本發(fā)明涉及一種β-欖香烯的制備，特別涉及一種溫郁金來源的倍半萜合酶、基因、載體、工程菌及其制備β-欖香烯的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

欖香烯(Elemene)是從姜科植物溫郁金中提取出來的具有抗癌作用的有效成分，是我國自主研發(fā)的一類新型倍半萜藥物。該藥在臨床運(yùn)用時(shí)，高效、副作用少；能夠改善微循環(huán)，有助于化療、放療藥物進(jìn)入癌組織發(fā)揮作用；具有選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖和提高免疫功能的雙重效應(yīng)；還可直接作用于細(xì)胞膜，使腫瘤細(xì)胞破裂死亡。目前欖香烯正被廣泛應(yīng)用于肺癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤的治療。雖然欖香烯系列抗腫瘤植物藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用正如火如荼，市場份額也在不斷擴(kuò)大，但是從天然植物溫郁金中提取分離欖香烯仍存在許多技術(shù)難點(diǎn)：第一，溫郁金植株僅塊根中含有欖香烯，且含量極低，約占千分之一到千分之二；同時(shí)欖香烯的含量易受品種，根莖質(zhì)量，種植環(huán)境等諸多因素影響。第二，揮發(fā)油中成分復(fù)雜，欖香烯與許多結(jié)構(gòu)相似的倍半萜類化合物混雜在一起，必須通過精密分餾、分子蒸餾或超臨界二氧化碳法進(jìn)行初分，再通過薄層色譜和柱層析，經(jīng)過多次分離才能得到純品，因此欖香烯的提取工藝要求高難度大。另外，化學(xué)合成欖香烯的工藝十分復(fù)雜，反應(yīng)步驟近10步，其中兩步反應(yīng)需在-78℃低溫條件進(jìn)行，且需要用到二氯甲烷、氰化鈉、甲苯等劇毒化合物，不利于環(huán)境保護(hù)；最終合成的產(chǎn)物為外消旋混合物，需要進(jìn)行拆分才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)率只有50％，因此化學(xué)合成路線經(jīng)濟(jì)性差，無法進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。這使得欖香烯原料藥的生產(chǎn)成本較高，對其市場推廣和全球化營銷起到一定的阻礙作用。

采用酶催化方法進(jìn)行β-欖香烯的生物合成具有一定的優(yōu)勢，例如反應(yīng)條件溫和、選擇性高、產(chǎn)物專一性高。而進(jìn)行酶催化的首要前體是優(yōu)質(zhì)的生物催化劑的獲得。倍半萜合酶能夠催化法尼基焦磷酸(FPP)生成功能結(jié)構(gòu)及活性多樣的倍半萜化合物，同時(shí)在催化過程中，其機(jī)制的多樣性將對所生成的倍半萜結(jié)構(gòu)的豐富性具有重要的影響。目前，已有多種萜類合酶如黃花蒿來源的β-法呢烯合酶等都陸續(xù)地被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，這也預(yù)示著越來越多的新型化合物被發(fā)掘。研究萜類合酶基因的克隆、表達(dá)，有助于發(fā)掘萜類化合物的合成機(jī)制，從而能夠進(jìn)一步的研究代謝調(diào)控以及蛋白工程的改造。因此，對溫郁金來源的倍半萜合酶研究具有重要的意義。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種溫郁金來源的倍半萜合酶、基因及其在催化FPP生成欖香烯中的應(yīng)用。該倍半萜合酶屬于萜類合成酶，最適反應(yīng)溫度為35℃，最適反應(yīng)pH為8.5，具有很好的催化底物FPP生成β-欖香烯的活性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種溫郁金來源的倍半萜合酶(即CwSQS)，所述酶氨基酸序列為SEQ.ID NO.2所示。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，上述結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)屬于萜類合成酶，能催化FPP生成一定量的欖香烯。不難想到的是，在不改變蛋白質(zhì)特性的情況，適當(dāng)改變氨基酸序列，仍具有本發(fā)明醇脫氫酶特性。比如，氨基酸序列SEQ ID NO.2的保守性變異多肽，或其活性片段、或其衍生物。

本發(fā)明提供一種溫郁金來源的倍半萜合酶編碼基因(即CwSQS基因)，所述編碼基因核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明提供一種含有所述溫郁金倍半萜合酶編碼基因的重組載體。

進(jìn)一步，所述重組載體按如下方法制備：將倍半萜合酶編碼基因與pET28a載體連接，獲得連接產(chǎn)物CwSQS-pET28a，即為含有溫郁金倍半萜合酶編碼基因的重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、180rpm下?lián)u床培養(yǎng)1h，離心取沉淀后涂布于含有50mg/mL卡那霉素的LB平板，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行PCR和提取重組質(zhì)粒，即獲得含有溫郁金倍半萜合酶編碼基因的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供一種含有所述溫郁金倍半萜合酶編碼基因或重組載體的重組基因工程菌。

