專利名稱:一種肝素靶酶的篩選方法及專用多功能微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及藥物篩選技術(shù),特別提供了一種肝素靶酶的篩選方法及專用多功能微流控芯片。
肝素的抗凝活性是因?yàn)楦嗡睾涂鼓附Y(jié)合,從而使抗凝血酶能更快速地和大多數(shù)參與抗凝過程的絲氨酸反應(yīng)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝素能和100多種蛋白質(zhì)結(jié)合,這種結(jié)合使蛋白質(zhì)在體內(nèi)的穩(wěn)定性增加,并能延長其在體內(nèi)的半衰期。所以研究肝素和蛋白質(zhì)的相互作用對藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用都有很重要的意義。
目前研究肝素和蛋白質(zhì)的相互作用主要有以下方法。
文獻(xiàn)1 Donald H.Atha,et al.Biochemistry,24,6723-6729(1985),平衡透析法,此方法是將肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(抗體)放入透析袋中,這種透析袋能透過肝素(或其他小分子),然后將此透析袋與一個已知體積且含有1/K(K結(jié)合常數(shù))濃度范圍的肝素溶液平衡,通過測定透析袋外溶液中肝素的濃度來確定K和n(N結(jié)合計量比)。此方法簡單,儀器設(shè)備也不復(fù)雜;并且如果分析物很穩(wěn)定,它們還可以回收再利用;此方法可做可靠的平衡測定。但是若分析物之間的結(jié)合程度較低,則所需樣品量很大;另外,該方法很費(fèi)時,一個簡單的實(shí)驗(yàn)需要幾天甚至幾周才能完成。
文獻(xiàn)2 UlfLindahl,et al.J.Biol.Chem.259,12368-12376(1984),親和色譜法,該方法是將蛋白質(zhì)固定在一個親和固定相如Sepharose、Affi-GelTM或其它的活性固定相上,然后注入含有肝素的緩沖液,通過分析洗脫曲線,測定結(jié)合常數(shù)。但該方法只能測定結(jié)合常數(shù)K;蛋白質(zhì)與基質(zhì)的鍵合穩(wěn)定,并且必須保持相當(dāng)活性;若結(jié)合常數(shù)大,則所需的肝素量大;分析所需的時間長,通常要幾個星期甚至幾個月。
文獻(xiàn)3 Ishan Capila,et al.FEBS Letters,446,327-330(1999),等溫滴定量熱法(ITC),是通過測定自由能的變化獲得有關(guān)結(jié)合的信息。此法是將含有肝素的溶液用滴定進(jìn)樣器加到量熱池中(量熱池中含一定濃度的蛋白質(zhì)溶液)。同時需做對照實(shí)驗(yàn)(將肝素加到不含蛋白質(zhì)的溶液中)。每次滴加1-3uL,共滴加25次左右,平衡時間約為200s,滴加間隔為300-500s,測定結(jié)合產(chǎn)生的熱量變化。該方法可測定分析物之間相互作用的所有的主要熱力學(xué)信息,也優(yōu)于平衡透析和親和色譜。但肝素和蛋白質(zhì)的用量大(>10mg),所以應(yīng)用不廣泛。
文獻(xiàn)4 Fuming Zhang,et al.Anal.Biochem.304,271-273(2002),表面離子共振生物傳感器(SPR),此方法一般是將肝素或肝素結(jié)合蛋白質(zhì)固定到生物傳感器的表面,而結(jié)合對象通過此表面,然后測定芯片表面折射率的改變。此方法是近年來用來做分子相互作用較多的方法,既可測定結(jié)合常數(shù),也可測定分解常數(shù);而且相對前幾種方法分析速度快。但此方法對分析物的要求是要有足夠大的分子量,以得到SPR表面基于相互作用而產(chǎn)生的變化;由于表面的非均一性,所以在高分析物濃度下,將使所得的結(jié)合常數(shù)和分解常數(shù)都大大減小;固定物要對表面有一定的保持力,又要保持原有的構(gòu)型、活性位點(diǎn)及生物活性是較難的;而且此方法是檢測折射率變化,靈敏度低。
