專(zhuān)利名稱：肝素酶Ⅲ的固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝素酶III的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖為固定化材料對(duì)肝素酶III進(jìn)行固定化的方法，實(shí)現(xiàn)肝素酶III的固定化和可重復(fù)利用性。
背景技術(shù)：
肝素酶是指一類(lèi)能夠特異性裂解肝素和類(lèi)肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)的，其后又發(fā)現(xiàn)在一些微生物和動(dòng)物組織中也有肝素酶存在。目前有學(xué)術(shù)論文報(bào)道的肝素酶大約有10多種，得到較為細(xì)致研究的只有來(lái)自肝素黃桿菌的3種酶，分別是肝素酶I (EC編號(hào)4. 2. 2. 7)、肝素酶II (無(wú)EC編號(hào))、肝素酶IIKEC編號(hào)
4.2. 2. 8)。肝素酶I、II、111分別是分子量大約43、78、66kd的單體蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)均在9. O左右，應(yīng)用和研究非常廣泛。 肝素酶III是一種主要以硫酸乙酰肝素為催化降解底物的酶，只對(duì)肝素鏈上極少的特定位點(diǎn)具有催化裂解作用。肝素酶III對(duì)制備硫酸乙酰寡糖、研究肝素和硫酸乙酰肝素的結(jié)構(gòu)有重要的作用。然而游離的肝素酶III在發(fā)生反應(yīng)時(shí)需要將其加入底物中，反應(yīng)以后酶溶液、底物和產(chǎn)物混合在一起不容易分離，導(dǎo)致酶無(wú)法重復(fù)使用，利用效率低下，這為應(yīng)用帶來(lái)很多不便，需要尋找一種能提高肝素酶III利用效率的方法。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專(zhuān)一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，又克服了游離酶的不足之處，具有分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此，對(duì)肝素酶III的固定化是一種提高使用效果的理想選擇。但目前對(duì)肝素酶III進(jìn)行固定化的研究未見(jiàn)報(bào)道。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種高效并且低成本的肝素酶III的固定化方法。籍此，本發(fā)明給出了一種以殼聚糖微球?yàn)椴牧蠈?duì)肝素酶III固定化的方法，成功實(shí)現(xiàn)了肝素酶III與底物和產(chǎn)物的分離，使酶的應(yīng)用潛力更大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用殼聚糖微球固定肝素酶III的方法，包括下述步驟
(1)肝素酶III溶液的制備選擇TriS-HCl緩沖液(pH7.0，其中含CaCl2)作為肝素酶III的溶劑，將肝素酶III溶解在該緩沖液中，制得肝素酶III溶液；
(2)肝素酶III與殼聚糖微球的交聯(lián)將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液(pH7. 0，其中含IOmM CaCl2)充分溶脹，再取步驟(I)獲得的肝素酶III溶液，將其加入該殼聚糖微球中，進(jìn)行交聯(lián)；
(3)用乙酸-乙酸鈉和Tris-HCl兩種緩沖液分別洗滌上述交聯(lián)后的殼聚糖微球至洗脫液無(wú)酶活性；
(4)利用還原劑對(duì)步驟(3)中獲得的固定了肝素酶III的殼聚糖微球進(jìn)行處理，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶III。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(I)中用于溶解肝素酶III的溶劑TriS-HCl的濃度為 10-50mM，其中含 CaCl2 濃度為 lO-lOOmM，最優(yōu)選 50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含 IOmMCaCl2)；
在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(I)中肝素酶III在溶液中的濃度為O. l-100IU/ml，更優(yōu)選為 1-10 IU/ml，最優(yōu)選為 2-5 IU/ml。在上述實(shí)施方案中，步驟(2)中所述殼聚糖微球可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的制備方法進(jìn)行制備，例如，可以采用反相懸浮法進(jìn)行制備，其中使用的交聯(lián)劑可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇，例如應(yīng)用最為廣泛的交聯(lián)劑為戊二醛。所述溶脹時(shí)間可以根據(jù)溶脹程度由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行控制，例如，溶脹20分鐘。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(2)中使用的殼聚糖微球與肝素酶III溶液的體積比為 1/10-10/1，更優(yōu)選 1/5-5/1，最優(yōu)選 1/2-2/10在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選在步驟(2)中，交聯(lián)溫度為4-10°C，交聯(lián)時(shí)間為8-24h，更優(yōu)選的交聯(lián)溫度為8-10°C，交聯(lián)時(shí)間為12-20h。 在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(3)中使用的緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH
