本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因組序列的擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
尖鋤蚌（Ptychorhynchus pfisteri）隸屬于軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、蚌目、蚌科、尖鋤蚌屬。貝殼長(zhǎng)連橢圓形，外形似珠蚌，但殼頂平低不突出。鉸合部左殼具兩個(gè)擬主齒和一個(gè)側(cè)齒，右殼具一個(gè)擬主齒和兩個(gè)側(cè)齒。殼面后背部具數(shù)條細(xì)的明顯的斜肋。蚌類具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如提取抗腫瘤成分；作為制造紐扣貝雕等工藝品的原料，珍珠層可以用來制造各種精美的螺細(xì)、器皿和家具等；蚌類軟體部分可供人們食用或作為飼料；淡水蚌對(duì)水環(huán)境中Cu、Zn和Cd有去除與積累的作用，吸收富集重金屬，改良水質(zhì)。蚌科動(dòng)物是淡水貝類最大的一個(gè)科，包括 674 個(gè)物種，淡水蚌類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的水生生物，作為濾食者，能夠通過濾食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、有機(jī)物和浮游生物來改良水質(zhì)，對(duì)水環(huán)境還有生物監(jiān)測(cè)的作用。淡水蚌類在淡水生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺，其生物量和密度往往都在底棲動(dòng)物中占優(yōu)勢(shì)，對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)有重要作用，如果淡水湖泊或者是河流中的淡水蚌類消失，將會(huì)引起一系列的生態(tài)問題?？偠灾?，淡水蚌類對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要，對(duì)水體的水質(zhì)、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)作用巨大，且具有較高的營(yíng)養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。
線粒體基因組DNA是裸露的雙鏈超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀分子，少數(shù)為線狀分子(如原生動(dòng)物草履蟲與四膜蟲的mtDNA)，是真核細(xì)胞的第二遺傳信息系統(tǒng)，或稱核外基因及其表達(dá)體系。相對(duì)于核DNA，mtDNA具有分子量小、多態(tài)性高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、堿基突變率高、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生理病理、臨床診斷、遺傳變異、分子標(biāo)記、系統(tǒng)進(jìn)化等多方面的研究，與線粒體和線粒體基因組相關(guān)的研究已成為進(jìn)化生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿。
蚌科動(dòng)物線粒體的遺傳不單單是母系遺傳，還存在線粒體基因組遺傳的一種特例——雙單親遺傳現(xiàn)象（Doubly-Uniparental Inheritance, DUI）。這種遺傳方式使后代中雌性mtDNA只來自母系（female-transmitted, F type），與嚴(yán)格的母系遺傳相似；而雄性的mtDNA 來自雙親，在雄性的體細(xì)胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA（male-transmitted, M type）。因此，建立一種穩(wěn)定的擴(kuò)增尖鋤蚌F型線粒體基因組全序列的方法在比較和進(jìn)化基因組學(xué)、保護(hù)生物學(xué)和資料的可持續(xù)利用等研究中有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、快速擴(kuò)增尖鋤蚌F型線粒體基因組全序列的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明所述的一種尖鋤蚌F型線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括以下步驟：
（1）基因組DNA提?。?/p>
（2）普通PCR擴(kuò)增及測(cè)序：使用了三對(duì)通用引物如下：
COIP1: GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G
COIP2: TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA
16SP1: CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT
16SP2: CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T
ND1P1: TGGCAGAAAAGTGCATCAGATTAAAGC
ND1P2: CCTGCTTGGAAGGCAAGTGTACT
（3）設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段引物：本發(fā)明設(shè)計(jì)了三對(duì)長(zhǎng)片段引物如下：
F COI-16sP1： TTCAGCCACTAAGCCAGGAG
F COI-16sP2：CTTGTTGGTTCCGAGATTGC
F 16s-ND1 P1：CAACCGCTATGAAAGGACAG
F 16s-ND1 P2：GGGTTAGAATAAACGGAAGGT
F ND1-COI P1：TGCCGAGGGCGAATCAGA
F ND1-COI P2： TTGGTGGAAAGTGGTGTTGGA
（4）LA-PCR擴(kuò)增及測(cè)序；
（5）序列拼接；
（6）基因注釋。
本發(fā)明首次公開了尖鋤蚌F型線粒體基因組全序列，也是首次公開了一種擴(kuò)增尖鋤蚌F型線粒體基因組序列的方法，可以為蚌科的線粒體基因組學(xué)研究和種質(zhì)資源保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)材料。
