本發(fā)明涉及腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：腸炎沙門(mén)氏菌是最常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌感染類(lèi)型之一，是一種人獸共患的重要病原菌，其主要引起胃腸炎以及食物中毒。腸炎沙門(mén)氏菌在自然界廣泛存在，無(wú)宿主特異性，各種動(dòng)物源性食物是引起沙門(mén)氏菌感染的最常見(jiàn)媒介物。各種家禽、家畜在飼養(yǎng)、屠宰、加工、運(yùn)輸?shù)忍幚磉^(guò)程中均有污染的可能，人類(lèi)通常是由于攝入被污染的蛋類(lèi)或未完全煮熟的肉類(lèi)而被感染的。近年來(lái)，由腸炎沙門(mén)氏菌致病的病例不斷增多，已經(jīng)引起了公共衛(wèi)生的關(guān)注，建立實(shí)用、快速、高效的腸炎沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法尤為必要。傳統(tǒng)的腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)主要是依靠細(xì)菌，通過(guò)生化反應(yīng)及血清學(xué)特征來(lái)進(jìn)行鑒定，整個(gè)操作過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，復(fù)雜繁瑣，通常需要3-5天才能出檢測(cè)結(jié)果。PCR技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，逐步應(yīng)用于腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)中。目前，已針對(duì)一些靶基因建立了相應(yīng)的PCR檢測(cè)方法，但是，現(xiàn)有技術(shù)中選擇的許多靶點(diǎn)特異性不強(qiáng)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。雖然，也有用多重PCR方法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的報(bào)道，但多重PCR在實(shí)驗(yàn)成本和技術(shù)要求上都較普通PCR高，因而也存在一定的不足之處。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)方法或特異性不強(qiáng)、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，或存在實(shí)驗(yàn)成本和技術(shù)要求高的技術(shù)問(wèn)題，而提供一種特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)便的腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的下游引物。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中PCR反應(yīng)檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌選擇的靶基因不合理，容易造成檢測(cè)特異性低、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的技術(shù)問(wèn)題，特別通過(guò)生物信息學(xué)分析，從腸炎沙門(mén)氏菌基因組DNA序列中找到了特異性更好的DNA序列（如SEQIDNO.1所示），將該序列作為本發(fā)明腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靶點(diǎn)，并針對(duì)該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了檢測(cè)引物，經(jīng)過(guò)檢測(cè)采用本發(fā)明檢測(cè)引物檢測(cè)靶點(diǎn)基因具有單一特異性，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)的優(yōu)異效果，檢測(cè)結(jié)果更加真實(shí)可靠。一種腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)試劑盒，組分包括所述腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物。本發(fā)明腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)試劑盒中的PCR檢測(cè)引物特異性強(qiáng)，檢測(cè)精度高，采用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，無(wú)需使用抗血清，降低了檢測(cè)成本，且檢測(cè)時(shí)間短，避免了采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法繁瑣、耗時(shí)的缺點(diǎn)。進(jìn)一步，其組分還包括dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+和PCR反應(yīng)緩沖液。這些組分可以為擴(kuò)增反應(yīng)提供堿基原料，催化PCR反應(yīng)擴(kuò)增，使擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)環(huán)境更加適宜擴(kuò)增，增強(qiáng)擴(kuò)增的特異性，并為擴(kuò)增反應(yīng)提供能量，促進(jìn)擴(kuò)增反應(yīng)更快進(jìn)行。更進(jìn)一步，所述腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物的濃度為10μM，所述dNTP的濃度為2.5mM，所述Mg2+的濃度為25mM，所述PCR反應(yīng)緩沖液為10×PCR反應(yīng)緩沖液。采用這樣濃度的組分，可以使擴(kuò)增反應(yīng)的穩(wěn)定性和特異性更強(qiáng)，能夠獲得清晰的擴(kuò)增片段，電泳中不容易出現(xiàn)彌散背景，電泳產(chǎn)物判斷結(jié)果更加準(zhǔn)確。