本發(fā)明涉及一種固定過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球制備方法，屬于固定化酶的雜化微球
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：明膠微球是一種常用的固定化酶載體，其優(yōu)點(diǎn)在于包埋條件溫和，生物相容性好，有利于維持酶的結(jié)構(gòu)完整性，進(jìn)而提高酶的活性維持率。明膠微球固定化酶通常存在的問(wèn)題是載體的孔徑較大，酶分子容易泄露。微球易溶脹，機(jī)械強(qiáng)度差，循環(huán)使用穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性不高。解決問(wèn)題的方法通常是在明膠微球中填充無(wú)機(jī)組分、或者在明膠微球外表面構(gòu)造無(wú)機(jī)殼層，制備有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化微球，以提高微球的機(jī)械性能，同時(shí)抑制酶分子的泄露，提高酶對(duì)溫度、pH變化的耐受性，同時(shí)提高儲(chǔ)存和循環(huán)使用穩(wěn)定性。二氧化硅是有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化材料中常見(jiàn)的無(wú)機(jī)組分，可用于制備雜化微球。MaterialsScienceandEngineeringC62(2016)678–685公布了一種制備明膠-二氧化硅雜化微球的方法，其過(guò)程包括：將明膠溶解于乙醇/水混合體系中，并加入交聯(lián)劑3-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，得到明膠溶液；將正硅酸乙酯、氯化鈣和磷酸三乙酯混合，得到硅前驅(qū)體溶液；將明膠溶液與硅前驅(qū)體溶液混合，并倒入植物油中進(jìn)行攪拌乳化，得到w/o型乳液；將乳液在-70℃下冷凍固化成型，并依次利用乙醇和丙酮進(jìn)行洗滌，得到明膠-二氧化硅雜化微球。此法所得的雜化微球的中位粒徑D50值在124-276微米范圍內(nèi)。仿生硅化為二氧化硅材料的制備提供了一條新途徑，仿生硅化避免了酸堿催化的使用，制備簡(jiǎn)單，所用原料均具有很好的生物相容性，適用范圍廣。ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces35(2004)53–58公布了一種制備明膠-二氧化硅雜化微球的方法，其過(guò)程包括：將明膠固體溶解于pH5.0的去離子水中，得到明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5-30%的明膠溶液；將硅酸鈉固體溶解于去離子水中，得到硅酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-1.0%的硅酸鈉溶液；在37℃下將明膠溶液與硅酸鈉溶液混合，攪拌1小時(shí)，在20℃水浴中靜置一天，得到明膠-二氧化硅雜化微球。此法所得的雜化微球粒徑在50-350納米范圍內(nèi)。利用明膠仿生硅化過(guò)程制備明膠-二氧化硅雜化載體用于固定化酶具有良好的應(yīng)用前景。發(fā)明專利CN201310425486.9公開(kāi)了一種包埋醇脫氫酶的明膠-二氧化硅雜化凝膠及制備方法。該包埋醇脫氫酶的明膠-氧化硅雜化凝膠，粒徑為3-4mm，在明膠核上包覆有氧化硅殼層。其制備方法過(guò)程包括：配制明膠及含有醇脫氫酶混合溶液；配制硅酸鈉及戊二醛溶液前驅(qū)體混合溶液；將明膠及醇脫氫酶的混合溶液逐滴加入到0~4℃的去離子水中，生成包埋醇脫氫酶明膠凝膠顆粒，再經(jīng)攪拌孵化得到包埋醇脫氫酶的明膠-二氧化硅雜化凝膠。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于通過(guò)將仿生礦化過(guò)程與膜乳化過(guò)程結(jié)合，提供一種以微孔膜滲透乳化制備固定過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球的方法。以該方法所制得的明膠-二氧化硅雜化微球粒度均一、大小可控，用于固定過(guò)氧化氫酶，過(guò)氧化氫酶的泄漏率低，且耐酸堿環(huán)境能力強(qiáng)，儲(chǔ)存穩(wěn)定性好。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，一種固定過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球的方法，該方法采用包括微孔膜組件的裝置，以微孔膜滲透乳化過(guò)程為主加以實(shí)現(xiàn)的，其特征在于包括以下步驟：1）在容器中，于溫度為40℃-70℃及攪拌下將固體明膠溶解于去離子水中，配制成濃度為0.05-0.5克/毫升的明膠溶液，再向其中加入溶解過(guò)氧化氫酶，使過(guò)氧化氫酶濃度保持為0.1-2毫克/升，制得水相明膠/過(guò)氧化氫酶溶液；2）在容器中，于溫度為40℃-70℃及攪拌下將油溶性乳化劑司班-80加入到液體石蠟中，配制成含有司班-80質(zhì)量濃度為0.25-4.0%的液體石蠟油，稱為油相；3）按步驟1）制的水相明膠/過(guò)氧化氫酶溶液與步驟2）制的油相液體石蠟油的體積比為1:（2~15），在溫度40℃-70℃及200-1200rpm速度下攪拌下，將水相明膠/過(guò)氧化氫酶溶液加入油相中，得到粗乳液；4）將步驟3）制的粗乳液加入裝配有膜孔徑為3.5-10.2微米的微孔膜的膜乳化裝置內(nèi)，以20kPa-50kPa壓力使粗乳液通過(guò)微孔膜腔,進(jìn)入收集器后，再回加入膜乳化器中，如此循環(huán)2-10次，得到多級(jí)乳化的W/O型乳液；5）以正硅酸乙酯與去離子水按摩爾比為1:（0.05-0.4）混合，并向該混合中，按催化劑鹽酸與正硅酸乙酯摩爾比為（0.005-0.02）:1加入鹽酸，然后在室溫下超聲振蕩直至得到澄清透明的溶液，再用去離子水稀釋溶液至濃度20-150mM，并且用NaOH將稀釋溶液的pH值調(diào)至6.0-8.0，得到正硅酸乙酯水解液；6）在400rpm速度攪拌下，以步驟5）制得的正硅酸乙酯水解液與步驟4）制得的多級(jí)乳化W/O型乳液按體積比為1:（1.0-4.0），將多級(jí)乳化W/O型乳液加入正硅酸乙酯水解液中，加畢后在溫度0℃-8℃冰水浴中，交聯(lián)固化0.5-4小時(shí)后，再分別用異丙醇和丙酮進(jìn)行洗滌至去除油相為止，然后在空氣中自然干燥得到用于固定化酶的明膠-二氧化硅雜化微球。