本發(fā)明涉及一種流感病毒疫苗的生產(chǎn)方法，屬于生物領(lǐng)域，特別是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：Vero細(xì)胞于1962年從正常的成年非洲綠猴腎細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。該細(xì)胞是貼壁依賴性的成纖維細(xì)胞。它能支持多種病毒的增殖，包括乙型腦炎、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病等病毒，已被準(zhǔn)許用于生產(chǎn)人用病毒疫苗。Vero細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)的最普遍用于病毒疫苗生產(chǎn)的連續(xù)細(xì)胞系，早在20世紀(jì)80年代，梅里埃研究所(法國里昂)的Montagnon及其同事就已經(jīng)將Vero細(xì)胞首次用于人用疫苗IPV的生產(chǎn)上。隨后便被用于滅活狂犬疫苗，口服的活脊髓灰質(zhì)炎疫苗的生產(chǎn)，至今已有30多年的歷史。最近幾年以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)活動日趨強化。Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基已經(jīng)有較多的研究，但是都存在成本偏高，需要添加過多昂貴生長激素的缺點，放大培養(yǎng)后其密度不高。中國專利201210313363.1公開過一種適用于Vero細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基及方法，其細(xì)胞培養(yǎng)密度最高達(dá)到6.5×106細(xì)胞數(shù)/毫升，但是該培養(yǎng)基仍然存在成分復(fù)雜，成本高的缺點，細(xì)胞培養(yǎng)密度也有進一步改進的需求。新橙皮苷二氫查爾酮（簡稱NHDC）是從柑橘類天然植物中提取的新橙皮苷經(jīng)過氫化而成的黃酮類衍生物，是一種具有苦味抑制和風(fēng)味改良的功能性甜味劑。產(chǎn)品特點：1、甜度高，熱量小。其特點在于甜度大（蔗糖甜度的1500-1800倍），口感清爽，余味持久，并具有極佳的屏蔽苦味的功效。新橙皮苷二氫查爾酮外觀為類白色至微黃色結(jié)晶性粉末，無臭。甜度約為蔗糖的1500～1800倍，其顯甜時間略遲于糖精鈉而遠(yuǎn)快于甘草甜素(5：7：23s)，三者的留甜時間為42：57：133s，也介于兩者之間，故較接近于糖精鈉。溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚和苯。新橙皮苷二氫查爾酮的結(jié)構(gòu)式為：新橙皮苷二氫查爾酮（簡稱NHDC）成本低廉，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中用以生產(chǎn)流感病毒疫苗，可以減少昂貴生長激素的添加，具體而言，不需要添加重組人表皮生長因子，并且容易達(dá)到高密度，同時病毒效價高，病毒包膜完整，產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)異而生產(chǎn)成本低廉。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種查爾酮在vero細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒中的應(yīng)用，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中應(yīng)用，可以減少昂貴生長激素的添加，并且容易達(dá)到高密度，同時病毒效價高，病毒包膜完整，產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)異而生產(chǎn)成本低廉。