一種腸炎沙門(mén)氏菌的PCR檢測(cè)方法，以待檢測(cè)樣品DNA為模板，所述腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外線下觀察電泳結(jié)果，若在488bp處出現(xiàn)單一擴(kuò)條帶，則判定待檢測(cè)樣品中含有腸炎沙門(mén)氏菌。這樣，以待檢測(cè)樣品DNA為模板，本發(fā)明檢測(cè)引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若待檢測(cè)樣品中含有腸炎沙門(mén)氏菌，則會(huì)在引物和PCR反應(yīng)作用下進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌特征基因片段的擴(kuò)增，進(jìn)而擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析時(shí)，能夠在488bp處檢測(cè)到單一擴(kuò)條帶，若待檢測(cè)樣品中沒(méi)有腸炎沙門(mén)氏菌，則不會(huì)進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出特定基因片段，進(jìn)而不能在488bp處檢測(cè)到單一擴(kuò)條帶，達(dá)到了對(duì)待檢測(cè)樣品中是否含有腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)的目的。作為優(yōu)化，所述待檢測(cè)樣品DNA采用如下方法獲得：將待檢測(cè)樣品接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行離心和沉淀重懸處理后，將重懸菌液煮沸后冷卻，將冷卻后的重懸菌液離心取上清液，獲得待檢測(cè)樣品DNA。采用這樣的方法獲取待檢測(cè)樣品DNA，方法簡(jiǎn)單易于操作，且獲得的樣品DNA模板在后續(xù)PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增效果好，檢測(cè)結(jié)果可靠性強(qiáng)。作為優(yōu)化，將待檢測(cè)樣品于接種于LB液體培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)8h，取培養(yǎng)菌液于10000r/min下離心2min后棄上清液，重懸沉淀菌體得到重懸菌液，對(duì)重懸菌液再次于10000r/min下離心2min后再次重懸菌液，得到二次重懸菌液，將二次重懸菌液于沸水中煮沸，于-20℃冷卻，將冷卻后的二次重懸菌液于12000r/min下離心10min后取上清液，得到待檢測(cè)樣品DNA。采用多次離心重懸的方法，可以使獲得的待檢測(cè)樣品DNA中雜質(zhì)更少，避免了在PCR反應(yīng)中帶來(lái)干擾問(wèn)題。作為另一優(yōu)化，PCR反應(yīng)體系以25μL計(jì)，組分為：滅菌雙蒸水12μL、10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、10μM權(quán)利要求1所述上游引物1.0μL、10μM權(quán)利要求1所述下游引物1.0μL、2.5mMdNTP1.5μL、Taq酶1.0μL、25mMMg2+2.0μL和待檢測(cè)樣品DNA4.0μL。作為進(jìn)一步改進(jìn)，所述PCR反應(yīng)的條件為：先于94℃預(yù)變性5min；接著開(kāi)始循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后于72℃延伸5min，最后降溫至16℃，完成PCR反應(yīng)操作。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：1、采用本發(fā)明的檢測(cè)引物和PCR檢測(cè)方法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌，檢測(cè)時(shí)間短，無(wú)需使用抗血清，降低了檢測(cè)成本，避免了采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法繁瑣、耗時(shí)等缺點(diǎn)。2、本發(fā)明的檢測(cè)方法可以用于檢測(cè)某些抗血清不能檢測(cè)出的菌株，如抗原不表達(dá)的菌株，彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷。3、本發(fā)明PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)靶點(diǎn)具有單一特異性，檢測(cè)結(jié)果特異性好，不容易產(chǎn)生誤判；且檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，無(wú)需進(jìn)行大量的結(jié)果分析步驟，檢測(cè)結(jié)果判斷簡(jiǎn)單。4、采用本發(fā)明PCR擴(kuò)增檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)成本低，試驗(yàn)技術(shù)要求不高，便于進(jìn)行市場(chǎng)化推廣。附圖說(shuō)明圖1為PCR檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳圖；圖2為PCR檢測(cè)方法靈敏性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施案例在以本發(fā)明技術(shù)為前提下進(jìn)行實(shí)施，現(xiàn)給出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程來(lái)說(shuō)明本發(fā)明具有創(chuàng)造性，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于以下的實(shí)施例。