6.0-8. 0)，更優(yōu)選為50-150mM乙酸-乙酸鈉(pH 6. 5-8. 0，其中含50_200mM NaCl)緩沖液，最優(yōu)選為IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)緩沖液。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(3)中使用的緩沖液為T(mén)ris-HCl緩沖液，更優(yōu)選為50mM Tris-HCl (pH 6. 5-8. 0，其中含 IO-IOOmM CaCl2 和 50_200mM NaCl)緩沖液，最優(yōu)選為 50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含 50mM CaCl2 和 IOOmM NaCl)緩沖液。在上述實(shí)施方案中，在步驟(4)的還原劑處理步驟中，是對(duì)殼聚糖上的氨基與戊二醛上的醛基共價(jià)交聯(lián)后產(chǎn)生的不穩(wěn)定C=N雙鍵進(jìn)行還原，該還原步驟中可以使用任何已知的可以用于還原該雙鍵的還原劑，比如硼氫化物、氫化鋁鋰、雷尼鎳等，優(yōu)選硼氫化物，比如堿金屬硼氫化物，例如硼氫化鈉、硼氫化鉀等。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(4)中使用的NaBH4濃度為l-10mg/ml，反應(yīng)
0.5-10h ;最優(yōu)選擇濃度為l_5mg/ml的NaBH4,反應(yīng)l_3h。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(4)中使用Tris-HCl緩沖液沖洗除去剩余的還原劑，更優(yōu)選該緩沖液為50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)0在上述實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(4 )之后，為了能夠?qū)υ摲椒ㄟM(jìn)行評(píng)價(jià)，獲得固定化酶活與上樣的游離酶活相比能夠得出整個(gè)固定化過(guò)程的效率，以及對(duì)固定化酶進(jìn)行定量，可以在進(jìn)行還原劑處理步驟之后，測(cè)固定化酶活。在上述實(shí)施方案中，在獲得固定化的肝素酶III之后，保存條件為保存在Tris-HCl緩沖體系中，pH 6. 5-8. 0，添加金屬鹽CaCl2和NaCl，保存溫度為0_25°C，最優(yōu)條件為保存在50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含IOmM CaCl2),溫度為4_10°C環(huán)境中。在使用時(shí)，該固定在載體上的酶可以和底物直接反應(yīng)，反應(yīng)完后經(jīng)分離，固定在載體上的酶可以再次使用。固定化肝素酶可以應(yīng)用于血液中肝素的清除，用于低分子肝素的生產(chǎn)制備，用于肝素和低分子肝素樣品的部分或完全降解。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選步驟(2)中的反相懸浮法為
取市售殼聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將分散劑加入油相中，然后將酸性殼聚糖溶膠加入油相中，乳化之后，加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)完畢后加入等體積的NaOH和無(wú)水乙醇的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復(fù)洗滌，即得殼聚糖微球。在上述實(shí)施方案中，用于溶解殼聚糖的溶劑為2%的乙酸溶液，殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。優(yōu)選分散劑為Span 80，優(yōu)選油相為液體石蠟，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為500-800rpm ;優(yōu)選的交聯(lián)劑為25%的戊二醛，優(yōu)選的交聯(lián)時(shí)間為l_2h，優(yōu)選的2. 5M NaOH與無(wú)水乙醇的體積比為.1/1。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選使用的固定化肝素酶III測(cè)定方法為DMB法[Richard,ff. et al. , (1986), Biochimica et Biophysica Acta, 883, 173-177]和 232nm 法[Bernstein, H. , (1987), AppI. Biochem. Biotech. 16, 129-143]。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的肝素酶III的固定化方法包括下述步驟
(la)、殼聚糖微球的制備
取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span 80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為40°C，交聯(lián)完畢后加入2. 5M NaOH和無(wú)水乙醇(體積比1/1)的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復(fù)洗滌，即得殼聚糖微球；
(1)配制緩沖液50mMTris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2),將其作為肝素酶III的溶齊U，制得肝素酶III溶液，調(diào)整濃度至酶活力2-5IU/ml ；
(2)取步驟(I)獲得的肝素酶III溶液，將其加入用50mMTris-HCKpH 7.0，其中含IOmMCaCl2)充分溶脹過(guò)的步驟(Ia)獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，.4-10°C交聯(lián) 12-20h ；
