本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，是一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達(dá)生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

肝素是動(dòng)物體內(nèi)一種天然抗凝血物質(zhì)，一直被用做抗凝血的主要藥物，并且研究表明除了抗凝血活性及其相關(guān)的抗血栓形成活性以外，肝素還具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤和抗病毒等生物學(xué)功能。雖然肝素現(xiàn)仍用于臨床治療，但是其帶來(lái)的副作用也越來(lái)越明顯，例如肝素的長(zhǎng)期使用容易引起大量出血，誘導(dǎo)血小板減少及血栓形成，影響血小板穩(wěn)定及過(guò)敏反應(yīng)等癥狀。而低分子量肝素以其注射吸收好、半衰期長(zhǎng)、生物利用度高、出血副作用少等優(yōu)點(diǎn)在臨床上的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。截至目前為止，低分子量肝素已經(jīng)逐步取代肝素成為了首選的治療藥物。

低分子量肝素的生產(chǎn)可以分為化學(xué)降解法和酶解法。酶解法相對(duì)于化學(xué)降解法而言具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如作用條件溫和，酶的專一性高，環(huán)境相對(duì)友好等，是較理想的工業(yè)生產(chǎn)低分子肝素的方法。但是利用酶解法生產(chǎn)低分子量肝素的缺點(diǎn)在于肝素酶(HepI)的來(lái)源有限，其野生菌產(chǎn)量很低并且需要價(jià)格昂貴的肝素進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高。另一方面也是由于HepI的重組表達(dá)極易形成無(wú)活性的包涵體，并且不容易復(fù)性。

我國(guó)是肝素原料的出口大國(guó)，但一直未能對(duì)低分子量肝素生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。目前低分子量肝素主要來(lái)自合資企業(yè)生產(chǎn)或者由國(guó)外進(jìn)口，因此，利用酶解法生產(chǎn)低分子量肝素的研究應(yīng)用前景極為廣泛。而HepI作為低分子量肝素酶法生產(chǎn)的原材料，其高效生產(chǎn)技術(shù)的研究則受到廣泛關(guān)注。

本研究采用融合表達(dá)HepI的形式來(lái)克服其容易形成包涵體的難題，同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)分析，對(duì)采取定點(diǎn)突變策略提高其酶活性，以達(dá)到其高效生產(chǎn)和利用的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服當(dāng)前肝素酶活性低的而缺點(diǎn)，提供一種高活性HepI及其高效可溶性基因工程表達(dá)方法，本發(fā)明獲得的工程菌可以可溶性表達(dá)高活性HepI，因此不但降低了包涵體在變復(fù)性過(guò)程中的酶活損失、縮短了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本，便于更好的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)HepI，更能高效地用于低分子量肝素的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達(dá)生產(chǎn)方法，其特征在于：改造獲得一種具有高活性的HepI突變體Hep¹⁶⁹，然后利用分子生物學(xué)技術(shù)建立了它的高效可溶性基因工程表達(dá)體系。

(1)依照HepI的空間結(jié)構(gòu)分析，改造獲得一種比酶活較野生型提高48％的高活性肝素酶Hep¹⁶⁹；

(2)針對(duì)宿主密碼子偏愛性，對(duì)Hep¹⁶⁹的編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，以大腸桿菌為例，其優(yōu)化后的序列如附錄序列表所示；

(3)為實(shí)現(xiàn)高效可溶性基因工程表達(dá)，將Hep¹⁶⁹與可促進(jìn)二硫鍵形成、空間折疊的融合標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，這些融合標(biāo)簽包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等

(4)為了確保融合標(biāo)簽不影響Hep¹⁶⁹的空間結(jié)構(gòu)及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G₄S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等。

(5)為了在后續(xù)純化中切去融合標(biāo)簽，在融合標(biāo)簽與Hep¹⁶⁹間引入了蛋白酶切割位點(diǎn)，可用的蛋白酶包括腸激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；