1、引物設(shè)計(jì)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中PCR反應(yīng)檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌靶基因選擇不合理，檢測(cè)特異性低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明申請(qǐng)人通過(guò)生物信息學(xué)分析，從腸炎沙門(mén)氏菌基因組DNA序列中尋找特異的DNA序列（序列如SEQIDNO.1所示），將其作為檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的靶點(diǎn)，將此序列輸入PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)置GC范圍為40-60%，產(chǎn)物大小范圍為100-1000bp，從備選引物中選擇引物，結(jié)果選擇的腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)引物如下：如SEQIDNO.2所示的上游引物，核苷酸序列為5’tgtcagaaaccgctctggttatcg3’；如SEQIDNO.3所示的下游引物，核苷酸序列為5’attccaggtggaaagcattaacgac3’。引物由寶生物工程大連有限公司合成。2、模板準(zhǔn)備將腸炎沙門(mén)氏菌接種至20mLLB液體培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)8h；取1mL菌液于1.5mL離心管中，10,000r/min離心2min，棄上清；向離心沉淀物中加入500μL滅菌雙蒸水重懸菌體，再次于10,000r/min離心2min，棄上清，向離心沉淀中加100μL滅菌雙蒸水再次重懸菌體；將再次重懸菌體于沸水中煮6min，立即取出，于-20℃冷卻后，再以12,000r/min離心10min，取上清液于1.5mL離心管中，放置-20℃作為PCR擴(kuò)增的DNA模板。3、方法建立腸炎沙門(mén)氏菌檢測(cè)試劑盒，其組分包括如SEQIDNO.2所示的上游引物、如SEQIDNO.3所示的下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+、水和PCR反應(yīng)緩沖液。25μLPCR樣品檢測(cè)體系組成為：滅菌雙蒸水12μL，10×PCRBuffer2.5μL，上游引物（10μM）1.0μL，下游引物（10μM）1.0μL，dNTP（2.5mM）1.5μL，Taq酶1.0μL，Mg2+（25mM）2.0μL，模板DNA4.0μL。以無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照，即25μLPCR陰性對(duì)照體系組成為：滅菌雙蒸水12μL，10×PCRBuffer2.5μL，上游引物（10μM）1.0μL，下游引物（10μM）1.0μL，dNTP（2.5mM）1.5μL，Taq酶1.0μL，Mg2+（25mM）2.0μL，無(wú)菌水4.0μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：首先94℃預(yù)變性5min；接著開(kāi)始循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min，最后降溫至16℃，結(jié)束操作。依據(jù)下述判斷標(biāo)準(zhǔn)確定樣品中是否含腸炎沙門(mén)氏菌：取3μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.5wt.%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下進(jìn)行觀察，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在488bp處出現(xiàn)單一擴(kuò)條帶，則表面樣品中含腸炎沙門(mén)氏菌，如果在488bp處未出現(xiàn)單一擴(kuò)條帶，則表面樣品中不含腸炎沙門(mén)氏菌。以上述“2、模板準(zhǔn)備”得到的腸炎沙門(mén)氏菌DNA作為模板DNA，按照“3、方法建立”建立的體系組成和PCR反應(yīng)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示在488bp處觀察到單一擴(kuò)增條帶，說(shuō)明所建立的PCR方法能夠成功檢測(cè)出腸炎沙門(mén)氏菌。4、特異性評(píng)價(jià)取腸炎沙門(mén)氏菌(SalmonellaEnteriditis)、雞沙門(mén)氏菌(SalmonellaGallinarum)、豬霍亂沙門(mén)氏菌(SalmonellaCholeraesuis)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaTyphimurium)、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaParatyphiA)、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaParatyphiB)、雞白痢沙門(mén)氏菌(SalmonellaPullorosis)、都柏林沙門(mén)氏菌(SalmonellaDublin)、傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellaTyphi)、鴨沙門(mén)氏菌(SalmonellaAnatum)等11株菌，其血清型及菌株編號(hào)見(jiàn)表1，按照“2、模板準(zhǔn)備”的方法培養(yǎng)各菌株并提取各菌株基因組DNA模板。按照與“3、方法建立”中相同的體系和反應(yīng)方法對(duì)提取得到的各菌株基因組DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別取4mL各菌株基因組DNA作為模板加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5wt.%凝膠電泳，紫外燈下觀察，結(jié)果如圖1和表1所示，圖1中1泳道:DNAMarker；2泳道:ddH2O陰性對(duì)照；3泳道:鼠傷寒沙門(mén)氏菌；4泳道:雞沙門(mén)氏菌；5泳道:豬霍亂沙門(mén)氏菌；6泳道:傷寒沙門(mén)氏菌；7泳道:腸炎沙門(mén)氏菌；8泳道:腸炎沙門(mén)氏菌。