本發(fā)明涉及魚類雜種的鑒定方法，具體涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖黃顙魚雜種的CH4分子標(biāo)記鑒定方法。
背景技術(shù)：
黃顙魚屬魚類屬于雜食性底層魚類，以肉食為主，是魚類進(jìn)化中最發(fā)達(dá)的真骨魚類之一。黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)和瓦氏黃顙魚(Pelteobaggrus vachelli)均屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚屬，兩者味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，是重要的養(yǎng)殖魚類。黃顙魚分布于我國長江、黃河、珠江及黑龍江、遼寧等流域，喜棲息于開敞水體，營底棲生活，灣沱、河底礫石河段都適合它們棲息，1～2齡魚生長較快，以后生長緩慢，其個(gè)體小、但對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)。瓦氏黃顙魚分布于長江、珠江、錢塘江、淮河、黃河及其支流，長期與大型河流相通的大型湖泊中也有分布，為底棲性魚類，棲息于江河緩流或湖泊靜水環(huán)境中，1～3齡魚生長快，之后相對緩慢，其個(gè)體在黃顙魚屬中最大，且肉質(zhì)細(xì)嫩、刺少，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
為了滿足社會生產(chǎn)的需要，獲得兼有以上兩種魚優(yōu)良性狀的苗種，王衛(wèi)民等(黃顙魚♀與瓦氏黃顙魚♂的雜交研究[J].淡水漁業(yè)，2002.32(3):3-5)開展了黃顙魚和瓦氏黃顙魚的雜交育種試驗(yàn)，對雜交和自交的卵受精率、孵化率和出苗率進(jìn)行了對比分析。之后趙文學(xué)等(黃顙魚屬物種的RAPD分子鑒定及雜種遺傳分析[J].2006.30(1):101-105)進(jìn)行了黃顙魚屬及其雜交種的種質(zhì)鑒定，然而，該鑒定工作所采用的RAPD標(biāo)記，受方法本身的限制，檢測效率低且重復(fù)性不高，嚴(yán)重影響了這一方法的推廣使用。鑒于此，有必要豐富黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代的分子標(biāo)記及鑒定技術(shù)，為黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜種的養(yǎng)殖和育種實(shí)踐提供參考。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了鑒定黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種(本發(fā)明涉及的雜交種均為♀黃顙魚X瓦氏黃顙魚♂所產(chǎn)生的雜交種)，提供了一種雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種和純種進(jìn)行區(qū)分。
本發(fā)明以黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代為研究對象，在黃顙魚屬魚類中篩選了CH4基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用CH4基因片段的RFLP分析，成功鑒定了黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，利用PCR擴(kuò)增后的CH4基因片段在黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間具有種間序列差異，以限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鑒別黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。
CH4基因片段是免疫球蛋白重鏈編碼基因外顯子的一部分，在近緣種間高度保守。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CH4基因片段在黃顙魚與瓦氏黃顙魚之間存在種間序列差異，將CH4基因片段的RFLP分析用于黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代的鑒定，具有實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡便，鑒定直觀，無需測序的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明所述雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：
A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；
B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、對擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，在同一個(gè)泳道上只有一條帶，即未被酶切的，為瓦氏黃顙魚；在同一泳道上有兩條帶，即被完全酶切的，為黃顙魚；在同一泳道上有三條帶，即來自黃顙魚的基因片段被酶切，而來自于瓦氏黃顙魚的基因片段未被酶切的，為雜交種。
優(yōu)選地，在一個(gè)泳道上同時(shí)出現(xiàn)長度為300bp、140bp和160bp的三條DNA標(biāo)記條帶的，為瓦氏黃顙魚和黃顙魚的雜交種。
所述B步驟中的專用引物為CH4基因片段專用引物，引物對為：
正向引物(SEQID NO:3)5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物(SEQID NO:4)5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
采用所述專用引物擴(kuò)增得到黃顙魚的CH4基因片段的核苷酸序列為SEQIDNO:1。
采用所述專用引物擴(kuò)增得到瓦氏黃顙魚的CH4基因片段的核苷酸序列為SEQID NO:2。
所述的C步驟中，使用PCR儀進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，限制性酶切CH4基因片斷的步驟為：8μL CH4-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1-1.5μL酶切反應(yīng)緩沖液，0.5-1μL限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT。
