本發(fā)明屬于植物病害檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
柑橘炭疽病和柑橘腳腐病是柑橘上的兩種重要病害，其病原均為菌絲狀病原菌。Colletotrichum gloeosporioides為炭疽菌屬真菌，該菌不僅可使柑橘地上部分的各個部位發(fā)病，造成柑橘樹勢衰弱及減產(chǎn)減收，還可引起貯藏期果實大量腐爛。Phytophthora capsici為疫霉屬卵菌，可導(dǎo)致柑橘莖基腐、流膠、葉斑、技梢枯及根腐等癥狀。近期調(diào)研發(fā)現(xiàn)此二種病原菌在我國柑橘產(chǎn)區(qū)的發(fā)病率不斷上升（B. P. Cheng et al. 2014, Plant Disease; 陳國慶. 2010），二者復(fù)合侵染的情況越來越多，針對此二種病害建立快速定量檢測方法有助于掌握其在我國的流行趨勢和危害程度，及時發(fā)出病害預(yù)警，從而為我國柑橘產(chǎn)業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展提供保障。
針對Colletotrichum gloeosporioides的檢測，目前已有核酸雜交和脈沖場電泳的方法，但非常繁瑣，普通PCR可用于該菌的檢測，但檢測靈敏度不足。Phytophthora capsici的檢測，目前已有普通PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)和實時熒光定量PCR的方法。但普通PCR檢測靈敏度不足，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)無法精確定量，而實時熒光定量PCR方法在定量分析時，需要依賴標準物質(zhì)和標準曲線，僅能實現(xiàn)相對定量分析；另外，實時熒光定量PCR對反應(yīng)擴增效率要求很高，且易受柑橘樣品DNA純度和PCR抑制因子等因素的影響，導(dǎo)致對目標序列定量的不準確估計。此外，基于實時熒光定量PCR的復(fù)合多靶標體系的優(yōu)化非常困難，定量分析通量較低。因此，現(xiàn)有方法已不能完全滿足柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌高靈敏度定量檢測的需求。
本發(fā)明開發(fā)了一套柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，新開發(fā)的檢測方法具有如下幾個方面的優(yōu)點。1.可進行簡便可靠的絕對定量：本方法所使用的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法采用了數(shù)字檢測芯片系統(tǒng)，其數(shù)字PCR的檢測芯片微孔數(shù)遠大于樣品中病原菌的靶標拷貝數(shù)，該方法通過樣品極限稀釋、泊松分布和終點法PCR，來實現(xiàn)核酸的絕對定量，因此本方法的靶標定量檢測不依賴于擴增曲線的閾值，不受PCR擴增效率的影響，也不需建立標準曲線，不需進行復(fù)雜的轉(zhuǎn)化運算，因此更加簡便的實現(xiàn)絕對定量分析，并具有更好的檢測準確度和重現(xiàn)性。2.抗雜質(zhì)干擾能力強，檢測靈敏度高：本發(fā)明的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法，可將每個樣品分成20,000多個均勻的納升級微滴，其中每個微滴都作為一個獨立的PCR反應(yīng)器，這種方法可在很大程度上把柑橘樣品中的雜質(zhì)及柑橘基因組與病原菌靶標隔離開，極大的減少了其他物質(zhì)的干擾；由于該技術(shù)使每一出現(xiàn)陽性熒光的微孔對應(yīng)一個病原菌靶標拷貝，因此即使檢測體系中僅有一個靶標拷貝也可以很好的檢出。3.高特異性：本發(fā)明根據(jù)柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的特有序列設(shè)計了特異性引物和特異探針，其特異性高，且非常穩(wěn)定，保證了反應(yīng)的順利進行，進一步確保柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌檢出的特異性。4.功能更多：本發(fā)明同時使用柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的特異性引物和不同熒光標記的特異探針，結(jié)果讀取時使用兩個不同的熒光檢測通道，可在一次實驗可同時檢出2種病原菌，減少了實驗時間和步驟。5.檢測速度快：本發(fā)明提供的方法和試劑盒方便快捷，整個檢測時間僅需要數(shù)小時，節(jié)省大量人力成本和時間成本。
根據(jù)檢索相關(guān)的研究及專利文獻,未見有柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測的相關(guān)文獻報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、擴增效果好的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測引物及其檢測試劑盒；通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌檢測引物，其核苷酸序列為：
（1）柑橘炭疽病菌的特異引物及探針為：
上游引物TJB1-F：5'-CAGCCGATGTAGGCCCTC-3'
下游引物TJB1-R：5'-AGGTCAACCTTTGGAAAATTG-3'
探針TJB1-P：FAM 5’-AGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATC-3’ BHQ
