本發(fā)明涉及一種新型慢病毒包裝方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

慢病毒屬是反轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬，包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒，原發(fā)感染的細胞以淋巴細胞和巨噬細胞為主，感染個體最終發(fā)病。慢病毒感染的顯著特點是感染個體在出現(xiàn)典型的臨床癥狀之前，大多經(jīng)歷長達數(shù)年的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此這些病原體被稱為慢病毒。例如人類免疫缺陷病毒(HⅣ)、猴免疫缺陷病毒(SⅣ)、馬傳染性貧血(EIA)、貓免疫缺陷病毒(FⅣ)都是慢病毒屬，慢病毒屬的原文是Lentivirus，其中Lenti-在拉丁文中有慢的意思。

慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)的慢病毒包裝方法如下：

第一天

A、10cm的組織培養(yǎng)板上，12ml培養(yǎng)基，接種2×10⁶個293T細胞。37度，5％二氧化碳條件下過夜培養(yǎng)，準備用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。

第二天

B、因為轉(zhuǎn)染的混合物應(yīng)該培養(yǎng)12-15小時，所以下午晚一點完成轉(zhuǎn)染。

C、在聚丙烯離心管(不使用聚苯乙烯管)中，加入以下質(zhì)粒，混合每個轉(zhuǎn)染離心管，

10ug小片段RNA質(zhì)粒

20ug包裝質(zhì)粒

20ug包膜蛋白質(zhì)粒

20ul無血清培養(yǎng)基補足體積。

D、用無血清的培養(yǎng)基混合好FuGENE轉(zhuǎn)染試劑。

E、加80ul的FuGENE混合物到轉(zhuǎn)染離心管中，總體積100ul，直接吸的混合液加到液體中，不要加到壁上，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管。

F、室溫放置20-30分鐘。

G、溫育器中得到293FT細胞，這些細胞在不含有抗生素的DMEM中的融合度是50-80％。

H、不要碰盤的兩邊，溫和地加DNA，F(xiàn)uGENE一滴一滴的混合到細胞中，因為不能將細胞從板上驅(qū)走，所以渦旋混合，不要劇烈混合。

I.、37度，5％二氧化碳培養(yǎng)12-15小時。

第三天

J、早上，換培養(yǎng)基，移走轉(zhuǎn)染試劑，加進去5ml新鮮的DMEM，10％FBS，青霉素，鏈霉素混合液，在從平板的邊上吸培養(yǎng)基，不要碰到轉(zhuǎn)染的細胞。

K、37度，5％二氧化碳培養(yǎng)24小時。

第四天

L、從細胞中收獲的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到聚丙烯管中保存，培養(yǎng)液中含有慢病毒，4度保存。

M、加5ml含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基到細胞中，37度，5％二氧化碳條件下保存。

第五天

N、從細胞中收獲培養(yǎng)液和第四天收獲的培養(yǎng)液，1250轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集293T細胞，可以通過0.45um過濾器過濾細胞，代替離心，不要用0.2um過濾，因為病毒可能被切斷。

O、病毒可以保存在4度，長期保存可以在-20度或者-80度。

這種現(xiàn)有的病毒包裝方法，傳代不確定，轉(zhuǎn)染融合度不是很高，完成包裝的時間比較長，純化到的病毒的滴度比較低等問題，可能會導(dǎo)致不能滿足客戶下游實驗的要求。新方法可以在這些方面得到改進，提高轉(zhuǎn)染融合度，縮短包裝時間，以及提高了病毒的滴度等，解決了常規(guī)方法的弊端。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，而提供一種轉(zhuǎn)染融合度高，縮短包裝時間，病毒滴度提高的新型慢病毒包裝方法。

本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是：該新型慢病毒包裝方法，其特征在于，由下述步驟組成：

第一天

(1)10cm的組織培養(yǎng)板上，12ml培養(yǎng)基，接種2×10⁶個293T細胞，37度，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，準備用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，盡管細胞應(yīng)該在加有青霉素和鏈霉素，DMEM(改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基)和10％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但是這一步是不加抗生素的DMEM和10％的FBS的培養(yǎng)基；