文獻(xiàn)5 Niels H.H.Heegaard.J.Mol.Recog.11,141-148(1998),親和毛細(xì)管電泳(ACE),一種是將蛋白質(zhì)和肝素混合進(jìn)行區(qū)帶電泳,通過峰形或大小變化來確定二者是否有結(jié)合以及結(jié)合常數(shù)和結(jié)合計量比;一種是將蛋白質(zhì)單獨(dú)電泳,而將肝素加到運(yùn)行緩沖液中,通過蛋白質(zhì)遷移時間的變化確定結(jié)合常數(shù)。此法具有分離效率高、快速、樣品用量少以及可在接近生理條件下操作等優(yōu)點(diǎn),也是近年來做分子相互作用時采用較多的方法之一,但此方法的重復(fù)性不是很好,靈敏度也不是很高(紫外檢測)。
本發(fā)明提供了一種用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,其特征在于芯片由兩個單元構(gòu)成;第一個單元為一個十字交叉結(jié)構(gòu)的基本分離單元;第二個單元為多個并列的十字交叉結(jié)構(gòu)的基本分離單元;第一個單元分離通道的下游端與第二個單元每個基本分離單元分離通道的上游端十字相接。
本發(fā)明提供的用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片中,為了節(jié)約費(fèi)用以及便于控制,所述第二個單元的基本分離單元分離通道的下游端共同接一個檢測口。
本發(fā)明提供的用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,所述第二個單元的基本分離單元最好為2~100個。
基于上述多功能微流控芯片,本發(fā)明還提供了一種肝素靶酶的篩選方法,其特征在于過程如下將肝素溶液放在第一個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中,將待篩選的蛋白質(zhì)溶液放入第二個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中;對第一個單元的基本分離單元樣品通道和分離通道同時施加電壓,使蛋白質(zhì)分離;當(dāng)?shù)谝粋€單元的分離峰出現(xiàn)時,再依出峰時間分別對第二個單元中的基本分離單元逐個施加電壓,每一個分離峰對應(yīng)于一個分離單元,使肝素和蛋白質(zhì)混合并電泳分離,進(jìn)行檢測;比較每一個峰在混合前后的峰形或峰大小,如有變化,則表明肝素與該蛋白質(zhì)有相互作用。
在上述肝素靶酶的篩選方法中,放入第二個單元的蛋白質(zhì)可以為不同的種類,這樣可以同時篩選出很多種靶酶;也可以為同一種,這樣可以在分離的同時找出是哪一個肝素片段與該蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用。
同樣基于上述多功能微流控芯片,本發(fā)明還提供了另一種肝素靶酶的篩選方法,其特征在于過程如下
將蛋白質(zhì)混合物溶液放在第一個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中,將待篩選的肝素溶液放入第二個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中;對第一個單元的基本分離單元樣品通道和分離通道同時施加電壓,使蛋白質(zhì)分離;當(dāng)?shù)谝粋€單元的分離峰出現(xiàn)時,再依出峰時間分別對第二個單元中的基本分離單元逐個施加電壓,每一個分離峰對應(yīng)于一個分離單元,使蛋白質(zhì)和肝素混合并電泳分離,進(jìn)行檢測;比較每一個峰在混合前后的峰形或峰大小,如有變化,則表明該蛋白質(zhì)與該肝素有相互作用。
同樣在上述肝素靶酶的篩選方法中,放入第二個單元的肝素可以為不同的種類,這樣可以同時篩選出很多種肝素;也可以為同一種,這樣可以在分離的同時找出是哪一種蛋白質(zhì)與該肝素發(fā)生了相互作用。