本發(fā)明提供一種所述溫郁金倍半萜合酶編碼基因在制備重組倍半萜合酶中的應(yīng)用。具體所述的應(yīng)用為：將含有所述溫郁金倍半萜合酶編碼基因的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌在含50mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12h至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG濃度為0.2mM，25℃誘導(dǎo)表達(dá)15h，將誘導(dǎo)培養(yǎng)液分離純化，獲得含有重組倍半萜合酶基因的菌體細(xì)胞，采用鎳柱進(jìn)行親和層析分離獲得倍半萜合酶。

本發(fā)明提供一種所述溫郁金來源的倍半萜合酶在制備β-欖香烯中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：以含溫郁金來源的倍半萜合酶編碼基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體超聲破碎后的上清液經(jīng)純化的純酶為催化劑，以法尼基焦磷酸(FPP)為底物，在二硫蘇糖醇、MgCl₂和稀甘油(即1,2,3-丙三醇)的作用下，于pH為6.0-10.0的緩沖液中構(gòu)成反應(yīng)體系，在5-50℃(優(yōu)選20-40℃，更優(yōu)選35℃)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)液分離純化，獲得β-欖香烯。所述反應(yīng)體系中，催化劑的用量為0.1-1μg/mL，優(yōu)選0.642μg/mL，所述底物終濃度為1-5μg/mL，優(yōu)選2μg/mL，所述二硫蘇糖醇和MgCl₂的終濃度分別為0.1-2mM，優(yōu)選1mM和2-20mM，優(yōu)選10mM，1,2,3-丙三醇體積終濃度為5-20％，優(yōu)選10％。

進(jìn)一步，所述催化劑按如下方法制備：將含溫郁金來源的倍半萜合酶編碼基因工程菌(優(yōu)選E.Coil BL21codon plus/pET 28a/CwSQS)接種在含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)；再將培養(yǎng)液以體積濃度1％的接種量接種至含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，直到菌液OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入終濃度0.5mM的IPTG，28℃誘導(dǎo)16h后，離心收集濕菌體；將濕菌體用pH7.4磷酸緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞，離心取上清，用0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾，濾液用鎳柱親和層析，收集目標(biāo)組分，獲得純酶。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

本發(fā)明中的催化劑源自高產(chǎn)β-欖香烯的藥用植物溫郁金，體外活性證實(shí)，其可以催化底物FPP生成β-欖香烯，最終欖香烯的產(chǎn)量達(dá)到0.345μg，轉(zhuǎn)化率為34.5％。

(四)附圖說明

圖1 SDS-PAGE分析重組CwSQS工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果(M：marker；1，誘導(dǎo)前；2，誘導(dǎo)后；3，誘導(dǎo)后沉淀部分；4，誘導(dǎo)后上清部分；5，6：CwSQS純化后)。

圖2β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品(a)與CwSQS催化反應(yīng)產(chǎn)物(b)的GC-MS分析圖。

圖3反應(yīng)溫度對產(chǎn)物濃度影響虛線圖。

圖4 pH值對產(chǎn)物濃度影響虛線圖。

圖5反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)物濃度影響虛線圖。

圖6 GC分析CwSQS重組蛋白催化產(chǎn)物，β-欖香烯出峰時(shí)間為15.902min。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1

1、CwSQS基因全長的克隆

采用高通量測序技術(shù)，提取溫郁金塊根、嫩葉、芽和莖混合組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄后送上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，采用生物信息學(xué)BLAST分析方法，與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得一條可能的倍半萜合酶基因，根據(jù)該基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對引物(上游引物：5`-ATGCCCGCTGCTCTCGTCTC-3`；下游引物：5`-TCATTGAATAGGGCGGAAGA G-3`)，以cDNA為模板進(jìn)行高保真PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)參數(shù)為：首先95℃變性5min；其次，95℃變性30sec，63℃退火30sec，72℃衍生2min，30個(gè)循環(huán)；最后70℃延伸10min；待PCR反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物進(jìn)行回收并亞克隆，測序分析，成功獲得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因CwSQS，該基因編碼的酶CwSQS氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。

含目的基因的表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)CwSQS基因編碼序列(SEQ ID NO.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(上游為NdeI，下游為XhoI)，具體地說，上游引物為：5`-CATATGATGCCCGCTGCTCTCGTCTC-3`，下游引物為：5`-CTCGAGATTGAATAGGGCGGAAGAG-3`。PCR反應(yīng)參數(shù)為：首先95℃變性5min；其次，95℃變性30sec，63℃退火30sec，72℃衍生2min，30個(gè)循環(huán)；最后70℃延伸10min。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將CwSQS克隆至中間載體(如pET28a)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入E.Coil BL21codon plus中，獲得工程菌E.Coil BL21codon plus/pET 28a/CwSQS。