(6)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等。

(7)重組表達(dá)產(chǎn)物Hep¹⁶⁹可高效裂解肝素生成低分子量肝素。

本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是：

1、本發(fā)明的方法改造獲得了一種酶活顯著提高的HepI突變體Hep¹⁶⁹，該突變體可明顯提高低分子肝素的酶解制備效率、并降低成本。

2、成功實(shí)現(xiàn)了HepI¹⁶⁹的高效基因工程表達(dá)，避免了包涵體變復(fù)性過(guò)程中對(duì)酶活造成的損失、縮短了HepI的生產(chǎn)工藝流程，降低了生產(chǎn)成本。

3、本發(fā)明的重組Hep¹⁶⁹具有可溶性好，活性高等優(yōu)點(diǎn)，可以極大地發(fā)揮其在工業(yè)上高效生產(chǎn)低分子量肝素的目的。

附圖說(shuō)明(以SUMO融合的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒為例)

圖1為本發(fā)明重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證圖，泳道1是以pESUMO為模板做的PCR結(jié)果，作為陰性對(duì)照，泳道2是G₄S柔性linker-腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)-HepI的PCR結(jié)果，作為陽(yáng)性對(duì)照，泳道3是以構(gòu)建的重組質(zhì)粒pESUMO-HepI為模板做的PCR結(jié)果。

圖2為HepI重組大腸桿菌的質(zhì)粒提取驗(yàn)證圖，泳道1是轉(zhuǎn)入PESUMO空質(zhì)粒的大腸桿菌；泳道2是轉(zhuǎn)入pESUMO-HepI重組質(zhì)粒的大腸桿菌，泳道3是轉(zhuǎn)入突變質(zhì)粒pESUMO-HepI¹⁶⁹的大腸桿菌。

圖3為pESUMO-HepI¹⁶⁹的突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。

圖4為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)檢測(cè)肝素酶的表達(dá)，泳道1是以導(dǎo)入空載質(zhì)粒的大腸桿菌做陰性對(duì)照，泳道2是未經(jīng)突變的HepI，泳道3是突變的Hep¹⁶⁹。

圖5為HepI¹⁶⁹的酶活檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達(dá)生產(chǎn)方法。具體內(nèi)容包括：

(1)依照HepI的空間結(jié)構(gòu)分析，改造獲得一種比酶活較野生型提高48％的高活性肝素酶Hep¹⁶⁹；

(2)Hep¹⁶⁹表達(dá)載體的構(gòu)建：為實(shí)現(xiàn)高效可溶性基因工程表達(dá)，將Hep¹⁶⁹與可促進(jìn)二硫鍵形成、空間折疊的融合標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，這些融合標(biāo)簽包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等；為了確保融合標(biāo)簽不影響Hep¹⁶⁹的空間結(jié)構(gòu)及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G₄S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等；為了在后續(xù)純化中切去融合標(biāo)簽，在融合標(biāo)簽與Hep¹⁶⁹間引入了蛋白酶切割位點(diǎn)，可用的蛋白酶包括腸激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；

(3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等。

(4)重組表達(dá)產(chǎn)物Hep¹⁶⁹的活性分析。

結(jié)果顯示：本發(fā)明所獲得HepI突變體Hep¹⁶⁹具有顯著高于野生型HepI的酶活，所建立的基因工程表達(dá)體系可實(shí)現(xiàn)Hep¹⁶⁹的高效可溶性表達(dá)。本發(fā)明方法不僅為HepI的生產(chǎn)提供了一種新發(fā)方法，而且所獲得的高活性HepI-169可以更高效的用于低分子量肝素的工業(yè)化生產(chǎn)，這在醫(yī)藥工業(yè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

一、高活性HepI的重組工程菌構(gòu)建方法(以SUMO融合的大腸桿菌表達(dá)體系為例)，步驟如下：

1、構(gòu)建N端引入G₄S柔性linker-腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)序列的HepI基因

