本發(fā)明屬于核酸檢測技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基于LAMP技術的檢測維氏粒線蟲的方法。

背景技術：

線形動物門是動物界中最大的門之一，為假體腔動物，有超過28,000個已被記錄的物種，尚有大量種尚未命名。絕大多數(shù)體小呈圓柱形。它們在淡水、海水、陸地上隨處可見，不論是個體數(shù)或物種數(shù)都往往超越其他動物。此外，有許多種的線蟲是寄生性的(超過16,000種)，包括許多植物及人類在內(nèi)的動物的病原體。

粒屬線蟲是一類高度?；闹参锓N子和地上部寄生線蟲，可危害多種禾本科植物，導致產(chǎn)量和質(zhì)量嚴重下降。我國口岸曾多次在進境牧草種子中截獲粒屬線蟲，該類線蟲在植物穗部形成蟲癭，在收獲植物種子時蟲癭脫落混入植物種子，隨植物種子的調(diào)運作遠距離傳播。

粒屬線蟲中，維氏粒線蟲(Anguina wevelli)是非常重要的種類，是牧草及草坪草的重要有害生物。2013年，上海出入境檢驗檢疫局全國首次在進境的畫眉草種子中截獲維氏粒線蟲。目前，在中國尚未有維氏粒線蟲的分布報道，一旦該線蟲隨入境的草籽傳入我國，將很難根治。

線蟲進行分類鑒定多數(shù)是依據(jù)成熟雌蟲的形態(tài)學特征，幼蟲和雄蟲形態(tài)一般不作為定種的主要依據(jù)。據(jù)維氏粒線蟲的生活史可知，要得到該線蟲的雌、雄蟲，關鍵是找到蟲癭?？诎稒z驗檢疫部門在進境牧草種子檢疫中遇到的難題是只分離到粒屬線蟲的幼蟲，卻沒有找到蟲癭，難以根據(jù)幼蟲特征進行種類鑒定。還有，粒屬線蟲的形態(tài)學鑒定要求鑒定人員具有良好的分類學基礎。

因此，開展維氏粒線蟲的分子生物學檢測方法研究，建立能夠準確、快速鑒定幼蟲的分子生物學技術，對于保護中國的生物物種安全是十分迫切和必要的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于LAMP技術的檢測維氏粒線蟲的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測維氏粒線蟲的方法，所述方法包括：

以待測樣品的DNA為模板，以特異性擴增引物進行環(huán)介導等溫擴增；若發(fā)生特異性擴增，則表明待測樣品中包含維氏粒線蟲；

所述的特異性擴增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種將維氏粒線蟲與其它線蟲進行區(qū)分的方法，所述方法包括：

以待測線蟲的DNA為模板，以特異性擴增引物進行環(huán)介導等溫擴增；若發(fā)生特異性擴增，則表明待測線蟲為維氏粒線蟲；若不發(fā)生特異性擴增，則表明待測線蟲為非維氏粒線蟲；

所述的特異性擴增引物包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

在一個優(yōu)選例中，所述的環(huán)介導等溫擴增的體系中包括所述的特異性擴增引物、Tris-HCl、K⁺、Mg²⁺、(NH₄)₂SO₄、Tween20、甜菜堿、dNTP、DNA聚合酶；較佳地，所述的環(huán)介導等溫擴增的體系中還包括鈣黃綠素；較佳地，Mg²⁺濃度8±1mM、甜菜堿濃度0.8±0.2M、dNTP濃度1.4±0.2mM、Tris-HCl濃度20±3mM、K⁺濃度10±2mM、(NH₄)₂SO₄濃度10±2mM、Tween20濃度0.1±0.02％。

在另一優(yōu)選例中，所述的環(huán)介導等溫擴增在63±1℃恒溫反應。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣品包括(但不限于)：植物、動物(包含家畜)、飼料、土壤、淡水、海水、地下水。