(3)配制IOOmM 乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含 IOOmM NaCl)和 50mM Tris-HCl (pH.7.5，其中含50mM CaCljP IOOmM NaCl)緩沖液，先后對(duì)交聯(lián)后的殼聚糖微球進(jìn)行洗滌，緩沖液IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含50mM CaCl2和IOOmM NaCl)洗滌，收集洗脫液測(cè)酶活，直至洗脫液中無(wú)游離酶；
(4)在固定化酶中加入還原劑，反應(yīng)后除去殘余還原劑在固定了肝素酶III的殼聚糖微球中加入NaBH4l-5mg/ml，反應(yīng)l-3h進(jìn)行還原，反應(yīng)完畢后，以50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)為緩沖液，對(duì)殼聚糖微球進(jìn)行洗滌，所用緩沖液體積是殼聚糖微球體積的.3-5 倍。本發(fā)明的有益效果
通過(guò)以上所述的發(fā)明內(nèi)容，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了肝素酶III的固定化和可重復(fù)利用。該方法可對(duì)肝素酶III達(dá)到顯著的固定化效果，每毫升的殼聚糖微球可以固定化3. 11 IU的肝素酶III，交聯(lián)效率可達(dá)到80. 3%，在特定的保存條件中可以使固定化的肝素酶III在保存I周后仍保持93. 5%的活性。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例
所用肝素酶為從肝素黃桿菌發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體中分離純化得到的，酶制備過(guò)程見(jiàn)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00910039360. I “一種肝素黃桿菌肝素酶III的制備方法”中的實(shí)施例。
a、取Ig市售的純度為99%的殼聚糖粉末溶于50ml 2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將0.6g市售化學(xué)純的Span 80 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純)加入IOOml液體石蠟中，以SOOrpm的轉(zhuǎn)速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為40°C，Ih后加入IOOml的等體積的2. 5M NaOH和無(wú)水乙醇的混合液,攪拌后IOmin后靜置,棄去油層和水層,用超純水沖洗5次，棄去水層即得殼聚糖微球。b、選擇50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液作為肝素酶III的溶齊U，制得用DMB法測(cè)得酶活為31. 20 U/ml，用232nm法測(cè)定酶活為3. 88 IU/ml的肝素酶III溶液，取Iml該肝素酶液加入裝有Iml殼聚糖微球的小柱中，搖勻，10°C冷庫(kù)中交聯(lián)15h，棄去交聯(lián)后的上清液。C、用2ml的IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，其中含IOOmM NaCl)緩沖液洗滌上述交聯(lián)肝素酶后的殼聚糖微球，再用約IOml的50mM Tris-HCl (pH 7. 5，其中含50mM CaCl2和IOOmM NaCl)緩沖液洗滌上述交聯(lián)后的殼聚糖微球，至洗脫液檢測(cè)無(wú)酶活為止。
d、在上述固定了肝素酶III的殼聚糖微球中加入Iml的lmg/ml的硼氫化物陰離子的堿金屬鹽NaBH4，反應(yīng)lh，用IOml的50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液洗滌，以除去殘余的NaBH4，得到固定化酶1ml。用DMB法測(cè)得固定化酶活性為23. 19 U/ml，換算為肝素酶國(guó)際酶活單位(即232nm法測(cè)定的酶活值)為3. 11 IU/ml。肝素酶III的固定化效率為80. 3%，每Iml殼聚糖微球可固定3. 11 IU/ml的肝素酶III。e、將上述固定化酶置于2ml的50mM Tris-HCl (pH 7.5，其中含50mM CaCl2和IOOmM NaCl)，溫度為4_10°C的環(huán)境中保存。在保存I周后固定化酶的活力經(jīng)測(cè)定為保存前的 93. 5%ο在實(shí)施例中，測(cè)定酶活力的具體方法如下
I) 232nm法測(cè)酶活在5ml石英比色皿中加入在30°C預(yù)熱過(guò)的2. 5ml肝素濃度為Img/ml的50mM Tris-HClCpH 7. 0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液，移取20μ1酶液，搖勻后在232nm測(cè)定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據(jù)摩爾消光系數(shù)計(jì)算單位時(shí)間產(chǎn)生的雙鍵的摩爾數(shù)，并由此計(jì)算酶液的單位活性(IU/ml)，該方法測(cè)得的酶活為肝素酶的國(guó)際酶活單位。2) DMB法測(cè)酶活取固定化酶加入一定濃度的硫酸乙酰肝素底物，45°C水浴中反應(yīng)5min，取樣，測(cè)定剩余硫酸乙酰肝素的濃度，測(cè)定方法為將未知濃度的硫酸乙酰肝素底物用50mM Tris-HCl (pH 7.0，其中含IOmM CaCl2)緩沖液稀釋一定倍數(shù)，在5ml玻璃比色皿中加入2. 5ml的DMB溶液，再加入25μ1稀釋后的硫酸乙酰肝素溶液，搖勻后測(cè)定525nm處的吸光值，根據(jù)DMB法測(cè)定肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得酶解后剩余的硫酸乙酰肝素濃度，以每小時(shí)降解Img硫酸乙酰肝素所需的酶量為一個(gè)酶活單位，由此計(jì)算固定化酶的單位活性(U/ml)。232nm法是測(cè)定肝素酶III活性的最通用方法，可用于游離肝素酶III活性的測(cè)定，但用于固定化酶活性測(cè)定時(shí)微球帶來(lái)很大干擾而難以使用；DMB法可用于游離肝素酶III和固定化肝素酶III活性的測(cè)定。本發(fā)明中通過(guò)對(duì)相同濃度的游離肝素酶的DMB法和232nm法分別測(cè)定，得到兩種測(cè)定方法的換算關(guān)系，DMB法測(cè)得的酶活數(shù)值是232nm法測(cè)定數(shù)值的7. 45倍，以此對(duì)固定化的肝素酶酶活進(jìn)行國(guó)際單位活性換算。