本發(fā)明微流控芯片中所用的基本分離單元為最簡單也最常用的,帶有四個儲液池和十字型交叉通道的分離單元,短通道為樣品通道,長通道為分離通道,儲液池中放樣品的一端為樣品通道的進(jìn)樣端,樣品通道的另一端為廢液端,廢液端的儲液池裝有緩沖液,分離通道上下游端的儲液池中均裝有緩沖液。
微流控芯片技術(shù)是當(dāng)前研究的熱門和重點(diǎn),其主要以分析化學(xué)和生物化學(xué)為基礎(chǔ),利用微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS),在硅、玻璃、石英、塑料表面加工出10-100微米的微通道網(wǎng)絡(luò),主要以電滲流和電泳流為驅(qū)動力,通過改變驅(qū)動電壓,控制流體在微通道網(wǎng)絡(luò)中的流動方向和速率,從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的采樣、稀釋、加試劑、富集、萃取、混合、反應(yīng)、分離、檢測等步驟。但是到目前為止微流控芯片用于肝素靶酶篩選尚未見報導(dǎo),本發(fā)明創(chuàng)造性的設(shè)計了用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,可實(shí)現(xiàn)肝素-蛋白質(zhì)相互作用的在線檢測及多個靶酶的同時篩選,并可同時獲得樣品結(jié)構(gòu)方面的信息。本發(fā)明與平衡透析、親和色譜、等溫滴定量熱、表面離子共振等這些已經(jīng)用于肝素-蛋白質(zhì)相互作用的方法相比,具有快速、靈敏、高效分離,樣品用量少等優(yōu)勢,甚至比親和毛細(xì)管電泳的分離時間更短,所用樣品量更少,檢測更靈敏??傊景l(fā)明可在一塊小小的塑料或玻璃片上,在極短的時間內(nèi)完成肝素的高效分離分析、肝素-蛋白質(zhì)相互作用的在線檢測及多個靶酶的同時篩選,且具有很高的靈敏度和低的檢測限。
圖7為干擾素γ與肝素混合前、后的電泳譜圖。
如圖2所示,將肝素(抗原)放在儲液池1、2或3任何一個里,那么剩下的兩個儲液池一個做緩沖液池,一個做廢液池,而且兩個里都放入緩沖液。在儲液池4、7、10中放入緩沖液,在5和6、8和9、11和12每兩者中,選一個做樣品池放蛋白質(zhì),則相應(yīng)的另外一個做為廢液池放緩沖液。13和14做為廢液池放入緩沖液。分離時在1和13之間、2和3之間分別同時加電壓,進(jìn)行電泳分離。當(dāng)分離出第一個峰時,在4和14之間、5和6之間同時加電壓,使肝素和蛋白質(zhì)混合并電泳分離。同樣,當(dāng)?shù)?個峰出現(xiàn)時,再在7和10、8和9之間同時加電壓。依次類推,當(dāng)每一個峰出現(xiàn)時,就在相應(yīng)的子分離通道上加電壓,使肝素和蛋白質(zhì)混合并達(dá)分離,最后比較每一個峰在混合前后的峰形或峰大小有無變化,并以此做為判斷二者有無相互作用的依據(jù)。為了降低費(fèi)用,檢測點(diǎn)可以利用各個峰所出現(xiàn)的時間差,先后在同一點(diǎn)檢測。
實(shí)施例1用
圖1所示的“十字架”芯片上做預(yù)實(shí)驗(yàn),將pH4.0、濃度為18g/L的肝素放在樣品池1里,則3做廢液池,2做緩沖液池,在2、3、4中放入pH6.86的磷酸鹽緩沖液。在1和3、2和4之間同時加2.4kV的電壓,電泳分離肝素,電泳圖如圖3中的a所示,肝素有1′、2′、3′、4′共4個組分(倒峰是由于緩沖液和樣品pH不同而產(chǎn)生的電滲流的峰)。根據(jù)肝素的各個峰的個數(shù)和出峰時間制造和圖2類似的芯片,第二單元的個數(shù)為5。在此芯片上的操作按“具體實(shí)施方式
”所述,所加蛋白質(zhì)為pH4.0、濃度為0.09g/L的G-CSF,分離電壓為2.4kV,所用緩沖液為pH6.86的磷酸鹽,所得電泳圖如圖3中的b所示。由圖3可知,肝素和蛋白質(zhì)G-CSF混合前是4個峰,混合后峰1′、3′、4′消失了,峰2′的峰高也降低了。這說明肝素中的4個組分都參與了和G-CSF的作用。