在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣品或待測線蟲包括：維氏粒線蟲，小麥粒線蟲，剪股穎粒線蟲，?？凭€蟲，鱗球莖莖線蟲，莖屬線蟲，朱頂紅短體線蟲，穿刺短體線蟲，北方根結(jié)線蟲，西班牙根結(jié)線蟲，無花果胞囊線蟲，仙人掌胞囊線蟲，松材線蟲，滑刃屬線蟲，柑橘半穿刺線蟲，強壯盤旋線蟲，厚皮擬毛刺線蟲，腎形擬毛刺線蟲，具毒毛刺線蟲，貝克劍線蟲，Xiphinema incertum。

在另一優(yōu)選例中，所述方法對于維氏粒線蟲的最低檢測限為1/80000條幼蟲DNA。

在本發(fā)明的另一方面，提供用于檢測維氏粒線蟲的引物，所述引物是LAMP擴增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于從待測樣品中檢測維氏粒線蟲；或用于將維氏粒線蟲與其它線蟲進行區(qū)分。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測維氏粒線蟲的試劑盒，其中包括所述的引物。

在一個優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括(但不限于)：含有維氏粒線蟲的檢測標準品；Tris-HCl；DNA提取試劑；pH緩沖試劑；鉀離子溶液；鎂離子溶液；銨離子溶液；Tween20；甜菜堿；dNTP；DNA聚合酶；熒光染料；和/或說明檢測維氏粒線蟲的方法的使用說明書。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、第一組LAMP特異性檢測(LA-320C柱狀圖)；其中，樣本DNA模板順序從左至右依次為：3維氏粒線蟲，4維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，6小麥粒線蟲，7小麥粒線蟲，8剪股穎粒線蟲，9剪股穎粒線蟲，10?？凭€蟲，11鱗球莖莖線蟲，12鱗球莖莖線蟲，13鱗球莖莖線蟲，14莖屬線蟲，15莖屬線蟲，16莖屬線蟲，17莖屬線蟲，及ddH₂O。

圖2、第一組LAMP特異性檢測(LA-320C曲線圖)；其中，A、C圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：3維氏粒線蟲，4維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，6小麥粒線蟲，7小麥粒線蟲，8剪股穎粒線蟲，9剪股穎粒線蟲，10?？凭€蟲；B、D圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：11鱗球莖莖線蟲，12鱗球莖莖線蟲，13鱗球莖莖線蟲，14莖屬線蟲，15莖屬線蟲，16莖屬線蟲，17莖屬線蟲，及ddH₂O；

圖A、B：樣本反應速率曲線；

圖C、D：樣本反應擴增曲線。

圖3、第一組LAMP特異性檢測(顯色法)；其中，1～16反應管的DNA模板順序依次為：3維氏粒線蟲，4維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，6小麥粒線蟲，7小麥粒線蟲，8剪股穎粒線蟲，9剪股穎粒線蟲，10?？凭€蟲，11鱗球莖莖線蟲，12鱗球莖莖線蟲，13鱗球莖莖線蟲，14莖屬線蟲，15莖屬線蟲，16莖屬線蟲，17莖屬線蟲，及ddH₂O。

圖4、第二組LAMP特異性檢測(LA-320C柱狀圖)；其中，樣本DNA模板順序從左至右依次為：1維氏粒線蟲，2維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，ddH₂O，9剪股穎粒線蟲，18朱頂紅短體線蟲，19穿刺短體線蟲，20傷殘短體線蟲，21北方根結(jié)線蟲，22西班牙根結(jié)線蟲，23無花果胞囊線蟲，24仙人掌胞囊線蟲，25松材線蟲，26滑刃屬線蟲，27柑橘半穿刺線蟲，28強壯盤旋線蟲，29厚皮擬毛刺線蟲，30腎形擬毛刺線蟲，31具毒毛刺線蟲，32貝克劍線蟲，33Xiphinema incertum。