本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明的鑒定方法是依據(jù)目的基因序列，找出黃顙魚與瓦氏黃顙魚中CH4基因的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)A↓AGCTT，據(jù)此篩選出只能限制性酶切黃顙魚CH4基因片段的限制性內(nèi)切酶為HindⅢ，通過酶切產(chǎn)生長度不等的酶切片段，有效研究黃顙魚的種群種質(zhì)、鑒定雜種。
2、本發(fā)明采用DNA序列作為分子標(biāo)記，因此可以準(zhǔn)確快速地將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種黃顙魚和純種黃顙魚進(jìn)行區(qū)分，并確定出雜交黃顙魚(♀黃顙魚X瓦氏黃顙魚♂)。采用CH4基因片段的RFLP分析鑒定黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代，與RAPD分子鑒定進(jìn)行比較，由于RAPD使用的是隨機(jī)引物，在對近緣種進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的序列極有可能相同，所以需要使用多個(gè)隨機(jī)引物，且還需要使用帶譜組合法對其進(jìn)行分析才能確保結(jié)果的可靠性。而本發(fā)明是使用特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增得到的CH4片段進(jìn)行測序，并使用了MEGA5對序列結(jié)果進(jìn)行了比對分析，種內(nèi)的相似度接近100％；酶切后觀察電泳條帶的數(shù)量得出種內(nèi)結(jié)果完全一致的結(jié)論，種間差異明顯，其結(jié)果更加可靠，重復(fù)性強(qiáng)，且實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡便，無需測序。
附圖說明
圖1為HindIII酶切分析黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代(♀黃顙魚X瓦氏黃顙魚♂)的CH4基因條帶。
圖中標(biāo)記為：圖1左側(cè)數(shù)字均表示DNA片段的分子量，H0表示未進(jìn)行酶切的黃顙魚基因片段，H1～H7表示進(jìn)行了酶切反應(yīng)的黃顙魚基因片段；Z0表示未進(jìn)行酶切的雜交種的基因片段，Z1～Z7表示進(jìn)行了酶切反應(yīng)的雜交種的基因片段；W0表示未進(jìn)行酶切的瓦氏黃顙魚的基因片段，W1～W7表示進(jìn)行了酶切反應(yīng)的瓦氏黃顙魚的基因片段。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，利用PCR擴(kuò)增后的CH4基因片段在黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間具有種間序列差異，以限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鑒別黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。
實(shí)施例2
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：
A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；
B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、對擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，在同一個(gè)泳道上只有一條帶，為瓦氏黃顙魚；在同一泳道上有兩條帶，為黃顙魚；在同一泳道上有三條帶，為雜交種。
實(shí)施例3
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：
A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；
B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、對擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，在同一個(gè)泳道上只有一條帶，為瓦氏黃顙魚。
所述B步驟中的專用引物為CH4基因片段專用引物，引物對為：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
實(shí)施例4
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：
A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；
B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、對擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，在同一泳道上有兩條帶，為黃顙魚。
所述B步驟中的專用引物為CH4基因片段專用引物，引物對為：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
所述的C步驟中，使用PCR儀進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，限制性酶切CH4基因片斷的步驟為：8μL CH4-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1μL酶切反應(yīng)緩沖液，0.5μL限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT。
實(shí)施例5
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：
A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；
B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、對擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，在同一泳道上有三條帶，為瓦氏黃顙魚和黃顙魚的雜交種。