用圖1所示的“十字架”芯片做預(yù)實(shí)驗(yàn),將pH4.0、濃度為0.09g/L的G-CSF放在樣品池1里,則3做廢液池,2做緩沖液池,在2、3、4中放入pH6.86的磷酸鹽緩沖液。在1和3、2和4之間同時加2.4kV的電壓,電泳分離G-CSE電泳圖如圖4中的a所示,只一個電滲流的峰,一個蛋白質(zhì)G-CSF的峰。按蛋白質(zhì)的峰個數(shù)和出峰時間制造同圖2類似的有第二單元為2的芯片。在此芯片上的操作按“具體實(shí)施方式
”所述,所加肝素為pH4.0、濃度為18.0g/L,分離電壓為2.4kV,所用緩沖液為pH6.86的磷酸鹽,所得電泳圖如圖4中的b所示。由圖4可知,蛋白質(zhì)和肝素混合前是1個峰,混合后該峰的峰高降低。這說明G-CSF和肝素有相互作用。同樣還在此芯片上測試了0.09g/L粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)與不同濃度的肝素混合前、后的譜圖變化,如圖5所示a)混合前0.09g/L G-CSF的單獨(dú)峰;b)0.09g/L G-CSF +9.0g/L肝素;c)0.09g/L G-CSF +12.4g/L肝素;d)0.09g/LG-CSF +18.0g/L肝素;e)0.09g/L G-CSF +51.5g/L肝素;f)0.09g/L G-CSF+71.25g/L肝素;g)0.09g/L G-CSF +112.5g/L肝素。從圖5可以看出,隨著肝素量的加大,G-CSF的峰高逐漸降低,甚至消失。
以上三組實(shí)驗(yàn)充分證明,肝素和蛋白質(zhì)G-CSF有相互作用,且若接MS還可測出是肝素的哪些片段與G-CSF作用。此發(fā)現(xiàn)是前人所未報道過的。
實(shí)施例2用圖1所示的“十字架”芯片做預(yù)實(shí)驗(yàn),將pH4.0、濃度為0.09g/L的G-CSF放在樣品池1里,則3做廢液池,2做緩沖液池,在2、3、4中放入pH6.86的磷酸鹽緩沖液。在1和3、2和4之間同時加2.4kV的電壓,電泳分離G-CSE電泳圖如圖6中的a所示,只一個電滲流的倒峰,一個蛋白質(zhì)G-CSF的峰。按蛋白質(zhì)的峰個數(shù)和出峰時間制造同圖2類似的有第二單元為2的芯片。在此芯片上的操作按“具體實(shí)施方式
”所述,所加樣品為pH4.0、濃度為268.0g/L的硫酸葡聚糖,分離電壓為2.4kV,所用緩沖液為pH6.86的磷酸鹽,所得電泳圖如圖6中的b所示。由圖6可知,蛋白質(zhì)和硫酸葡聚糖混合前是1個峰,混合后該峰的峰高和峰面積都沒有變化。這說明G-CSF和硫酸葡聚糖沒有相互作用。
實(shí)施例3用圖1所示的“十字架”芯片做預(yù)實(shí)驗(yàn),將pH6.86、濃度為0.15g/L的干擾素γ放在樣品池1里,則3做廢液池,2做緩沖液池,在2、3、4中放入pH6.86的磷酸鹽緩沖液。在1和3、2和4之間同時加2.4kV的電壓,電泳分離干擾素γ,電泳圖如圖7中的a所示,只一個電滲流的倒峰,一個干擾素γ的峰。按干擾素γ峰個數(shù)和出峰時間制造同圖2類似的有第二單元為2的芯片。在此芯片上的操作按“具體實(shí)施方式
”所述,所加肝素為pH4.0、濃度為43.75g/L,分離電壓為2.4kV,所用緩沖液為pH6.86的磷酸鹽,所得電泳圖如圖7中的b所示。由圖7可知,干擾素γ和肝素混合前是1個峰,混合后該峰的峰高降低,峰面積不變。這說明干擾素γ和肝素有相互作用,而且是快速得解離平衡。這與前人用其它方法所做得實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。
注在以上三個實(shí)施例中,所用的一些相同的條件為凡樣品為pH4.0的,都是用NaAc-HAc緩沖液配成的;凡樣品為pH6.86的,都是用pH6.86的磷酸鹽緩沖液配成的;所用的檢測波長都為210nm;
權(quán)利要求
1.一種用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,其特征在于芯片由兩個單元構(gòu)成;第一個單元為一個十字交叉結(jié)構(gòu)的基本分離單元;第二個單元為多個并列的十字交叉結(jié)構(gòu)的基本分離單元;第一個單元分離通道的下游端與第二個單元每個基本分離單元分離通道的上游端十字相接。