圖5、第二組LAMP特異性檢測(LA-320C曲線圖)；其中，A、D圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：1維氏粒線蟲，2維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，ddH₂O，9剪股穎粒線蟲，18朱頂紅短體線蟲，19穿刺短體線蟲，20傷殘短體線蟲；B、E圖CH1～CH8樣本DNA模板順序依次為：21北方根結(jié)線蟲，22西班牙根結(jié)線蟲，23無花果胞囊線蟲，24仙人掌胞囊線蟲，25松材線蟲，26滑刃屬線蟲，27柑橘半穿刺線蟲，28強壯盤旋線蟲；C、F圖CH1～CH5樣本DNA模板順序依次為：29厚皮擬毛刺線蟲，30腎形擬毛刺線蟲，31具毒毛刺線蟲，32貝克劍線蟲，33Xiphinema incertum。

圖A、B、C：樣本反應速率曲線；

圖D、E、F：樣本反應擴增曲線。

圖6、第二組LAMP特異性檢測(顯色法)；其中，1～21反應管的DNA模板順序依次為：1維氏粒線蟲，2維氏粒線蟲，5維氏粒線蟲，ddH₂O，9剪股穎粒線蟲，18朱頂紅短體線蟲，19穿刺短體線蟲，20傷殘短體線蟲，21北方根結(jié)線蟲，22西班牙根結(jié)線蟲，23無花果胞囊線蟲，24仙人掌胞囊線蟲，25松材線蟲，26滑刃屬線蟲，27柑橘半穿刺線蟲，28強壯盤旋線蟲，29厚皮擬毛刺線蟲，30腎形擬毛刺線蟲，31具毒毛刺線蟲，32貝克劍線蟲，33Xiphinema incertum。

圖7、LAMP靈敏度檢測(LA-320C柱形圖)；其中，1～7號樣本為3號DNA梯度稀釋的模板，依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，8號的模板為ddH₂O。

圖8、LAMP靈敏度檢測(LA-320C曲線圖)；其中，CH1～CH7樣本為3號DNA梯度稀釋的模板，依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，CH 8的模板為ddH₂O。

左圖：樣本反應速率曲線；

右圖：樣本反應擴增曲線。

圖9、目視濁度法呈現(xiàn)LAMP靈敏度檢測結(jié)果；其中，左起第1～7反應管樣本為3號DNA梯度稀釋的模板，依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，第8反應管的模板為ddH₂O。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗，首次揭示一種維氏粒線蟲的環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)檢測方法。經(jīng)過比較篩選，本發(fā)明人揭示了對于維氏粒線蟲特異性良好的LAMP擴增引物，所述引物針對含有維氏粒線蟲的DNA可發(fā)生特異性擴增(獲得陽性結(jié)果)，而對沒有維氏粒線蟲的非維氏粒線蟲或非線蟲的DNA不發(fā)生特異性擴增(獲得陰性結(jié)果)。本發(fā)明的方法可良好地應用于鑒定維氏粒線蟲、將之與其非常接近的其它種類的線蟲相區(qū)分，并且具有良好的再現(xiàn)性、靈敏度、檢測穩(wěn)定性。

如前所述線蟲的種類非常多，超過28,000個已被記錄的物種，粒屬線蟲是一類高度?；闹参锓N子和地上部寄生線蟲，而維氏粒線蟲是其中之一。

鑒于線蟲種類繁多，從如此多的種類中找到對于維氏粒線蟲特異性的鑒定試劑非常困難。需要考慮的不僅僅是維氏粒線蟲這類物種本身的基因序列，而是需要考慮不要與其它與之具有親緣關系的諸多物種產(chǎn)生交叉反應，這是非常困難的。對于這種區(qū)分，本領域中目前而言尚缺乏檢測手段。