所述探針5’ 端熒光報告基因為FAM，3’ 端淬滅基團為BHQ；
（2）柑橘腳腐病菌的特異引物及探針為：
上游引物JFB1-F：5'-TGTTACGGACCAAGAGTCTTTC-3'
下游引物JFB1 -R：5'-GCAATAGTTAGCTCCCTTCTGTA -3'
探針JFB1 -P：HEX 5'-CAAGCAGTGGCTGCATGAGATCG-3' BHQ
所述探針5’端熒光報告基因為HEX，3’端淬滅基團為BHQ。
本發(fā)明的另一目的在于，提供一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒。該試劑盒含有上述柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌引物對；其具體組分為：病樣DNA提取試劑盒、數(shù)字PCR反應(yīng)試劑；
（1）病樣DNA提取試劑盒：2% CTAB 溶液、巰基乙醇、酚/氯仿溶液以及無水乙醇溶液；
（2）數(shù)字PCR反應(yīng)試劑：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 濃度為10μmol/L的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各1支，200μL 濃度為10μmol/L的探針TJB1-P以及JFB1-P各1支，1mL柑橘炭疽病陽性對照樣品模板、柑橘腳腐病陽性對照樣品模板以及陰性對照樣品模板各1支。
該試劑盒的具體使用步驟為：
（1）提取柑橘病樣DNA：
a)采集柑橘病樣200mg，加液氮研磨成粉末狀；
b)研磨粉末加入500μl的CTAB提取緩沖液及5μL巰基乙醇，震蕩混勻，65℃水浴20分鐘，12000 r/min,離心10 分鐘；
c)吸取上清液，加入等體積的酚/氯仿溶液,混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min；
d)吸取上清，加入等體積無水乙醇，12000 r/min,離心10 min；
e)棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
f)室溫下干燥沉淀，溶于40μl去離子水，即提取得到樣品DNA。
（2）配置數(shù)字PCR反應(yīng)體系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針TJB1-P、JFB1-P各0.3μL，10μM的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各0.6μL，柑橘病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O補足至16μL。
（3）PCR擴增：96℃預(yù)變性10min；98℃，變性30s，60℃延伸2min，共進行40個循環(huán)；最后10℃停止反應(yīng)。
（4）檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號，確定柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的靶標的拷貝數(shù)：擴增產(chǎn)物熒光信號的檢測方式為讀取FAM與VIC通道的熒光信號，通過QuantStudio? 3D Digital PCR機載軟件進行定量分析，計算靶標拷貝數(shù)。
本發(fā)明的有益效果在于：
（1）可進行簡便可靠的絕對定量：本方法所使用的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法采用了數(shù)字檢測芯片系統(tǒng)，其數(shù)字PCR的檢測芯片微孔數(shù)遠大于樣品中病原菌的靶標拷貝數(shù)，該方法通過樣品極限稀釋、泊松分布和終點法PCR，來實現(xiàn)核酸的絕對定量，因此本方法的靶標定量檢測不依賴于擴增曲線的閾值，不受PCR擴增效率的影響，也不需建立標準曲線，不需進行復(fù)雜的轉(zhuǎn)化運算，因此更加簡便的實現(xiàn)絕對定量分析，并具有更好的檢測準確度和重現(xiàn)性。
（2）抗雜質(zhì)干擾能力強，檢測靈敏度高：本方法的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法，可將每個樣品分成20,000多個均勻的納升級微滴，其中每個微滴都作為一個獨立的PCR反應(yīng)器，這種方法可在很大程度上把柑橘樣品中的雜質(zhì)及柑橘基因組與病原菌靶標隔離開，極大的減少了其他物質(zhì)的干擾，由于該技術(shù)使每一出現(xiàn)陽性熒光的微孔對應(yīng)一個病原菌靶標拷貝，因此即使檢測體系中僅有一個靶標拷貝也可以很好的檢出。
（3）高特異性：本發(fā)明根據(jù)柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的特有序列設(shè)計了特異性引物和特異探針，其特異性高，且非常穩(wěn)定，保證了反應(yīng)的順利進行，進一步確保柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌檢出的特異性。
（4）功能更多：本發(fā)明同時使用柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的特異性引物和不同熒光標記的特異探針，結(jié)果讀取時使用兩個不同的熒光檢測通道，可在一次實驗可同時檢出2種病原菌，減少了實驗時間和步驟。
（5）檢測速度快：本發(fā)明提供的方法和試劑盒方便快捷，整個檢測時間僅需要數(shù)小時，節(jié)省大量人力成本和時間成本。