以下表中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

，以肝素黃桿菌基因組DNA為模板，用P3、P4引物通過(guò)PCR擴(kuò)增后獲得HepI基因序列，再以引物P1、P2(引入BsaI和BamHI酶切位點(diǎn)，下劃線部分)再次擴(kuò)增獲得G₄S柔性linker-腸激酶切割位點(diǎn)(DDDDK)-HepI，然后酶切、純化、連接到pESUMO質(zhì)粒中，得到pESUMO-HepI質(zhì)粒。

具體體系及擴(kuò)增條件如下：

擴(kuò)增HepI的PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：

2、HepI¹⁶⁹重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將pESUMO-HepI質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)12h后挑取單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有1134bp HepI目的片段的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，命名為PESUMO-HepI，然后以pESUMO-HepI為模板進(jìn)行169位氨基酸的定點(diǎn)突變，突變產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)12h后挑取單克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，命名為pESUMO-Hep¹⁶⁹(見圖2)。

構(gòu)建質(zhì)粒所需連接體系

3、將HepI¹⁶⁹重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到基因工程菌株。

⑴將-80℃保存的大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍(切勿開蓋，解凍時(shí)間大概為2min)。

⑵設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，在無(wú)菌條件下，第一組加1μL重組融合質(zhì)粒到感受態(tài)中，第二組加1μL重組融合突變質(zhì)粒，第三組加1μL空載質(zhì)粒，第四組做空白對(duì)照，不加任何質(zhì)粒，加完之后冰浴30min。(重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒均含有卡那霉素抗性，大腸桿菌Rosetta(DE3)含氯霉素抗性)

⑶提前準(zhǔn)備42℃的水，完成30min冰浴后熱擊90s。

⑷熱擊之后迅速進(jìn)行冰浴，時(shí)間為2-5min，讓細(xì)胞開口完全閉合，防止質(zhì)粒漏出；

⑸在無(wú)菌條件下向含有感受態(tài)的EP管中加入900μL LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.4；

⑹在培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞期間，制備4個(gè)無(wú)菌的LB固體培養(yǎng)基，均添加0.1‰卡那霉素和氯霉素；

⑺在無(wú)菌條件下，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物取出，8000rpm，離心2min，吸除850μL上清，剩余的培養(yǎng)液用移液槍輕輕吹懸，混勻；

⑻在無(wú)菌條件下進(jìn)行涂板，用移液槍將上一步混懸的液體轉(zhuǎn)移到LB固體培養(yǎng)基中，涂勻，正置20min；

⑼在已涂好的LB培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)12-18h，對(duì)所長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取、酶切及測(cè)序驗(yàn)證篩選。

二、HepI¹⁶⁹在重組大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)

1、將兩種重組工程菌及轉(zhuǎn)化pESUMO空質(zhì)粒的大腸桿菌分別接種到5mL含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。

2、將過(guò)夜培養(yǎng)菌液按2％接種量于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶)，37℃，200r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG，在37℃，200r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)10h，誘導(dǎo)完測(cè)定各菌體的OD600。

(3)4℃10000r/min離心10min收集菌體，用PBS洗滌菌體三遍。

(4)超聲破碎菌體。

(5)破碎后樣品處理：破碎后取兩管40μL樣品，其中一管直接加入10μL 5×SDS上樣緩沖液，標(biāo)記為全菌體；另一管12000r/min離心10min，上清轉(zhuǎn)移至新EP管，加入10μL 5×SDS上樣緩沖液，標(biāo)記為上清液；沉淀用40μL PBS重懸，再加入10μL 5×SDS上樣緩沖液，標(biāo)記為沉淀。

(6)樣品煮沸10min后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HepI¹⁶⁹在重組大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，利用Odyssey成像，圖片經(jīng)quantity one軟件分析各樣品上清中目的蛋白的百分含量。

三、HepI¹⁶⁹的酶活測(cè)定

酶活測(cè)定方法：232nm光吸收法，此法測(cè)定的1個(gè)國(guó)際單位(IU)是指在30℃，pH值為7.3的條件下能產(chǎn)生1μmol 4，5-不飽和糖醛酸的效力。