為此，本發(fā)明人經(jīng)過了長期的研究和篩選，深入比對維氏粒線蟲種內(nèi)的保守性和非維氏粒線蟲種間的差異性，以及比對粒線蟲的屬內(nèi)的保守性和非粒線蟲屬間的差異性，經(jīng)過針對各種樣本的反復試驗驗證，最終確定了適用于鑒定維氏粒線蟲的特異性引物和探針序列，即以下特異性擴增引物：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4；所述的引物應用于LAMP反應，速度很快，從而不需要環(huán)引物的參與即可良好地完成反應。

為此，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和大量的篩選，找到了合適的檢測靶標，基于此開發(fā)了LAMP檢測維氏粒線蟲的方法。

如本文所用，所述的“待測樣品”可以是(但不限于)：植物、動物(包含家畜)、飼料、土壤、淡水、海水、地下水等。

本發(fā)明人通過對引物的篩選，獲得一類可特異性鑒定維氏粒線蟲的引物，其對于維氏粒線蟲的DNA發(fā)生特異性擴增，而對沒有維氏粒線蟲的DNA不發(fā)生特異性擴增。

因此，本發(fā)明提供一種引物，所述的引物是LAMP擴增引物，包括：正向外引物SEQ ID NO:1，反向外引物SEQ ID NO:2，正向內(nèi)引物SEQ ID NO:3，反向內(nèi)引物SEQ ID NO:4。

本發(fā)明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質(zhì)進行標記。

利用本發(fā)明的引物，進行LAMP反應，并通過濁度儀檢測或顯色觀察，就可以準確、快速地判斷待測樣品是否含有維氏粒線蟲，而且所需的樣品量很少。

LAMP是近年來發(fā)展的一種新穎和較成熟的等溫核酸擴增技術。LAMP是針對靶基因的多個區(qū)域設計特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下，即可完成的核酸擴增反應。與PCR方法相比，LAMP不需要熱循環(huán)儀(PCR儀)，且由于LAMP反應中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產(chǎn)物通過肉眼觀察或濁度計即可判定結(jié)果；因此LAMP適合于現(xiàn)場或條件較差的實驗室進行快速檢測。LAMP技術具有快速、準確和操作簡便等優(yōu)點。

本發(fā)明建立的維氏粒線蟲的LAMP檢測方法，用于解決我國檢驗檢疫一線實驗室快速、準確鑒定維氏粒線蟲的檢測需求。

獲取待測樣品的DNA的方法是本領域技術人員所熟知的技術，例如可采取傳統(tǒng)的酚/氯仿/異戊醇法，或者可采用一些商購的DNA提取試劑盒，這類試劑盒是本領域技術人員熟知的。

本發(fā)明還涉及一種用于檢測維氏粒線蟲的試劑盒，所述試劑盒中含有針對維氏粒線蟲的LAMP擴增引物。

此外，所述的試劑盒還可含有其它檢測維氏粒線蟲的試劑，如(但不限于)：含有維氏粒線蟲的檢測標準品；DNA提取試劑；pH緩沖試劑(如Tris-HCl(PH8.8))；鉀離子溶液；鎂離子溶液；銨離子溶液；Tween20；甜菜堿；dNTP；Bst大片段DNA聚合酶；熒光染料(如SYBR Green I熒光染料)。

此外，所述的試劑盒中還可含有檢測維氏粒線蟲的使用說明書和/或標準操作程序。

本發(fā)明所述的試劑盒可實現(xiàn)快速檢測、批量檢測維氏粒線蟲的目的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：

(1)首次揭示一種可特異性檢測維氏粒線蟲的引物，所述的引物特異性良好，對于維氏粒線蟲的核酸(如DNA)能夠?qū)崿F(xiàn)特異性擴增，而對于維氏粒線蟲以外的其它物種不能特異性擴增。并且，所述引物具有良好的再現(xiàn)性、結(jié)果穩(wěn)定可靠。

(2)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法快速、便捷。只需要60min即可完成LAMP反應，而且對儀器設備要求低，不需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等昂貴儀器，使用水浴鍋即可完成檢測。

(3)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法靈敏度高。檢測極限達到1/80000條幼蟲DNA。