綜上，本發(fā)明試劑盒和方法可以滿足柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的早期、準確、定量分析的要求，可為柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的早期、精確和定量檢測、流行病學(xué)調(diào)查提供科學(xué)依據(jù)，具有良好的發(fā)展應(yīng)用前景。
具體實施方式
為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體的實施例做進一步說明，下列具體實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1：引物初步篩選及檢測。
利用primer primer5軟件檢測引物間的互補性及引物退火溫度，選擇退火溫度適宜、擴增的目的片段易于區(qū)分的引物對。本發(fā)明針對柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌各設(shè)計2對引物和探針。
本實施例給出了篩選最佳引物的過程，用于篩選的備選引物如下，見表1。
表1 柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的備選引物序列
用于備選的引物及探針組合包括：TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，TJB 2-F+ TJB 2-R+ TJB 2-P，JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P，JFB 2-F+ JFB 2-R+ JFB2-P，使用探針法熒光定量PCR分別進行特異性分析，20μL的反應(yīng)體系，Premix Ex Taq緩沖液10μL、模板3μL，引物終濃度500 nM，探針終濃度250 nM，補ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性20s，然后95℃ 5s，60℃ 40s，40個循環(huán)，最后10℃停止反應(yīng)。其Ct值如表2所示，因此根據(jù)實驗結(jié)果選擇檢測效果更好的TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P的引物與探針組合。
表2 不同引物對熒光定量PCR中的Ct值
實施例2：引物特異性分析
為驗證本發(fā)明定量檢測方法對柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌檢測的特異性，分別運用TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P的引物與探針組合對柑橘炭疽病和柑橘腳腐病病樣進行檢測。運用數(shù)字定量PCR體系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針和引物TJB 1-F、TJB 1-R、TJB 1-P、JFB1-F、JFB 1-R、JFB 1-P各0.2μL，柑橘病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O 補足至16μL。數(shù)字PCR擴增反應(yīng)程序為：96℃預(yù)變性10min；98℃變性30s；60℃延伸2min，共進行40個循環(huán)，最后10℃停止反應(yīng)。在FAM通道下檢測本研究室保存的柑橘潰瘍病病樣、柑橘炭疽病病樣、柑橘腳腐病病樣、柑橘衰退病病樣、柑橘裂皮病病樣、柑橘黃龍病病樣、柑橘炭疽病陽性對照樣品、健康柑橘陰性對照樣品的熒光信號，結(jié)果顯示：柑橘炭疽病病樣與柑橘炭疽病陽性對照樣品為陽性，其余樣品顯示陰性。在VIC通道下檢測本研究室保存的柑橘潰瘍病病樣、柑橘炭疽病病樣、柑橘腳腐病病樣、柑橘衰退病病樣、柑橘裂皮病病樣、柑橘黃龍病病樣、柑橘腳腐病陽性對照樣品、健康柑橘陰性對照樣品的熒光信號，結(jié)果顯示：柑橘腳腐病病樣和腳腐病陽性對照樣品為陽性，其余樣品顯示陰性，實驗結(jié)果見表3。該實驗表明TJB1-F+TJB1-R+TJB1-P，和JFB1-F+JFB1-R+JFB1-P的引物與探針組合有較好的檢測特異性。
表3 數(shù)字PCR定量檢測方法的檢測特異性驗證
實施例3：不同退火溫度對柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR反應(yīng)的影響.
運用TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P的引物與探針組合。運用數(shù)字定量PCR體系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針和引物TJB 1-F、TJB 1-R、TJB 1-P、JFB1-F、JFB 1-R、JFB 1-P各0.2μL，柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌復(fù)合侵染病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O補足至16μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：96℃預(yù)變性10min，98℃變性30s，然后分別在溫度梯度（56，58，60，62）下退火延伸2min，共進行40個循環(huán)；最后10℃停止反應(yīng)。
結(jié)果：不同退火溫度下，F(xiàn)AM信號通道或VIC檢測通道中的檢測值差異不大，根據(jù)實驗結(jié)果選擇60℃的退火延伸溫度。
實施例4：不同引物和探針濃度對柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR反應(yīng)的影響.