2.按照權(quán)利要求1所述用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,其特征在于所述第二個單元的基本分離單元分離通道的下游端共同接一個檢測口。
3.按照權(quán)利要求1或2所述用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,其特征在于所述第二個單元的基本分離單元為2~100個。
4.一種肝素靶酶的篩選方法,其特征在于使用權(quán)利要求1所述多功能微流控芯片;過程如下將肝素混合物溶液放在第一個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中,將待篩選的蛋白質(zhì)溶液放入第二個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中;對第一個單元基本分離單元的樣品通道和分離通道同時施加電壓,使肝素分離;當(dāng)?shù)谝粋€單元的分離峰出現(xiàn)時,再依出峰時間分別對第二個單元中的基本分離單元逐個施加電壓,每一個分離峰對應(yīng)于一個分離單元,使肝素和蛋白質(zhì)混合并電泳分離,進(jìn)行檢測;比較每一個肝素峰在混合前后的峰形或峰大小,如有變化,則表明該肝素與該蛋白質(zhì)有相互作用。
5.按照權(quán)利要求4所述肝素靶酶的篩選方法,其特征在于放入第二個單元的蛋白質(zhì)為不同的種類。
6.按照權(quán)利要求4所述肝素靶酶的篩選方法,其特征在于放入第二個單元的蛋白質(zhì)為同一種。
7.一種肝素靶酶的篩選方法,其特征在于使用權(quán)利要求1所述多功能微流控芯片;過程如下將蛋白質(zhì)混合物溶液放在第一個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中,將待篩選的肝素溶液放入第二個單元基本分離單元樣品通道進(jìn)樣端的儲液池中;對第一個單元的基本分離單元樣品通道和分離通道同時施加電壓,使蛋白質(zhì)分離;當(dāng)?shù)谝粋€單元的分離峰出現(xiàn)時,再依出峰時間分別對第二個單元中的基本分離單元逐個施加電壓,每一個分離峰對應(yīng)于一個分離單元,使蛋白質(zhì)和肝素混合并電泳分離,進(jìn)行檢測;比較每一個蛋白質(zhì)峰在混合前后的峰形或峰大小,如有變化,則表明該蛋白質(zhì)與該肝素有相互作用。
8.按照權(quán)利要求7所述肝素靶酶的篩選方法,其特征在于放入第二個單元的肝素為不同的種類。
9.按照權(quán)利要求7所述肝素靶酶的篩選方法,其特征在于放入第二個單元的肝素為同一種。
全文摘要
一種用于肝素靶酶篩選的多功能微流控芯片,由兩個分離單元構(gòu)成;第一個單元分離通道的下游端與第二個單元每個基本分離單元分離通道的上游端十字相接。肝素靶酶過程如下將蛋白質(zhì)混合物溶液放在第一個單元進(jìn)樣端的儲液池中,將待篩選的肝素溶液放入第二個單元進(jìn)樣端的儲液池中;對第一個單元的樣品通道和分離通道同時施加電壓,使蛋白質(zhì)分離;當(dāng)?shù)谝粋€單元的分離峰出現(xiàn)時,再依出峰時間分別對第二個單元逐個施加電壓,使蛋白質(zhì)和肝素混合并電泳分離,進(jìn)行檢測;比較每一個蛋白質(zhì)峰在混合前后的峰形或峰大小,如有變化,則表明該蛋白質(zhì)與該肝素有相互作用。本發(fā)明可在一塊小小的塑料或玻璃片上,在極短的時間內(nèi)完成肝素的高效分離分析、肝素-蛋白質(zhì)相互作用的在線檢測及多個靶酶的同時篩選,且具有很高的靈敏度和低的檢測限。
文檔編號G01N33/53GK1477398SQ02132790
公開日2004年2月25日 申請日期2002年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者梁愛葉, 羅勇, 王克夷, 杜昱光, 林炳承 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所