(4)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法特異性強。本發(fā)明的方法只能夠特異地擴增維氏粒線蟲，供試其它8種?？凭€蟲和16種非粒科線蟲均未發(fā)生非特異性擴增，具有物種特異性。

(5)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法穩(wěn)定性良好。檢測靈敏度之內(nèi)的所有維氏粒線蟲樣本LAMP反應均呈陽性擴增(前后多次試驗共計18個反應)。

(6)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法步驟簡單。所有試劑在反應前添加，實現(xiàn)一步核酸擴增。

(7)本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法結(jié)果判定簡便。其產(chǎn)物的檢測方法比較多，用肉眼觀察濁度或熒光顯色就能夠判斷擴增與否，實現(xiàn)了結(jié)果可視化，還可采用實時濁度儀等方法判定。

本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP快速檢測方法具有物種特異性和穩(wěn)定性，且費用成本低廉，操作簡便，快速準確，適用于各種實驗條件的實驗室(尤其是基層實驗室)對維氏粒線蟲的檢測，對口岸快速檢測具有重要意義。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

材料與方法

1.1線蟲

維氏粒線蟲DNA(南非)、剪股穎粒線蟲DNA由天津出入境檢驗檢疫局提供，小麥粒線蟲DNA來自美國北卡羅來那州農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)服務處線蟲實驗室。其它供試線蟲DNA均為上海出入境檢驗檢疫局近年檢疫工作中收集的線蟲DNA。

線蟲及其來源見表1。

表1、供試線蟲DNA及其寄主植物材料和來源

備注：鑒于外來DNA材料有限及DNA模板濃度有限，特使用全基因組擴增試劑盒對外來DNA進行擴增得到新的濃縮的DNA材料，表中加*號標注。

1.2主要試劑與儀器

試劑：

Bst DNA polymerase large fragment購自New England Biolabs公司。

Tris，KCl，(NH₄)₂SO₄，Tween20，MgSO₄，甜菜堿(Betaine)購自Sigma公司。

熒光染料鈣黃綠素，購自榮研生物科技(中國)有限公司。

dNTPs和MgCl₂購自寶生物工程(大連)有限公司。

本發(fā)明所設計的LAMP引物委托上海生工生物技術有限公司合成。

其它常規(guī)試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

儀器：

LAMP實時濁度儀LA-320C。

旋渦混合器。

微量移液器。

冰箱。

離心機。

1.3 DNA提取

線蟲DNA提取使用DNeasyBlood&Tissue Kit(Qiagen)試劑盒，提取方法按照試劑盒使用說明書進行。

1.4 LAMP引物設計

本發(fā)明人進行了大量的研究、分析，包括線蟲屬內(nèi)比較(將維氏粒線蟲與粒屬的其它近似種進行比較)、屬間比較(將維氏粒線蟲與粒屬線蟲以外其它線蟲進行比較)，以及將維氏粒線蟲與大量其它物種進行比較。在此基礎上，本發(fā)明人設計了適用于鑒定維氏粒線蟲的LAMP特異性檢測引物。所述的引物序列如表2所示。

表2

1.5 LAMP擴增和檢測

25μL LAMP反應體系中各組分終濃度為：

當需要進行顯色反應時，還在反應體系中加熒光試劑鈣黃綠素1μL。用滅菌雙蒸水補足體系。

LAMP反應條件：

63℃恒溫反應60min，80℃滅活5min結(jié)束反應。

采用以下方法鑒別是否發(fā)生了LAMP反應：

(A)直接通過LAMP實時濁度儀觀察；

(B)在反應前向待測體系中加入1μL鈣黃綠素，反應后觀察溶液顏色是否變?yōu)榫G色；

(C)直接目視觀察反應管中是否有白色渾濁物產(chǎn)生。

1.6 LAMP特異性試驗

將供試材料中的線蟲DNA分成2組，采用顯色法的反應體系，分別進行LAMP擴增。第一組模板選取隸屬于?？凭€蟲(包括形態(tài)近似種和系統(tǒng)發(fā)育近源的線蟲)的DNA，第二組模板主要選取非?？凭€蟲的DNA。