2、CwSQS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化。將第1步中獲得的工程菌E.Coil BL21codon plus/pET 28a/CwSQS在含100mL50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。將10ml過夜培養(yǎng)后的菌液倒入1L含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，直到菌液OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入IPTG終濃度為0.5mM，28℃誘導(dǎo)16h后，離心收集菌體，5g濕菌體用25ml、pH7.4磷酸緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞。離心取上清，用0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾，根據(jù)產(chǎn)品說明書，將濾液進(jìn)行鎳柱(Qiagen，德國)親和層析純化獲得CwSQS重組酶液，電泳圖見圖1所示。重組CwSQS純酶在SDS-PAGE上條帶顯示約為69kDa，與預(yù)期的蛋白分子量68.7kDa相吻合，且以上清形式存在。采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度分析，純化后的CwSQS酶液濃度達(dá)到64.2mg/L(圖1)。

實(shí)施例2重組酶CwSQS的催化性質(zhì)分析

1、反應(yīng)溫度

以實(shí)施例1方法制備的CwSQS重組酶液(濃度為64.2mg/L，體積為10μL)為催化劑，加入pH7.0Tris-HCL緩沖液、2μg FPP、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT2μL、100μL稀甘油(1,2,3-丙三醇)構(gòu)成反應(yīng)體系1ml，分別在5℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下攪拌充分反應(yīng)60min，同時(shí)采用頂空-固相微萃取技術(shù)吸附反應(yīng)產(chǎn)物，待反應(yīng)結(jié)束后(60min反應(yīng)時(shí)間)，將萃取頭取出注入氣相色譜儀，對產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。以β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品為對照，通過分析色譜峰面積的大小來判斷該實(shí)驗(yàn)所研究的倍半萜酶的催化性質(zhì)。色譜條件：選用GC-2010島津氣相色譜儀；色譜柱為HP-5；載氣：N₂，吹掃流量為3mL/min，無分流；柱箱起始溫度40℃，保留2分鐘，然后以7℃/min的速度升溫至220℃，保留5分鐘；進(jìn)樣口溫度為250℃；檢測器溫度為250℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法為：吸取一定量的β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行精密稱重，加入乙酸乙酯，配置成母液濃度375.2μg/mL；取一定量的β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品母液，加入一定量的乙酸乙酯，進(jìn)行4，50,100,200,500倍逐級稀釋，配置成186.25、14.9、7.45、3.725、1.863μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度；分別吸取1μL，按上述方法進(jìn)行色譜分析，峰面積分別為6654519、884323、60439、28991、14002、11295。根據(jù)β-欖香烯標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(C)和峰面積(S)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線：S＝18032C+294.25，R²＝0.99939。

結(jié)果表明：根據(jù)β-欖香烯和反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS分析圖譜，確定反應(yīng)產(chǎn)物是β-欖香烯，即獲得的重組酶CwSQS是一種專一性生成β-欖香烯的倍半萜合酶(圖2)。

當(dāng)溫度在25℃-35℃的范圍內(nèi)，生成產(chǎn)物的相對濃度隨溫度的升高而增加，而當(dāng)溫度高于35℃時(shí)，產(chǎn)物濃度又隨溫度的升高而下降，因而該反應(yīng)的最佳溫度為35℃。此時(shí)產(chǎn)物生成量最高(圖3)。

2、pH值

以實(shí)施例1方法制備的CwSQS重組酶液(濃度為64.2mg/L，體積為10μL)為催化劑，分別加入pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCL緩沖液、2μg FPP、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油構(gòu)成反應(yīng)體系1ml，分別在30℃下攪拌反應(yīng)60min，其它操作同步驟1。

pH在6.0-7.5時(shí)相對濃度隨pH的增加緩慢上升，而當(dāng)pH上升至8時(shí)，產(chǎn)物的相對濃度急劇增加，總體在pH在6.0-8.5范圍內(nèi)呈上升趨勢，當(dāng)pH繼續(xù)上升時(shí)，此時(shí)相對濃度開始緩慢下降，因此該反應(yīng)的最佳pH為8.5(圖4)。

3、反應(yīng)時(shí)間

以實(shí)施例1方法制備的CwSQS重組酶液(濃度為64.2mg/L，體積為10μL)為催化劑，分別加入pH8.5的Tris-HCL緩沖液、2μg FPP、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油構(gòu)成反應(yīng)體系1ml，分別在35℃下攪拌反應(yīng)15min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min，其它操作同步驟1。

CwCQS重組蛋白催化反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間為120min，在15-120min內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，反應(yīng)產(chǎn)物的濃度也增加，而120min之后，反應(yīng)產(chǎn)物的濃度開始下降，該反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間為120min(圖5)。

經(jīng)過上述條件探索后，在最佳的條件下(pH＝8.5、反應(yīng)時(shí)間＝120min、溫度＝35℃)，使底物與酶進(jìn)行反應(yīng)，最后用GC檢測其產(chǎn)物的峰面積，按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，經(jīng)計(jì)算，得到最佳產(chǎn)量為0.345μg，轉(zhuǎn)化率為34.5％(圖6)。