一種流感病毒疫苗的生產(chǎn)方法，其步驟如下:（1）制備培養(yǎng)基：以下含量以毫克/升計為：新橙皮苷二氫查爾酮0.8-1.5L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-異亮氨酸225L-亮氨酸80-100L-纈氨酸100L-精氨酸鹽酸鹽650-800L-賴氨酸320-350L-蛋氨酸60L-谷氨酸50-82L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺800-1000甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸65-68L-絲氨酸290L-蘇氨酸50～300L-谷氨酰胺650-690維生素C60-99煙酰胺8核黃素0.6鹽酸硫胺素3.5氯化膽堿9D-泛酸鈣0.3葉酸3.8六水氯化鎂50無水硫酸鎂55無水氯化鈣100氯化鉀450氯化鈉5000一水磷酸二氫鈉200磷酸氫二鈉150甘氨酸鐵0.01五水硫酸銅0.0001～0.002；酵母浸膏8000；亞油酸0.01～0.1亞麻酸0.08-0.1；碳酸氫鈉3000D-葡萄糖3000～6000次黃嘌呤鈉鹽6硫辛酸0.1～0.4；（2）使用上述培養(yǎng)基，將Vero細(xì)胞以0.3×106細(xì)胞數(shù)/毫升密度接種于5升攪拌式生物反應(yīng)器中，cytodex-1微載體濃度為4克/升，在細(xì)胞密度達(dá)到10.8*106細(xì)胞數(shù)/毫升直接按照M.O.I為0.01接種流感病毒，維持70小時即收獲。新橙皮苷二氫查爾酮的結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明公開了一種查爾酮在vero細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒中的應(yīng)用，本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中應(yīng)用，可以減少昂貴生長激素的添加，并且容易達(dá)到高密度，同時病毒效價高，病毒包膜完整，產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)異而生產(chǎn)成本低廉。附圖說明附圖為本發(fā)明實施例3達(dá)到細(xì)胞最大密度時的細(xì)胞形態(tài)電鏡觀察。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：實施例所用流感病毒A1(A/NEW/CALEDONIA/20/99)來自NIBSC。（1）制備下述培養(yǎng)基，其特征在于其包括如下組分，以下含量以毫克/升計為：新橙皮苷二氫查爾酮0.8L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-異亮氨酸225L-亮氨酸100L-纈氨酸100L-精氨酸鹽酸鹽650L-賴氨酸350L-蛋氨酸60L-谷氨酸50L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺1000甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸65L-絲氨酸290L-蘇氨酸300L-谷氨酰胺650維生素C99煙酰胺8核黃素0.6鹽酸硫胺素3.5氯化膽堿9D-泛酸鈣0.3葉酸3.8六水氯化鎂50無水硫酸鎂55無水氯化鈣100氯化鉀450氯化鈉5000一水磷酸二氫鈉200磷酸氫二鈉150甘氨酸鐵0.01五水硫酸銅0.0001；酵母浸膏8000；亞油酸0.1亞麻酸0.08；碳酸氫鈉3000D-葡萄糖6000次黃嘌呤鈉鹽6硫辛酸0.1（2）使用上述培養(yǎng)基，將Vero細(xì)胞以0.3×106細(xì)胞數(shù)/毫升密度接種于5升攪拌式生物反應(yīng)器中，cytodex-1微載體濃度為4克/升，在細(xì)胞密度達(dá)到5.8*106細(xì)胞數(shù)/毫升直接按照M.O.I為0.01接種流感病毒，維持70小時即收獲。反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置：溫度為37℃、pH值為7.2、溶氧為40％飽和空氣、攪拌速度為65轉(zhuǎn)/分鐘，依據(jù)殘?zhí)菨舛雀鼡Q新鮮培養(yǎng)液，用結(jié)晶紫法計數(shù)活細(xì)胞密度。