本發(fā)明提出的制備方法的優(yōu)點(diǎn)在于：制備條件溫和，制備工藝簡(jiǎn)單易行，明膠微球粒度均一，二氧化硅含量及殼層厚度可控，并且所得明膠-二氧化硅雜化微球?qū)^(guò)氧化氫酶具有很好的固定能力，固定化過(guò)氧化氫酶的對(duì)酸堿耐受性能強(qiáng)，儲(chǔ)存穩(wěn)定性好。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1制得的明膠微球的掃描電鏡（SEM）照片。圖2為對(duì)比例1制備的明膠微球的掃描電鏡（SEM）照片。圖3為實(shí)施例1制備的明膠-二氧化硅雜化微球與對(duì)比例1制備的明膠微球的熱重分析曲線圖。具體實(shí)施方式為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是為了幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。實(shí)施例1膜乳化法制備固定化過(guò)氧化氫酶的明膠二氧化硅雜化微球：向200轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌、55℃的2毫升水中加入0.2克明膠干粉，維持此速度下磁力攪拌0.5小時(shí)，至明膠干粉完全溶解于水中，溶解后明膠濃度為0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明膠溶液中加入過(guò)氧化氫酶0.2毫克，溶解后過(guò)氧化氫酶濃度為0.1毫克/毫升。以上述過(guò)氧化氫酶/明膠水溶液作為水相。將油溶性乳化劑0.3g司班-80加入到12毫升的液體石蠟中，以200轉(zhuǎn)/分鐘速度磁力攪拌30分鐘，至司班-80完全溶解，并將上述溶液加熱至60℃作為油相。將3毫升正硅酸乙酯與0.7毫升去離子水混合。加入0.2毫升0.1摩爾/升的鹽酸為催化劑，然后用超聲波清洗器在室溫下超聲直至得到澄清透明的溶液，然后用去離子水將上述溶液稀釋至50mM，并且用0.5摩爾/升的NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0，從而得到正硅酸乙酯水解液。預(yù)乳化過(guò)程：按水相明膠/過(guò)氧化氫酶溶液與油相液體石蠟油的體積比為1:6，在溫度550℃下，將水相明膠/過(guò)氧化氫酶溶液加入油相中，1600rpm速度下磁力攪拌得到粗乳液。膜乳化過(guò)程：采用管狀ShirasuPorousGlass微孔膜（SPG微孔膜）。膜管直徑為1厘米，長(zhǎng)度為2厘米，膜孔徑為3.5微米。使用前需要預(yù)先將微孔膜浸潤(rùn)于在預(yù)熱至55℃的液體石蠟中30分鐘，然后將微孔膜裝入膜乳化裝置中，膜乳化裝置結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖1?？焖賹⑸鲜鲋苽浜玫拇秩橐杭尤肽と榛b置，通入氮?dú)?，?0kPa壓力下使粗乳液通過(guò)微孔膜進(jìn)入收集容器。將收集容器中過(guò)膜一次的乳液再次加入膜乳化器中，在50kPa壓力下使粗乳液通過(guò)微孔膜進(jìn)入收集容器。重復(fù)上述過(guò)程，直至過(guò)膜三次，得到多級(jí)乳化的W/O型乳液。仿生礦化過(guò)程：將多級(jí)乳化的W/O型乳液，逐滴加入到18mL、濃度為50mM的正硅酸乙酯水解液中，期間保持磁力攪拌速度為400轉(zhuǎn)/分鐘，全部滴加完后，迅速置于4℃冰水浴中，交聯(lián)固化2小時(shí)。結(jié)束后，分別用異丙醇和丙酮進(jìn)行洗滌至油相組分完全去除，然后在空氣中自然干燥得到固定化酶的明膠微球。微球的平均粒徑采用激光粒度儀進(jìn)行測(cè)量，二氧化硅含量采用熱重分析儀進(jìn)行測(cè)量，二氧化硅殼層厚度采用透射電鏡進(jìn)行分析。明膠-二氧化硅雜化微球粒徑、分布、二氧化硅含量見(jiàn)表1。對(duì)上述過(guò)程制得的明膠-二氧化硅雜化微球固定過(guò)氧化氫酶在不同pH下的相對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定：將30％過(guò)氧化氫溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，配成過(guò)氧化氫濃度為0.09mol/L的底物溶液，加入對(duì)本對(duì)比例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球，在25℃，攪拌的條件下進(jìn)行催化過(guò)氧化氫分解反應(yīng)，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)確定過(guò)氧化氫的消耗量，計(jì)算得到固定化過(guò)氧化氫酶的酶活力，并以最高酶活力對(duì)應(yīng)的pH值為最適pH值，將最適pH值下相對(duì)酶活力定義為100％。將其他pH值下的酶活力與最適pH值下的酶活力對(duì)比，得到最適pH值為6.0，pH6.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為100%。與最適pH值條件下相比，pH3.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為60.6%；pH4.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為64.6%；pH5.