本發(fā)明的有益效果：通過設(shè)計(jì)特異性長(zhǎng)片段引物，通過LA-PCR技術(shù)對(duì)尖鋤蚌F型線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行測(cè)序、拼接和校正，獲得了尖鋤蚌F型線粒體基因組全序列；本發(fā)明對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性、操作時(shí)間相對(duì)較短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明獲得的尖鋤蚌F型線粒體基因組序列，可從組成和結(jié)構(gòu)的角度對(duì)尖鋤蚌F型線粒體基因組進(jìn)行分析，可以豐富蚌科線粒體基因組信息，為蚌類的系統(tǒng)發(fā)育、種質(zhì)資源保護(hù)、可持續(xù)和合理地利用奠定重要的分子遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
一種尖鋤蚌F型線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括如下步驟。
1、基因組DNA提取。
使用購自天根生化科技有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，提取尖鋤蚌的總DNA，包括以下步驟。
（1）取尖鋤蚌的新鮮肌肉組織50mg，置于1.5ml已滅菌離心管中，用潔凈的滅好菌的剪刀充分剪碎放入裝有200 l GA緩沖液的離心管中，渦旋振蕩15sec。
（2）加入20 l proteinase K(20mg/ml)溶液，渦旋混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。在56℃放置，直至組織完全溶解，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
（3）加入200 l 緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
（4）加入200 l 無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
（5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(~13400*g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入500 l 緩沖液GD(GD中已加入無水乙醇)，12000rpm(~13400*g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
（7）向吸附柱CB3中加入600 l 漂洗液PW(PW中已加入無水乙醇)，12000rpm(~13400*g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
（8）重復(fù)操作步驟7。
（9）將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(~13400*g)離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
（10）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl 洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm(~13400*g)離心2min，將溶液收集到離心管中。
（11）將純化好的線粒體DNA置于-20℃保存，以備后用。
2、普通PCR擴(kuò)增及測(cè)序。
對(duì)于尖鋤蚌F型線粒體的cox1、16SrRNA和nad1基因部分序列的擴(kuò)增分別采用如下引物擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。包括以下幾個(gè)步驟。
（1）用于擴(kuò)增尖鋤蚌F型線粒體的cox1、16SrRNA和nad1基因部分序列的引物為通用引物如下：
COIP1: GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G
COIP2: TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA
16SP1: CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT
16SP2: CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T
ND1P1: TGGCAGAAAAGTGCATCAGATTAAAGC
ND1P2: CCTGCTTGGAAGGCAAGTGTACT
（2）三個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)的模板為上述提取的尖鋤蚌的基因組DNA100ng，反應(yīng)總體系為50μL，其中10×Ex Taq PCR Buffer 5μL，dNTPs2.5mmol/L，引物0.4μmol/L，Ex Taq酶1U；
PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10sec；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35次；最后72℃延伸7min。
3、設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段引物。
把cox1、16SrRNA和nad1基因的部分片段的測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行nucleotide blast，確定都為蚌科動(dòng)物線粒體DNA基因片段且均為正義鏈。利用Primer premier5.0將前期得到的cox1、16SrRNA和nad1基因片段三段序列為模板設(shè)計(jì)三對(duì)長(zhǎng)PCR引物結(jié)果為：
F COI-16sP1： TTCAGCCACTAAGCCAGGAG
F COI-16sP2：CTTGTTGGTTCCGAGATTGC
F 16s-ND1 P1：CAACCGCTATGAAAGGACAG
F 16s-ND1 P2：GGGTTAGAATAAACGGAAGGT
F ND1-COI P1：TGCCGAGGGCGAATCAGA
F ND1-COI P2： TTGGTGGAAAGTGGTGTTGGA
4、LA-PCR擴(kuò)增及測(cè)序。
使用設(shè)計(jì)的三對(duì)長(zhǎng)PCR引物及TaKaRa生物公司的LA Taq聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增：反應(yīng)的模板為上述提取的尖鋤蚌的基因組DNA100ng，反應(yīng)總體系為50μL，其中10×LA Taq PCR Buffer 5μL，dNTPs 2.5mmol/L，引物各0.4μmol/L，LA Taq酶1U。