本實(shí)驗(yàn)采用Sigma公司測(cè)定此類酶活性的方法來(lái)進(jìn)行測(cè)定，其過(guò)程如下：取兩只試管，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組A和對(duì)照組B，都加入375μL反應(yīng)緩沖液和50μL肝素鈉溶液，在實(shí)驗(yàn)組A中加75μL肝素酶溶液，對(duì)照組B不加，將A和B置于30℃水浴鍋中反應(yīng)10min，然后都加2.5mL鹽酸溶液終止反應(yīng)，最后往對(duì)照組B中加75μL肝素酶溶液，將A和B體系都混合均勻，分別在232nm處測(cè)量吸光值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組表達(dá)所獲得未經(jīng)過(guò)突變的HepI和本發(fā)明構(gòu)建的高活性肝素酶突變體HepI¹⁶⁹都具有活性，且HepI¹⁶⁹的酶活較HepI有顯著提高。

序列表

(1)HepI¹⁶⁹氨基酸序列：

(2)HepI¹⁶⁹核苷酸序列(含G₄S linker及腸激酶切割位點(diǎn))

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大學(xué)

<120> 一種提高肝素酶I活性的工程菌株構(gòu)建方法

<130> 2016-10-25

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> PRT

<213> HepI169氨基酸序列

<400> 1

Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala

1 5 10 15

Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val

20 25 30

Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe

35 40 45

Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser

50 55 60

Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val

85 90 95

Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly

100 105 110

Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile

115 120 125

Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His

130 135 140

Gly Ala Pro Asp Arg Thr Leu Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys

145 150 155 160

Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe

165 170 175

Lys Lys Asn Ile Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly

180 185 190

Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln

195 200 205

Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr

210 215 220

Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg

225 230 235 240

Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser

245 250 255

Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe

260 265 270

Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys

275 280 285

Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val

290 295 300

Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val

305 310 315 320

Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr

325 330 335

Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr

340 345 350

Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg

355 360

<210> 2

<211> 1118

<212> DNA

<213> HepI169核苷酸序列:含G4S linker及腸激酶切割位點(diǎn)

<400> 2

ggtggcggtg gcagtgatga tgatgataaa cgcagaaaaa atccggtaac atcccgtacc 60

gtgttaacgt tcaggctgat tctgctaaac agaaagctat catcgataac aaatgggttg 120

ctgttggtat caacaaaccg tacgctttac agtatgatga taaactgcgc ttcaacggta 180

aaccgtccta ccgcttcgaa cttaaagctg aagataactc ccttgaaggt tacgctgctg 240

gtgaaactaa aggtcgtact gaattgtcct actcctacgc tactactaac gatttcaaaa 300

aattcccgcc gtccgtttac cagaacgctc agaaacttaa aactgtttac cattacggta 360

aaggtatctg tgaacagggt tcctcccgct cctacacttt ctccgtttac atcccgtcct 420

ccttcccgga taacgctact actatcttcg ctcagtggca cggtgctccg gatcgtactc 480

ttgttgctac tccggaaggt gaaatcaaaa ctctgtccat cgaagaattc ttggctttat 540

acgatcgcat gatcttcaaa aaaaacatcg ctcacgataa agttgaaaaa aaagataaag 600

atggtaaaat cacttacgtt gctggtaaac cgaacggttg gaaagttgaa cagggtggtt 660

acccgactct ggctttcggt ttctctaaag gttacttcta catcaaagct aactccgatc 720

gtcagtggct tactgataaa gctgatcgta acaacgctaa cccggaaaac tccgaagtta 780

tgaaaccgta ctcctccgaa tacaaaactt ccactatcgc ttacaaaatg ccgttcgctc 840

agttcccgaa agattgctgg atcactttcg atgttgctat cgattggact aaatacggta 900

aagaagctaa cactatcttg aaaccgggta aactggatgt tatgatgact tacactaaaa 960

acaaaaaacc gcagaaagct cacatcgtta accagcagga aatcctgatc ggtcgtaacg 1020

atgatgatgg ttactacttc aaattcggta tctaccgtgt tggtaactcc actgttccgg 1080

ttacttacaa cctgtctggc tattccgaaa ctgctcgt 1118