運用不同濃度組合的TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P進行數(shù)字PCR檢測。運用數(shù)字定量PCR體系配方：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，引物探針TJB 1-F、TJB 1-R、TJB 1-P、JFB1-F、JFB 1-R、JFB 1-P濃度均為10μmol/L，加入不同體積的引物和探針，柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌復(fù)合侵染病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O 補足至16μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：96℃預(yù)變性10min；98℃，變性30s；60℃退火延伸2min，共進行40個循環(huán)，最后10℃停止反應(yīng)。所使用的引物、探針量以及試驗結(jié)果如表4所示。
表4 雙重PCR體系中不同濃度的引物與探針組合。
根據(jù)實驗結(jié)果，選擇最佳的第3個組合。
實施例5：柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法的建立
1、雙重數(shù)字PCR定量檢測試劑盒的組裝
柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測試劑盒，該試劑盒包含：柑橘病樣DNA提取試劑、數(shù)字PCR反應(yīng)試劑。
所述DNA提取液包括：2% CTAB 溶液 [2% CTAB (w/v), 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% (v/v) PVP]；巰基乙醇；酚/氯仿溶液；無水乙醇溶液。
所述PCR反應(yīng)試劑包括：1mL的ddH2O 1支，1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支，200μL 濃度為10μmol/L的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各1支，200μL 濃度為10μmol/L的探針TJB1-P以及JFB1-P各1支，1mL柑橘炭疽病陽性對照樣品模板、柑橘腳腐病陽性對照樣品模板以及陰性對照樣品模板各1支。
所述引物與探針的序列為：
柑橘炭疽病菌的特異引物及探針為：
上游引物TJB1-F：5'-CAGCCGATGTAGGCCCTC -3'
下游引物TJB1-R：5'-AGGTCAACCTTTGGAAAATTG-3'
探針TJB1-P：FAM 5’-AGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATC-3’ BHQ
所述探針5’ 端熒光報告基因為FAM，3’ 端淬滅基團為BHQ；
柑橘腳腐病菌的特異引物及探針為：
上游引物JFB1-F：5'-TGTTACGGACCAAGAGTCTTTC-3'
下游引物JFB1 -R：5'-GCAATAGTTAGCTCCCTTCTGTA -3'
探針JFB1 -P：HEX 5'-CAAGCAGTGGCTGCATGAGATCG-3' BHQ
所述探針5’端熒光報告基因為HEX，3’端淬滅基團為BHQ。
2、一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法，其具體檢測方法包括如下步驟：
（1）提取柑橘病樣DNA：
a)采集柑橘病樣200mg，加液氮研磨成粉末狀；
b)研磨粉末加入500μl的CTAB提取緩沖液及5μL巰基乙醇，震蕩混勻，65℃水浴20min，12000 r/min,離心10 min；
c)吸取上清液，加入等體積的酚/氯仿溶液,混勻，4℃，12000 r/min，離心10 min；
d)吸取上清，加入等體積無水乙醇，12000 r/min,離心10 min；
e)棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
f)室溫下干燥沉淀，溶于40μl去離子水，即提取得到樣品DNA。
（2）配置數(shù)字PCR反應(yīng)體系：2×3D Digital PCR Master Mix 8.0μL，10μM的探針TJB1-P、JFB1-P各0.3μL，10μM的探針TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R、各0.6μL，柑橘病樣DNA模板3μL，其余用ddH2O補足至16μL。
（3）PCR擴增：96℃預(yù)變性10min；98℃，變性30s，60℃延伸2min，共進行40個循環(huán)；最后10℃停止反應(yīng)。
（4）檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號，確定柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的靶標的拷貝數(shù)：擴增產(chǎn)物熒光信號的檢測方式為讀取FAM與VIC通道的熒光信號，通過QuantStudio? 3D Digital PCR機載軟件進行定量分析，計算靶標拷貝數(shù)。
實施例6柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法與熒光定量PCR檢測方法的對比分析
為比較本檢測方法與熒光定量PCR檢測方法的檢測效果，提取柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌復(fù)合侵染樣品的DNA模板，然后10 倍梯度稀釋為10-1至10-4等系列稀釋液，作為PCR的模板。以本試劑盒中二個病害病樣的陰性對照模板和陽性對照模板為參照，使用柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法對兩種病原菌進行同時檢測，實驗檢測方法及體系參照本發(fā)明前述說明。同時作為對照，分別使用柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌熒光定量PCR檢測方法對兩種病原菌進行分別檢測，所用的引物及探針組合為：TJB 1-F+ TJB 1-R+ TJB 1-P，和JFB1-F+ JFB 1-R+ JFB 1-P，16μL的反應(yīng)體系，Premix Ex Taq緩沖液8μL、模板3μL，10μmol/L引物各0.6 μL，10μmol/L探針各0.3μL，補ddH2O至16μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性20s，然后95℃ 5s，60℃ 40s，40個循環(huán)，最后10℃停止反應(yīng)。