LA-PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，54℃退火30sec，68℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。LA-PCR產(chǎn)物產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有清晰的條帶；產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。
5、序列拼接。
把實(shí)驗(yàn)所得的全部序列片段利用DNASTAR7.1軟件中的SeqMan組件進(jìn)行拼接，組裝成一條首尾相接的序列，并仔細(xì)檢查，對(duì)照測(cè)序峰圖人工校正序列中相沖突的位點(diǎn)，校正完后再利用SeqMan把首尾的重復(fù)序列去除其中一個(gè)，最終得到完整的線粒體DNA全序列。
6、基因注釋。
尖鋤蚌F型線粒體DNA全序列的注釋參考珠蚌亞科已測(cè)物種的F型線粒體基因組DNA，用在線工具ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)和Blast查找線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)基因，利用在線工具ARWEN (http://130.235.46.10/ARWEN)和MITOS (http://mtos.biinf.unileizig.de/help. py)查找22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因以及控制區(qū)(Control Region，CR)。該序列總長(zhǎng)16091bp，包括13個(gè)編碼蛋白質(zhì)，22個(gè)tRNA，2個(gè)rRNA和1個(gè)FORF，全基因序列還未上傳GenBank。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
SEQUENCE LISTING
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ctatctagac aacaatacaa ccttcgcaat ctgcctattt gaatgaaacg aagcaggaaa 60
aaccccatcc tgccactcaa aagaagtcct caacgctctc ccccaaacaa cagatcgctg 120
agaaacaaaa gactctaata acataaacat gaataataaa acagaaacaa aagaaatcaa 180
agaccctcaa gaagatacca cattccactt tgcaaaccta tcaggataat cagagtatcg 240
acgaggcatt ccagccaacc ctaaaaagtg ttgcgggaaa aaagttaaat taacaccaac 300
aaacatcaaa ataaaatgaa ccttccttca aacaacatga aaagtaacac cagagataag 360
tgggtaccaa tacctaaaag cactaaataa agcaaaaaca gcccctattc tcaaaacata 420
atgaaaatgg gctactacgt aataagtatc atgtaaaaca atatcaagag aagagttaga 480
aagaacaatt ccagttaacc caccaactgt aaacaaaaaa ataaagccta aagcccacat 540
aataggcggc tcagtcttgt taacaaaccc atgaatagtt gctaaccaac taaatacctt 600
aattcctgta ggcacagcaa taattatagt tgcagcagta aaataagctc gagtgtccac 660
atccatcccc actgtaaaca tatgatgagc ccaaacaata aaacccaaaa ccccaataga 720
aacaatagca taaaccatcc ccaaataacc aaatacttgc ttcttcccag cataatgcat 780
aacaatatgc gaaatcatac caaacccagg caaaatcaaa atatatacct caggatgccc 840
aaaaaaccaa aacaaatgta tatataaaat agggtctccc ccaccagtag gatcaaaaaa 900
agaggtattc aaattacggt cagtaagcaa catcgtaata gcacctgcca acacaggcaa 960
cgccgcaact aacaaaaccg ctgttaccgt cacagcccac acaaacaacg gaattcgttc 1020
agccactaag ccaggagacc gcatattccc aacagtagaa ataaaattaa tagcacccaa 1080
aatagaagaa gcacctgcaa gatgtaacga aaaaatagct aaatcaaccg aagccccaga 1140
gtgagcaaca ttccctgaca aggggggata gacagtccac cctgttccaa caccactttc 1200
caccaatgaa gagctcaaca acaaaaaaag agctggcaca agcaaccaaa acctcaaatt 1260
attcaaacga ggaaaagcta tatctggtgc cccgatcata agcggaataa gtcaatttcc 1320
aaacccccca attatcattg gcataactaa aaagaaaatt atcataaaag catgggctgt 1380
aacaattaca ttatatagtt gatcatcccc taacaaccta ccaggctgcc ccaactccgc 1440
ccgaatcaaa agacttaaag ccaaaccaat caaaccagac cacaaagcta acaacaaata 1500
taatgtacca atatctttat gattagtaga acacaatcac cgcaactaac ttcaccaact 1560
gattagctaa ttaactagcg catcaaccaa gaataaaaaa cctcagggga aaccccctcc 1620
accccaatag gtataaatga gtgattcaca ccacaaattt cactacactg cccgaacatc 1680
acaccagacc ccatcaaatg cacccctaac tgattaattc gaccaggaat agcgtcgacc 1740
ttcaccccta tagatggaag agctcaagca tgaattacat cagcagatct cacaagaatt 1800
cgcctatcaa ccccataagg caacacacac cgattatcaa cttccaacaa acggtaactc 1860
ccctccccaa tatcgccggc ccctactatg tatgagtcaa atctaaccga tgttcctcca 1920