所述B步驟中的專用引物為CH4基因片段專用引物，引物對為：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
所述的C步驟中，使用PCR儀進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，限制性酶切CH4基因片斷的步驟為：8μL CH4-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1.5μL酶切反應(yīng)緩沖液，1μL限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT。
實(shí)施例6
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，具體包括以下步驟：
A、取待測魚的組織樣本，提取基因組DNA；
B、以提取到的基因組DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C、對擴(kuò)增出的目的基因片段采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT；
D、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測，在一個(gè)泳道上同時(shí)出現(xiàn)長度為300bp、140bp和160bp的三條DNA標(biāo)記條帶，為瓦氏黃顙魚和黃顙魚的雜交種。
所述B步驟中的專用引物為CH4基因片段專用引物，引物對為：
正向引物5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’；
反向引物5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’。
所述的C步驟中，使用PCR儀進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，限制性酶切CH4基因片斷的步驟為：8μL CH4-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1.2μL酶切反應(yīng)緩沖液，0.6μL限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ，37℃酶切2.5h，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT。
實(shí)施例7
水產(chǎn)養(yǎng)殖雜交黃顙魚的CH4分子標(biāo)記RFLP鑒定方法，以黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交F1代作為研究對象，包括以下步驟：
第一步，分別取黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代樣本，提取DNA。
基因組DNA提取：
用海洋組織DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取黃顙魚、瓦氏黃顙魚、雜交樣本的基因組DNA。
瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA：
制備1％的瓊脂糖凝膠，并將3μL DNA溶液加入點(diǎn)樣緩沖液并混勻上樣電泳。110V電壓電泳15min。電泳后根據(jù)紫外透射檢測儀上電泳帶的亮度來確定模板DNA的濃度，并相應(yīng)稀釋模板，使DNA模板的濃度最終約為50～100ng/μL。
第二步，分別以黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代樣本的總DNA為模板，在專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(1)PCR擴(kuò)增
PCR用來擴(kuò)增黃顙魚和瓦氏黃顙魚的免疫球蛋白M的重鏈保守區(qū)DNA外顯子序列CH4。CH4引物采用CH4-F(5’-TCCCCAAGGTTTACTTGCTCGCTCC-3’)和CH4-R(5’-CGATGGATCTGGATATGTGGCGCAC-3’)，均由TSINGKE公司合成。
CH4-F和CH4-R為擴(kuò)增CH4目的片段的引物對，其中的F代表上游引物(或正向引物)，R代表下游引物(或反向引物)。
反應(yīng)體系為26μL，將各組分按以下順序依次在0.15mL的PCR管中混合：
擴(kuò)增步驟為：
(2)PCR產(chǎn)物檢測與測序
用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，選擇結(jié)果較好的產(chǎn)物送到生物公司進(jìn)行測序。
測序驗(yàn)證其序列信息，發(fā)現(xiàn)CH4基因片斷存在種間序列差異，進(jìn)行后期RFLP鑒定雜種的實(shí)驗(yàn)。
第三步，特異酶切片斷標(biāo)記的產(chǎn)生。
(1)數(shù)據(jù)分析及限制性酶切設(shè)計(jì)
采用DNAMAN Vers ion 6對黃顙魚與瓦氏黃顙魚的CH4測序結(jié)果分別進(jìn)行比對，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0查找序列中的可用酶切位點(diǎn)并篩選其中高度穩(wěn)定的位點(diǎn)。CH4基因片段選取限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ(Takara公司)，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT，限制性酶切黃顙魚CH4基因。
雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法，利用PCR擴(kuò)增后的CH4基因片段在黃顙魚和瓦氏黃顙魚之間具有種間序列差異，通過Primer5軟件篩選出合適的內(nèi)切酶，對黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代的CH4基因片段進(jìn)行鑒別。篩選過程中，先分別篩選出黃顙魚和瓦氏黃顙魚各自的限制性內(nèi)切酶，然后排除兩者中相同的內(nèi)切酶，得到只能特異性內(nèi)切黃顙魚CH4基因片段的內(nèi)切酶和只能特異性內(nèi)切瓦氏黃顙魚CH4基因片段的內(nèi)切酶，之后對這些酶的酶切位點(diǎn)進(jìn)行比較分析。由于該片段短，僅有303bp，若該酶的酶切位點(diǎn)不只一個(gè)，酶切后片段會小于100bp，在進(jìn)行電泳鑒定時(shí)其條帶易與引物二聚體混淆，得到的鑒定效果不好，所以應(yīng)盡量選擇只有一個(gè)酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶，且其酶切后的基因片段大于100bp，這樣電泳鑒定時(shí)效果最佳。經(jīng)過篩選，決定以限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為A↓AGCTT，采用RFLP方法分析鑒別黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代。