權(quán)利要求
1.一種肝素酶III的固定化方法，包括下述步驟 (1)肝素酶III溶液的制備選擇TriS-HCl緩沖液(pH7.O，含CaCl2)作為肝素酶III的溶齊U，將肝素酶III溶解在該緩沖液中，制得酶溶液； (2)肝素酶III與殼聚糖微球的交聯(lián)將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液(pH7. O,含IOmM CaCl2)充分溶脹，再取步驟(1)獲得的肝素酶III溶液，將其加入該殼聚糖微球中，進(jìn)行交聯(lián)； (3)用乙酸-乙酸鈉(pH6. 5-8. 0，含 NaCl ^PTris-HCKpH 6. 5-8. 0，含 CaCl2 和 NaCl)兩種緩沖液分別洗滌上述交聯(lián)后的殼聚糖微球，至洗脫液無(wú)酶活性； (4)利用還原劑處理步驟(3)中獲得的固定了肝素酶III的殼聚糖微球，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶III。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(1中用于溶解肝素酶III的溶劑Tris-HCl 的濃度為 lO-lOOmM，CaCl2 濃度為 5-20mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的固定化方法，其特征在于，步驟(1)中使用的Tris-HCl溶劑為50mM Tris-HCl (pH 7.0，含 IOmM CaCl2)0
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)的固定化方法，其特征在于，步驟(2)中使用的殼聚糖微球與肝素酶III溶液的體積比為1/10-10/1，更優(yōu)選1/5-5/1，最優(yōu)選1/2-2/1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中使用的乙酸-乙酸鈉緩沖液為 50-150mM 乙酸-乙酸鈉(pH 6. 5-8. 0，含 50-200mM NaCl)緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中使用的Tris-HCl緩沖液為.50mM Tris-HCl (pH 6· 5-8.0，含 IO-IOOmM CaCl2, 50-200mM NaCl)緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的固定化方法，其特征在于，步驟(4)中使用的還原劑為堿金屬硼氫化物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的固定化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (la)、殼聚糖微球的制備 取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span 80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入戊二醛作為交聯(lián)劑，交聯(lián)溫度為40°C，交聯(lián)完畢后加入2. 5M NaOH和無(wú)水乙醇(體積比1/1)的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復(fù)洗滌，即得殼聚糖微球； (1)配制緩沖液50mMTris-HCl (pH 7.0，含1OmM CaCl2),將其作為肝素酶III的溶劑，制得肝素酶III溶液，調(diào)整濃度至酶活力l-3IU/ml ； (2)取步驟(1獲得的肝素酶III溶液，將其加入用50mMTris-HCl (pH 7.0，含IOmMCaCl2)充分溶脹過(guò)的步驟(Ia)獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，4-10°C交聯(lián) 12-20h ； (3)配制IOOmM 乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，含 IOOmM NaCl)和 50mM Tris-HCl (pH 7.5，含50mM CaCl2, IOOmM NaCl)緩沖液，先后對(duì)交聯(lián)后的殼聚糖微球進(jìn)行洗滌，緩沖液IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，含IOOmM NaCl)洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7. 5，含50mM CaCl2, IOOmM NaCl)洗滌，收集洗脫液測(cè)酶活，直至洗脫液中無(wú)游離酶； (4)在固定了肝素酶III的殼聚糖微球中加入NaBH4l-5mg/ml,反應(yīng)l-3h,反應(yīng)完畢后，以50mM Tris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2)為緩沖液，對(duì)殼聚糖微球進(jìn)行洗滌，所用緩沖液體積是 殼聚糖微球體積的3-5倍，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶 III。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖微球?yàn)楣潭ɑ牧?，?duì)肝素酶Ⅲ進(jìn)行固定化的方法。肝素酶Ⅲ固定化以后具有可回收、可重復(fù)利用、酶與底物和產(chǎn)物易分離等優(yōu)越性。
文檔編號(hào)C12N11/10GK102888390SQ201210423099
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者馬小來(lái), 白佳珂, 史紹鵬, 李鋰 申請(qǐng)人:深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司