tcattatatt catactccca ataccactga tgccccacag ccttcatcct aactgcgggc 1980
cccccgactt cgtctagtaa atataacaac cgaacagaag gaatagccaa aattaataga 2040
agtaacccag gaattacagt ccaagccgcc tccaaagcct gagcctccat aagaaaccga 2100
gaagaaaaac tactcttcaa caaacataac attatataac ctacgaatga agacaccata 2160
acaagaacaa acatagcatg atcatgaaaa aaagttagct caaagctcaa agcactaaaa 2220
ctatcctgaa accctaactg acctcaaaag ctcatctatc aaccttcacc acactactgc 2280
tctgcataac actcaatatt gctaacccta acgaaaagat tcccccatct atagaaccac 2340
aatctattgt tttttttaaa ctattcgtta ccatcaacac tggttatatc atttactctt 2400
gtttaaaaaa ctttaaataa tcaaaacccc cccaaagaaa gaaagtttat ataacaaaaa 2460
aagaaaaaag agaagtagcc gagctaatat gaggcttcta accacataaa gagaggttta 2520
actcctttca cttctcttta aattacctac ctaatgaaat caccccacaa atttttgttc 2580
ttattcctaa taataggaag cacttgtata gtcctatcct catccaactg attaatgaca 2640
tgaataggac tagaaatcaa tatactagga tttatccctc ttatatacct aaaagaaact 2700
gctaatgaat ctgaaacagt ggtaaaatat ctaatcccac aatccctagg ttcaacgatt 2760
tttattgcct cagccacaat ctctctctac ctagacacta ttcagccact cataccgcta 2820
gcaatgtgtt taaagttagg ggctgcacca tttcacttct gattcccacc cgtaatagca 2880
ggcctccctc tgttaccagc ctttatcctt ctaacttggc aaaaaattgc tccaattttt 2940
gccattaggg cccttaaccc aacactaaca acaaaaatta ttctaatcgc aagaattaga 3000
gctctgtgag ggggcattgg cggaataaac caaacagaca ttcgctctct actaacatac 3060
tcctcaattg cacacaccgg atggatacta gccagcatca acagcattgc tcctacttta 3120
agggtctata ttataacgta cgtacttatt aatctctcaa tttacgtaac cctaaattca 3180
acctccacaa aattccacaa acagctcttt gccccaaaag aatctcacaa ctcactccta 3240
ctagccgcca gcattctttc ccttggtggc ctcccccctc ttaccgggtt tattataaaa 3300
ctgctagtta ttagctatac ccaaaccagc ttatttatta tctctacctt aatcattgga 3360
gccctaatta gtttattcta ctacctgtcc ttaacttttt ccccactact acaactcact 3420
aaaacacacc taaataaatc cctcatctca aaaccagcca taatattttt tcttgcccaa 3480
atcttacctt tgtctacctt aatgttcctc ttttaagtgg gataagctaa tttcaaaagc 3540
tgttgggctc ataacccaaa aatagatata ctcttcccac caaattgcca gcaattaacg 3600
cattttaagc tactcaccca aaaaatttta aattaagata aatctcactg caacttaacc 3660
ctctcactcc aaagacccct cccgccactc atgaataacc cccccataca acaacactag 3720
aaagaataat agtgtcaaca accccccgac ccacatcaaa ggcctcccag ctactatgac 3780
agctggaaat aacaaaacaa tttccacatc aaaaaccaca aaaataacag ctagcaaaaa 3840
aaaccgcaaa gagaaaggaa cccgagaaga cccaactggg tcaaatccac actcaaaggg 3900
tctagacttc tctcggcctc taaacaaaga aaaccctaag aataaaccaa caattaacaa 3960
cacaaagcac aacaccacag acaacaatac acttaccaca actttttcca tctaccttat 4020
caggtaacac actaataaat cattccaaat cacttaacca acccaaccaa aaacatccat 4080
tcaccagttt atataagact ttctttaatt aaaaattctt aattaagaag ttctatactt 4140
taactaaaag acctgatttg caatcaacca ttgagtgcca actccaacac tctagaacta 4200
cctaaacaaa ggacctcgga gaatatttgc cttgaaatca aacagaaagt gttcgactca 4260
cttatccttt taatttcctt gctaattaag tgtttctcag cacattgact tttcacgtca 4320
aaggagcatg tttatgcact tggctaccac aaactacacc atcaaatcgc caaaaatgtc 4380
aaaacttttc acaaccacaa acctactgtg tcttaacctt actttaacta tactactcct 4440
attttataac accttaatac cagaaacaat ttgagccaac gacccaacaa caaacttccc 4500
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gtctaacaaa caaacactca aacttaatat aaattaagga gcttaagtta aataaactaa 4680