(2)PCR制備酶切底物
在黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代中PCR擴(kuò)增CH4基因片段，PCR體系和參數(shù)同上。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將檢測良好的產(chǎn)物用于后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)，檢測不佳的優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件后重新制備。
在冰上配制酶切反應(yīng)體系，按以下順序依次添加：
使用PCR儀進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)。
瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR-RFLP產(chǎn)物：
制備約2.5％的瓊脂糖凝膠，將6μL酶切產(chǎn)物加入點(diǎn)樣緩沖液并混勻，上樣電泳，恒壓100V電泳30min。電泳后用凝膠成像系統(tǒng)顯現(xiàn)目的條帶，對黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交F1代進(jìn)行PCR-RFLP分析。
結(jié)果顯示：黃顙魚的基因片段被完全酶切，雜交種的基因片段被部分酶切，瓦市黃顙魚的基因片段未被酶切。
本發(fā)明選擇了八尾黃顙魚、十二尾瓦氏黃顙魚進(jìn)行CH4片段擴(kuò)增，為了篩選酶切位點(diǎn)，對擴(kuò)增得到的CH4片段進(jìn)行了測序，并使用了MEGA5對序列結(jié)果進(jìn)行了比對分析，種內(nèi)的相似度接近100％；進(jìn)行酶切時(shí)，選擇了黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代8個(gè)個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，每一種設(shè)置一個(gè)對照組，酶切后觀察電泳條帶的數(shù)量即可得出結(jié)論，種內(nèi)的結(jié)果完全一致，種間差異明顯，說明其結(jié)果可靠，重復(fù)性強(qiáng)，且之后進(jìn)行鑒定時(shí)實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡便，無需測序。
本發(fā)明的瓊脂凝膠制備方法如下：
1％的瓊脂糖凝膠的制備方法
用天平稱取0.5g瓊脂糖，倒入50ml的1×TAE緩沖液中，搖勻后置于微波爐中加熱至完全溶解，取出待稍涼后(防止高溫使EB揮發(fā))，加入EB 1μL。將制膠板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入樣品梳子。將之前配制的瓊脂糖凝膠倒入制膠板內(nèi)槽。冷卻半小時(shí)待凝膠凝固后取出梳子，將凝膠放入電泳槽(Bio-Rad公司)內(nèi)并加入1×TAE電泳緩沖液使其浸沒凝膠。
2.5％的瓊脂糖凝膠的制備方法
用天平稱取1.25g瓊脂糖，倒入50ml的1×TAE緩沖液中，搖勻后置于微波爐中加熱至完全溶解，取出待稍涼后(防止高溫使EB揮發(fā))，加入EB 1μL。將制膠板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入樣品梳子。將之前配制的瓊脂糖凝膠倒入制膠板內(nèi)槽。冷卻半小時(shí)待凝膠凝固后取出梳子，將凝膠放入電泳槽(Bio-Rad公司)內(nèi)并加入1×TAE電泳緩沖液使其浸沒凝膠。
本發(fā)明使用的主要儀器如下：
離心機(jī)(eppendorf公司，Centrifuge5424)
PCR儀(BIO-RAD公司,S1000Thermal Cycler)
電泳裝置(BIO-RAD公司)
照膠儀(BIO-RAD公司，Universal Hood II)
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大學(xué)
<120> 雜交黃顙魚的CH4酶切鑒定方法
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 303
<212> DNA
<213> 黃顙魚
<400> 1
tccccaaggt ttacttgctc gctccaccag agggttcaaa ggacctggtg accctgactt 60
gctatgtaaa agacttctac cctaaggagg tggctgtgtc ttggcttgtt aacgatgaac 120
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tcttttcggt ttacagccag cttattttcg atgctacaca ctgggatagt ggctctgttt 240
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tcg 303
<210> 2
<211> 303
<212> DNA
<213> 瓦氏黃顙魚
<400> 2
tccccaaggt ttacttgctc gctccaccag agagttcaga gggcaggttg accctgactt 60
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aagtggattc agattcaaac tacgtgcaga gcaccactaa tgctattgag aaaaacaacc 180
tcttttcggt ttacagccag cttattttcg atgctgcacg ctggaatgat ggctctgttt 240
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