

2.將20ng/μL的基因組DNA進行梯度倍比稀釋，得到濃度為20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL、0.625ng/μL、0.3125ng/μL、0.15625ng/μL的八組樣品；

3.每組樣品取1μL依步驟二微滴數(shù)字PCR的方法進行22q11.2的微滴數(shù)字PCR檢測，每組樣品設(shè)置三個重復；

4.計算每組樣品的目標基因拷貝數(shù)，并進行TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值計算(結(jié)果見圖3)。

如圖3可見，隨著起始DNA模板量的稀釋，微滴數(shù)字PCR檢測得到的TBX與RPP30拷貝數(shù)梯度減少，而TBX1/RPP30拷貝數(shù)的比值均為1左右，與理論值相符合。低至0.3125ng的DNA起始量，我們?nèi)阅茏龅骄_檢出。

對于待測DNA的選擇，本發(fā)明并沒有特別的限制，既可以是從人體的血液也可以是組織獲取基因組DNA，為了方便實施，通常優(yōu)選從血液中提取的基因組DNA。對于本發(fā)明中的PCR擴增反應的條件，并不受到特別的限制，只要能夠獲得擴增產(chǎn)物，利于探針結(jié)合即可。

由于本發(fā)明使用的檢測方法可以高通量，自動化檢測22q11.2微缺失，降低了檢測成本，并且結(jié)果準確，可以實現(xiàn)快速檢測，適用于大規(guī)模的新生兒篩查。22q11.2微缺失篩查的意義在于如果確診為22q11.2DS則對臨床的治療、手術(shù)以及預后都具有指導作用。對于有生育過新發(fā)22q11.2微缺失突變的正常夫婦，還可以對其的第二胎的生育提供產(chǎn)前篩查。22q11.2缺失綜合征作為一種高發(fā)的染色體疾病，超過90％的22q11.2微缺失患兒屬于新發(fā)突變，因此對新生兒進行該疾病的普篩也具有重要意義。