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為67.7%；pH7.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為70.2%；pH8.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為76.7%；pH9.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為79.4%；pH10.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為55.9%。對(duì)上述過(guò)程制得的明膠-二氧化硅雜化微球固定過(guò)氧化氫酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定：將30％過(guò)氧化氫溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，配成過(guò)氧化氫濃度為0.09mol/L的底物溶液，加入本實(shí)施例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球，在25℃，攪拌的條件下進(jìn)行催化過(guò)氧化氫分解反應(yīng)，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)確定過(guò)氧化氫的消耗量，計(jì)算得到固定化過(guò)氧化氫酶的酶活力，并以此酶活力為初始相對(duì)酶活力，定義為100％。將本實(shí)施例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球存放一天后，重復(fù)上述反應(yīng)過(guò)程，得到固定化過(guò)過(guò)氧化氫酶的酶活力，與初始活力相比，此時(shí)的相對(duì)酶活力為95.4％。將本實(shí)施例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球存放存放三天，六天，十天，十五天，二十一天，二十八天后重復(fù)上述反應(yīng)過(guò)程，得到儲(chǔ)存三天的固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為89.7％；儲(chǔ)存六天的固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為87.0％；儲(chǔ)存十天的固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為68.8％；儲(chǔ)存十五天的固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為56.8％；儲(chǔ)存二十一天的固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為51.7％。實(shí)施例2本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：將采用的膜孔徑為3.5微米的微孔膜改用膜孔徑為10.2微米的微孔膜，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。實(shí)施例3本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：在制備過(guò)程中的溫度由55℃改為40℃，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。實(shí)施例4本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：在制備過(guò)程中的溫度由55℃改為70℃，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。實(shí)施例5本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：在膜乳化過(guò)程中將采用的50kPa的操作壓力改變?yōu)?0kPa的操作壓力，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。實(shí)施例6本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：在仿生礦化過(guò)程中將正硅酸乙酯水解液的濃度由50mM改變?yōu)?0mM，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。實(shí)施例7本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：在仿生礦化過(guò)程中將正硅酸乙酯水解液的濃度由50mM改變?yōu)?0mM，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。實(shí)施例8本實(shí)施例制備過(guò)程與實(shí)施例1相同，不同之處在于：在仿生礦化過(guò)程中將正硅酸乙酯水解液的濃度由50mM改變?yōu)?50mM，制得明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小、分布及二氧化硅含量見(jiàn)表1。對(duì)比例1按照中國(guó)發(fā)明專利CN201510209087.8中實(shí)施例1所述方法，通過(guò)膜乳化法制備固定化過(guò)氧化氫酶的明膠微球：向200轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌、55℃的10毫升水中加入1克明膠干粉，維持此速度下磁力攪拌0.5小時(shí)，至明膠干粉完全溶解于水中，溶解后明膠濃度為0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明膠溶液中加入過(guò)氧化氫酶1毫克，溶解后過(guò)氧化氫酶濃度為0.1毫克/毫升。