實驗結(jié)束后，記錄檢測結(jié)果。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩類檢測方法均對柑橘炭疽病和柑橘腳腐病罹病樣品檢出陽性結(jié)果。本發(fā)明所用的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法在樣品稀釋梯度為10-1至10-3的3個DNA模板中可檢出陽性結(jié)果(表5)；柑橘炭疽病菌熒光定量PCR檢測方法和和柑橘腳腐病菌熒光定量PCR檢測方法同樣可在10-1至10-3的3個稀釋度DNA 模板中檢出陽性結(jié)果。其中，在10-3稀釋的cDNA模板中每微升可檢到約4.637個柑橘炭疽病菌靶標和3.813個柑橘腳腐病菌靶標拷貝。以上結(jié)果表明本發(fā)明所采用的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法的檢測靈敏度與柑橘炭疽病菌及柑橘腳腐病菌熒光定量PCR檢測方法相當，但與柑橘炭疽病菌及柑橘腳腐病菌熒光定量PCR檢測方法相比，本發(fā)明所用的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法的優(yōu)點在于：1. 柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病實時熒光定量PCR方法在定量分析時，需要依賴標準物質(zhì)和標準曲線，僅能實現(xiàn)相對定量分析，本發(fā)明所用的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法通過樣品極限稀釋、泊松分布和終點法PCR，來實現(xiàn)核酸的絕對定量，因此本方法的靶標定量檢測不依賴于擴增曲線的閾值，不受PCR擴增效率的影響，也不需建立標準曲線，不需進行復(fù)雜的轉(zhuǎn)化運算，因此更加簡便的實現(xiàn)絕對定量分析。2. 柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌熒光定量PCR檢測只能分別檢測兩種病原菌。如果把兩種病原菌的引物和探針混雜在一起，會產(chǎn)生較大的互相干擾，因此其復(fù)合多靶標體系的優(yōu)化非常困難；而本方法的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法，可將每個反應(yīng)體系分成20,000多個均勻的納升級微滴，其中每個微滴都作為一個獨立的PCR反應(yīng)器，這種方法可把兩個病原菌的引物和探針進行較大的分割，顯著減少了引物間的相互干擾，因此復(fù)合多靶標體系容易優(yōu)化，從而實現(xiàn)兩種病原菌的同時檢測。
表5 兩種病原菌檢測方法的檢測靈敏度對比研究。
實施例7. 柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法對田間實際樣品的檢測
于廣東柑橘產(chǎn)區(qū)采集疑似柑橘炭疽病和柑橘腳腐病的5個柑橘病樣，參照實施例5，提取病樣DNA作為模板，并用本發(fā)明所述的柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重數(shù)字PCR定量檢測方法進行檢測，同時設(shè)置柑橘炭疽病和柑橘腳腐病陽性對照樣品及健康柑橘陰性對照，結(jié)果表明：1、4號病樣復(fù)合感染柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌，2、3、5號樣品僅感染柑橘炭疽病菌；柑橘炭疽病和柑橘腳腐病陽性對照及健康柑橘陰性對照可正確檢測；進一步通過柑橘炭疽病菌熒光定量PCR檢測方法和柑橘腳腐病菌熒光定量PCR檢測方法進行驗證，結(jié)果完全一致。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
<120> 柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒及其應(yīng)用
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> TJB1-F
<400> 1
cagccgatgt aggccctc 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> TJB1-R
<400> 2
aggtcaacct ttggaaaatt g 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> TJB1-P
<400> 3
agtaacttta cgtctcgcac tgggatc 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> JFB1-F
<400> 4
tgttacggac caagagtctt tc 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> JFB1 -R
<400> 5
gcaatagtta gctcccttct gta 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> JFB1 -P
<400> 6
caagcagtgg ctgcatgaga tcg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> TJB2-F
<400> 7
catcgaatct ttgaacgcac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> TJB2-R
<400> 8
cccaacacca agcagagctt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> TJB2-P
<400> 9
agcattctgg cgggcatgcc t 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> JFB2-F
<400> 10
ttgtgctaat tatcttgtgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
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tcttggtccg taacatcgta 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> JFB2-P
<400> 12
ccgcacaatt actagcagct actacc 26