實施例2：（1）制備下述培養(yǎng)基，其特征在于其包括如下組分，以下含量以毫克/升計為：新橙皮苷二氫查爾酮1.5L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-異亮氨酸225L-亮氨酸80L-纈氨酸100L-精氨酸鹽酸鹽800L-賴氨酸320L-蛋氨酸60L-谷氨酸82L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺800甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸68L-絲氨酸290L-蘇氨酸50L-谷氨酰胺690維生素C60煙酰胺8核黃素0.6鹽酸硫胺素3.5氯化膽堿9D-泛酸鈣0.3葉酸3.8六水氯化鎂50無水硫酸鎂55無水氯化鈣100氯化鉀450氯化鈉5000一水磷酸二氫鈉200磷酸氫二鈉150甘氨酸鐵0.01五水硫酸銅0.002；酵母浸膏8000；亞油酸0.01亞麻酸0.1；碳酸氫鈉3000D-葡萄糖3000次黃嘌呤鈉鹽6硫辛酸0.4。（2）使用上述培養(yǎng)基，將Vero細(xì)胞以0.3×106細(xì)胞數(shù)/毫升密度接種于5升攪拌式生物反應(yīng)器中，cytodex-1微載體濃度為4克/升，在細(xì)胞密度達(dá)到5.8*106細(xì)胞數(shù)/毫升直接按照M.O.I為0.01接種流感病毒，維持70小時即收獲。反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置：溫度為37℃、pH值為7.2、溶氧為40％飽和空氣、攪拌速度為65轉(zhuǎn)/分鐘，依據(jù)殘?zhí)菨舛雀鼡Q新鮮培養(yǎng)液，用結(jié)晶紫法計數(shù)活細(xì)胞密度。實施例3：（1）制備下述培養(yǎng)基，其特征在于其包括如下組分，以下含量以毫克/升計為：新橙皮苷二氫查爾酮1.0L-色氨酸10L-半胱氨酸100L-異亮氨酸225L-亮氨酸90L-纈氨酸100L-精氨酸鹽酸鹽750L-賴氨酸340L-蛋氨酸60L-谷氨酸70L-苯丙氨酸216L-天冬酰胺900甘氨酸15L-脯氨酸180L-丙氨酸55L-天冬氨酸67L-絲氨酸290L-蘇氨酸145L-谷氨酰胺670維生素C83煙酰胺8核黃素0.6鹽酸硫胺素3.5氯化膽堿9D-泛酸鈣0.3葉酸3.8六水氯化鎂50無水硫酸鎂55無水氯化鈣100氯化鉀450氯化鈉5000一水磷酸二氫鈉200磷酸氫二鈉150甘氨酸鐵0.01五水硫酸銅0.001；酵母浸膏8000；亞油酸0.02亞麻酸0.09；碳酸氫鈉3000D-葡萄糖4000次黃嘌呤鈉鹽6硫辛酸0.3。（2）使用上述培養(yǎng)基，將Vero細(xì)胞以0.3×106細(xì)胞數(shù)/毫升密度接種于5升攪拌式生物反應(yīng)器中，cytodex-1微載體濃度為4克/升，在細(xì)胞密度達(dá)到5.8*106細(xì)胞數(shù)/毫升直接按照M.O.I為0.01接種流感病毒，維持78小時即收獲。反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置：溫度為37℃、pH值為7.2、溶氧為40％飽和空氣、攪拌速度為65轉(zhuǎn)/分鐘，依據(jù)殘?zhí)菨舛雀鼡Q新鮮培養(yǎng)液，用結(jié)晶紫法計數(shù)活細(xì)胞密度。實施例4：流感病毒滴度的測定將待檢病毒樣品在96孔組織培養(yǎng)板的A～G行每孔相鄰5列加入90μLDMEM，10%FBS培養(yǎng)液。A行每孔加入10μL待檢病毒樣品，多通道移液器混合3～5次，然后從每孔轉(zhuǎn)移10μL至B行相應(yīng)孔內(nèi)，再次混合，依次稀釋樣品至G行，然后每孔加入2．5×105MDCK細(xì)胞，置于濕化33℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜后吸除每孔培養(yǎng)液，加200μLDMEM/0．0002%(m/V)胰蛋白酶，置于濕化33℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d。加50μL1%雞血紅細(xì)胞懸液至所有孔內(nèi)，記錄每孔樣品凝集樣式并計算50%細(xì)胞感染計量(TCID50)實驗結(jié)果如下：病毒血凝滴度HAU實施例11:640實施例21:640實施例31：1280可見，本發(fā)明的培養(yǎng)的流感病毒效價高，成本低。實施例5：收獲后對病毒顆粒進行電鏡觀察，結(jié)果如附圖所示，可見流感病毒包膜結(jié)構(gòu)清楚，呈現(xiàn)出完整、典型的流感病毒顆粒狀態(tài)。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包括于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁1 2 3