以上述過(guò)氧化氫酶/明膠水溶液作為水相。將油溶性乳化劑1.5g司班-80加入到60毫升的液體石蠟中，以200轉(zhuǎn)/分鐘速度磁力攪拌30分鐘，至司班-80完全溶解，并將上述溶液加熱至60℃作為油相。膜乳化過(guò)程：采用管狀ShirasuPorousGlass微孔膜（SPG微孔膜）。膜管直徑為1厘米，長(zhǎng)度為2厘米，膜孔徑為3.5微米。使用前需要預(yù)先將微孔膜浸潤(rùn)于在預(yù)熱至60℃的液體石蠟中30分鐘，然后將微孔膜裝入膜乳化裝置中，膜乳化裝置結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖1。快速將上述制備好的水相明膠/過(guò)氧化氫酶溶液加入膜乳化裝置，通入氮?dú)?，?kPa壓力下使水相溶液通過(guò)微孔膜進(jìn)入磁力攪拌的60℃油相中，得到液滴均勻的W/O型乳液，攪拌速度為400轉(zhuǎn)/分鐘。將所得乳液繼續(xù)在400轉(zhuǎn)/分鐘下磁力攪拌15分鐘后，迅速置于4℃冰水浴中，加入交聯(lián)劑戊二醛1mL，交聯(lián)固化2小時(shí)。結(jié)束后，分別用異丙醇和丙酮進(jìn)行洗滌至油相組分完全去除，然后在空氣中自然干燥得到固定化酶的明膠微球。對(duì)上述過(guò)程制得的明膠微球固定過(guò)氧化氫酶在不同pH下的相對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定：將30％過(guò)氧化氫溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，配成過(guò)氧化氫濃度為0.09mol/L的底物溶液，加入對(duì)本對(duì)比例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球，在25℃，攪拌的條件下進(jìn)行催化過(guò)氧化氫分解反應(yīng)，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)確定過(guò)氧化氫的消耗量，計(jì)算得到固定化過(guò)氧化氫酶的酶活力，并以最高酶活力對(duì)應(yīng)的pH值為最適pH值，將最適pH值下相對(duì)酶活力定義為100％。將其他pH值下的酶活力與最適pH值下的酶活力對(duì)比，得到最適pH值為7.0，pH7.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為100%。與最適pH值條件下相比，pH4.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為12.3%；pH5.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為67.7%；pH6.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為95.8%；pH8.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為90.8%；pH9.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為26.1%；pH10.0時(shí)明膠微球固定化過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為0。將30％過(guò)氧化氫溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液稀釋，配成過(guò)氧化氫濃度為0.09mol/L的底物溶液，加入本實(shí)施例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠-二氧化硅雜化微球，在25℃，攪拌的條件下進(jìn)行催化過(guò)氧化氫分解反應(yīng)，用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)確定過(guò)氧化氫的消耗量，計(jì)算得到固定化過(guò)氧化氫酶的酶活力，并以此酶活力為初始相對(duì)酶活力，定義為100％。將本實(shí)施例制備的固定化過(guò)氧化氫酶的明膠微球存放一天后，重復(fù)上述反應(yīng)過(guò)程，得到固定化過(guò)過(guò)氧化氫酶的酶活力，與初始活力相比，此時(shí)的相對(duì)酶活力為85.3％。將新鮮的游離過(guò)氧化氫酶溶液存放三天，六天，十天，十五天，二十一天，二十八天后重復(fù)上述反應(yīng)過(guò)程，得到儲(chǔ)存三天的游離過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為69.0％；儲(chǔ)存六天的游離過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為40.5％；儲(chǔ)存十天的游離過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為24.3％；儲(chǔ)存十五天的游離過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力為3.5％；儲(chǔ)存二十一天及二十八天的游離過(guò)氧化氫酶的相對(duì)酶活力完全喪失，為0%。表1所示為實(shí)施例1-8測(cè)定的明膠-二氧化硅雜化微球粒徑大小及分布、二氧化硅含量的對(duì)比結(jié)果。示例微球粒徑D50（μm）SPAN值二氧化硅含量（%）實(shí)施例111.81.2746.5實(shí)施例221.31.2234.1實(shí)施例317.61.4129.9實(shí)施例410.21.3151.8實(shí)施例515.71.1235.6實(shí)施例632.51.5213.8實(shí)施例77.41.1859.3實(shí)施例81.91.0772.5當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3