使用LAMP實時濁度儀實時監(jiān)測LAMP反應，63℃運行65min，驗證LAMP反應的特異性。

分別以實時濁度儀和顯色法觀察檢測結(jié)果。

1.7 LAMP靈敏度試驗

供試維氏粒線蟲的DNA以10倍梯度進行系列稀釋，DNA模板依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，共7個稀釋度，進行靈敏度試驗。

使用LAMP實時濁度儀實時監(jiān)測LAMP反應，63℃運行65min，以確定LAMP檢測靈敏度。

分別以實時濁度儀和目視濁度法進行檢測。

實施例1、維氏粒線蟲的LAMP特異性試驗

使用所設計的引物和檢測體系對供試線蟲DNA進行LAMP檢測。設計兩組試驗組進行LAMP特異性試驗。

第一組，供試線蟲包括：維氏粒線蟲，小麥粒線蟲，剪股穎粒線蟲，粒科線蟲1種，鱗球莖莖線蟲，莖屬線蟲4種。LAMP特異性試驗結(jié)果如圖1～3。

圖1為LA-320C柱形圖呈現(xiàn)第一組LAMP特異性檢測的結(jié)果。由結(jié)果可見，16個樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽性擴增，其它?？凭€蟲均未發(fā)生擴增。

圖2為LA-320C曲線圖呈現(xiàn)第一組LAMP特異性檢測的結(jié)果。可見，16個樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽性擴增，其它粒科線蟲均未發(fā)生擴增。

圖3為顯色法呈現(xiàn)第一組LAMP特異性檢測的結(jié)果?？梢姡?6個樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽性擴增(呈現(xiàn)綠色)，其它粒科線蟲均未發(fā)生擴增。

第二組，供試線蟲包括：維氏粒線蟲，剪股穎粒線蟲，以及朱頂紅短體線蟲等16種非?？凭€蟲(見表1中編號18～33)。LAMP特異性試驗結(jié)果如圖4～6。

圖4為LA-320C柱形圖呈現(xiàn)第二組LAMP特異性檢測的結(jié)果。可見，21個樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽性擴增，其它?？凭€蟲和非粒科線蟲均未發(fā)生擴增。

圖5為LA-320C曲線圖呈現(xiàn)第二組LAMP特異性檢測的結(jié)果?？梢?，21個樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽性擴增，其它?？凭€蟲和非?？凭€蟲均未發(fā)生擴增。

圖6為顯色法呈現(xiàn)第二組LAMP特異性檢測的結(jié)果?？梢?，21個樣本中，僅維氏粒線蟲樣本呈陽性擴增(呈現(xiàn)綠色)，其它?？凭€蟲和非粒科線蟲均未發(fā)生擴增。

實施例2、維氏粒線蟲的LAMP靈敏度試驗

將供試線蟲DNA(表1中3號維氏粒線蟲單條幼蟲DNA)以10倍梯度進行系列稀釋，DNA模板依次為：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，共7個稀釋度，進行靈敏度試驗。

從圖7～圖9可以看出，單條幼蟲DNA在10^-3稀釋度時，45min內(nèi)就可以準確檢測到擴增產(chǎn)物，10^-4稀釋度未發(fā)生擴增反應。

該樣本單條幼蟲DNA提取時得到的DNA體積為200μL，由此可算出本發(fā)明建立的維氏粒線蟲LAMP檢測方法最低檢測限為1/80000條幼蟲DNA。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

序列表

<110> 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心

<120> 一種基于LAMP技術的檢測維氏粒線蟲的方法

<130> 167544

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

cctttccgtg gaatgttgaa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

acgtaccgat tctcttcaa 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 3

ggtggggact tcaccagaaa atagccaaac agtccaagaa gg 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

tggacgaaaa aacggctctg gacgtaggca tacaactgct 40