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acccgctaat tcaggtgaca tatagccgat ggaaagctga ctcatgggat acaaataaac 5460
ccactatcga acctaaaact taaaccttta acgaaggagg acttgaaagt aagaccgcac 5520
ctaataaagc cgatctgaac aagaacttaa gcgcgcacaa atcgcccgtc actccggcag 5580
taaagtcgga taagtcgtaa cacagtaggg gtaatggaaa ttgcccctat cacgtccaag 5640
gtggccgaga ccctaggcat cgagctttta actcgagtac agtaaattac tccaggacag 5700
ctttgagaag ctaatcagca tcggtcttgt aaaccgaaga caggctataa tttccccaaa 5760
gctcatagca aagtggccga gaacaggcaa aagattgtag ctctttatac gggccacccc 5820
ctttgcaaac aatactacca aacacatgaa agaactcaag aaaataatca ctccacacag 5880
tattttatta aaatagttat ttatatacac ccgcaagggc aaatctctcg tatagtatag 5940
aaaagattac aacttgtccc ttttgcatca tggagaagca acacaaacct aacaacttaa 6000
gctcccgaac aactatgagc tactaaacct taaaaatcaa tgtttcataa ttgataaatt 6060
aacttttagt agaagtaata agccttccat atagttaaat agctggcttt cccttaaaag 6120
catcaaagtg ctgccttata gattagttta cataaaccaa acaactatat aggtcaacct 6180
tctgaggatt agctcggaag gataacaaaa atacacaaag ccctatcccc aaaagtaggc 6240
ttaaaaacag ccacctaaca acgttctagt taatggctta aaacaccaat aatattaaag 6300
tccccatttt acttaaacaa gggaacttga cgccaaatat aacacgtcat tgaaccggca 6360
ttctattagt attaatatta caaaccccaa aaaattaaaa ataattggat cccaaaataa 6420
ataaaatata aaatatataa agtgaactcg gcaacaaagt tctctgcctg tttaccaaaa 6480
acatcgtctt ctgagcccag acatagaaga taatgcctgc ccagtgaagt atttaaacgg 6540
ccgcgttagc gtgagcgtgc taaggtagcg taataaatag cctcttaatt ggaggccagt 6600
gaatggcaag actaggaaca cctttacctt ttatatcaaa aaaacttttc atctaagtga 6660
aaagacttag ataatatagg aagacgaaaa gaccccgcgg aactttactc tttattatac 6720
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ttccgattat cttaataaca tatcaaaaat ttggtataga caaaacagaa gttaccccgg 6840
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aaataccaga aaatagttta acaaaaacaa aaactttggg agttttaaat ttaggcactc 7320
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attctctcta tgacctccca gccccaacca atttatccac ttgatgaaat tttgggtctc 7440
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catcaagagt agaccttgct ttctactcag tttcacatat ttcacgagac gtaaattttg 7560
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taggaaaaac tctagtttac tgactgtgag ggggtttctc agtctctaac gcaaccctta 7860
atcgattttt tgttctacac ttcgtactcc catttactat cgcagcactt gctgttatcc 7920
atttattatt ccttcacgaa aaaggatcta ataacccatt aggcatctcc tcaaacgcaa 7980
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tagggctact agcaagtatc tgcttcttct cgccaaacct attaacagac cccgaaaact 8100
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ttgcatacgc aatcttacga tcaatcccca acaagctggg gggagtcctt gcactagtcc 8220
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tcccacaaaa aatacttata caaactataa aaaagatata cctaccagca aaaaaatcat 8640
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caaccaagca gaaaacggaa tttgcgctct cttggttata gccccaacta ttaccaaaaa 9780
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taacatccca gcagctaaag acttcttatt ctgatagtaa ataaccaaag caaaagacac 9960
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ttccatgtag gaaatactaa acaacgacac tgacccagaa attaaacaaa caaaacaaca 10140
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