圖1可見(jiàn)，腸炎沙門(mén)氏菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在488bp處出現(xiàn)單一條帶，而其它菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后無(wú)任何條帶，說(shuō)明所建立的PCR檢測(cè)方法可以特異檢測(cè)到腸炎沙門(mén)氏菌。表1特異性試驗(yàn)所用菌株及結(jié)果菌株編號(hào)菌數(shù)結(jié)果SalmonellaTyphimuriumATCC140281-SalmonellaGallinarumCMCC507701-SalmonellaCholeraesuisAS1.11901-SalmonellaTyphiCMCC500861-SalmonellaEnteriditisCVCC33771+SalmonellaEnteriditisCMCC503351+SalmonellaPullorosisCVCC20011-SalmonellaParatyphiAATCC91501-SalmonellaParatyphiBCMCC500041-SalmonellaDublinCVCC21991-SalmonellaAnatumCMCC507741--:PCR結(jié)果為陰性；+:PCR結(jié)果為陽(yáng)性5、靈敏性試驗(yàn)按照“2、模板準(zhǔn)備”的方法提取腸炎沙門(mén)氏菌基因組DNA模板，經(jīng)測(cè)定所提取的DNA模板溶液中DNA濃度為18.73μg/mL，用無(wú)菌水10倍稀釋該模板DNA，共稀釋4個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度分別取4mL作為模板DNA加入與“3、方法建立”中相同的PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5wt.%凝膠電泳，紫外燈下觀察，結(jié)果如圖2所示，圖2中1泳道:DNAMarker；2泳道:ddH2O陰性對(duì)照；3泳道:74.92ng；4泳道:7.492ng；5泳道:749.2pg；6泳道:74.92pg。圖2表明，3-5泳道在488bp處能看到清晰的條帶，其對(duì)應(yīng)的DNA濃度分別為74.92ng/PCR、7.492ng/PCR和0.7492ng/PCR，濃度低于0.7492ng/PCR以后泳道在該處看不到條帶，說(shuō)明PCR檢測(cè)靈敏度為749.2pg/PCR，具有較高的靈敏度。6、腸炎沙門(mén)氏菌疑似菌株檢測(cè)利用所建立的腸炎沙門(mén)氏菌特異性PCR檢測(cè)方法，對(duì)從食品中自行分離的45株疑似沙門(mén)氏菌進(jìn)行了檢測(cè)，這些食品樣品采集于鄉(xiāng)村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，參照國(guó)標(biāo)GB4789.4-2010進(jìn)行樣品處理和疑似菌株分離。按照與“2、模板準(zhǔn)備”相同的方法提取各個(gè)分離得到的菌株的基因組DNA模板，采用與“3、方法建立”中相同的體系和反應(yīng)方法對(duì)提取得到的各個(gè)分離菌株的基因組DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從中檢出6株疑似菌株腸炎沙門(mén)氏菌陽(yáng)性，進(jìn)一步對(duì)這6株疑似菌株進(jìn)行沙門(mén)氏菌屬診斷血清（蘭州生物制品研究所）鑒定，結(jié)果是9：g,m:-，與腸炎沙門(mén)氏菌的血清型（1,9,12：g,m:-）相符合，判斷其為腸炎沙門(mén)氏菌（血清鑒定步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)及國(guó)標(biāo)GB4789.4-2010），其它疑似菌株經(jīng)鑒定都不是腸炎沙門(mén)氏菌，說(shuō)明所建立的腸炎沙門(mén)氏菌特異性PCR檢測(cè)方法具有非常高的可靠性。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。<110>重慶理工大學(xué)；<120>一種腸炎沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法；<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>537<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQIDNO.1的核苷酸序列<400>1ttgagagttattgatatgtcagaaaccgctctggttatcgtaaaattcctaattggtaaa60tccgtcggacaatttatgctcacagtggctttatttttcttaattatcatcttcattcct120agagatattacggagcttattgaggcgcgtagcgatttaccatatgccgttcagattttt180agttttgctgtggcttaccttatagtgctgatcctcaaagtcactggttattttttcgtg240tcggcgctgccgttgtgccagcgtaggggcagggcaaaacgcatgttaaaaacgcttaat300tcattgagtactgaacagctgtttttacttgaaccctttcttaaaactcattctcccact360ttccgggcgtcctgggataaccctgatgcagatgctctggttaaggcaggtatcgttcgt420ccggctggttcgtgtatcgacggtgtttctgtgatgttcaaaatcgaacccgagtatgag480tcgttaatgctttccacctggaatccctgcacaaaacggttcgatattagccgttag537<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>上游引物<400>2tgtcagaaaccgctctggttatcg24<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>下游引物<400>3attccaggtggaaagcattaacgac25當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3