第二天

(2)轉(zhuǎn)染的混合物培養(yǎng)12-15小時，下午晚一點完成轉(zhuǎn)染；

(3)在聚丙烯離心管中，加入以下質(zhì)粒，然后混勻，

10ug小片段RNA質(zhì)粒，

40ug包裝質(zhì)粒，

20ug包膜蛋白質(zhì)粒，

用100mM氯化鈉補足體積100μL，確定小片段RNA質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒的比例對最佳的病毒生產(chǎn)是至關(guān)重要的，該比例配比下，病毒的生產(chǎn)量大，用時少；

(4)用氯化鈉混合好Biomiga GenetranⅢ轉(zhuǎn)染試劑，配置Biomiga GenetranⅢ和氯化鈉的混合液；

(5)加80μL的Biomiga GenetranⅢ和氯化鈉混合物到轉(zhuǎn)染離心管中，總體積180μL，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管；

(6)室溫放置20-30分鐘；

(7)從培養(yǎng)板中吸走培養(yǎng)基，然后加8ml的新鮮培養(yǎng)基，半個小時內(nèi)加50μL仲丁巴比安，混勻；

(8)37度，5％二氧化碳培養(yǎng)48-60小時；

第三天

(9)72小時后，收集病毒，3000轉(zhuǎn)，4度離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中。

本發(fā)明所述每個轉(zhuǎn)染離心管反應(yīng)需要6μL的Biomiga GenetranⅢ和74μL的氯化鈉。

本發(fā)明所述Biomiga GenetranⅢ和氯化鈉的混合方法為，在一個聚丙烯管中，先加氯化鈉，直接吸氯化鈉，被稀釋之前的Biomiga GenetranⅢ不能接觸到管壁，然后輕輕旋轉(zhuǎn)移動離心管，室溫放5分鐘。

本發(fā)明的優(yōu)點為：轉(zhuǎn)染融合度高，縮短包裝時間，病毒滴度提高。具體為：

1、本發(fā)明的小片段RNA質(zhì)粒，40ug包裝質(zhì)粒，20ug包膜蛋白質(zhì)粒配比合理，對病毒生產(chǎn)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)染融合度高；

2、本發(fā)明的慢病毒包裝方法的步驟減少，縮短包裝時間，可提高效率，現(xiàn)有技術(shù)中的慢病毒包裝方法需要5天，而本發(fā)明縮短至3天；

3、本發(fā)明的慢病毒包裝方法，病毒滴度提高。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是采用本實施例中的慢病毒包裝方法的病毒觀測。

圖2是現(xiàn)有技術(shù)中的慢病毒包裝方法的病毒觀測。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖并通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

實施例1。

本實施例的新型慢病毒包裝方法由下述步驟組成：

(1)10cm的組織培養(yǎng)板上，12ml培養(yǎng)基，接種2×10⁶個293T細胞，37度，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，準備用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞；

(2)轉(zhuǎn)染的混合物培養(yǎng)12-15小時；

(3)在聚丙烯離心管中，加入以下質(zhì)粒，然后混勻，

10ug小片段RNA質(zhì)粒，

40ug包裝質(zhì)粒，

20ug包膜蛋白質(zhì)粒，

用100mM氯化鈉補足體積100μL；

(4)用氯化鈉混合好Biomiga GenetranⅢ轉(zhuǎn)染試劑，配置Biomiga GenetranⅢ和氯化鈉的混合液；

(5)加80μL的Biomiga GenetranⅢ和氯化鈉混合物到轉(zhuǎn)染離心管中，總體積180μL，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管；

(6)室溫放置20-30分鐘；

(7)從培養(yǎng)板中吸走培養(yǎng)基，然后加8ml的新鮮培養(yǎng)基，半個小時內(nèi)加50μL仲丁巴比安，混勻；

(8)37度，5％二氧化碳培養(yǎng)48-60小時；

(9)72小時后，收集病毒，3000轉(zhuǎn)，4度離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中。

(10)病毒可以保存在4度，長期保存可以保存在-20度或者-80度。

本實施例中的每個轉(zhuǎn)染離心管反應(yīng)需要6μL的Biomiga GenetranⅢ和74μL的氯化鈉。

本實施例中的Biomiga GenetranⅢ和氯化鈉的混合方法為，在一個聚丙烯管中，先加氯化鈉，直接吸氯化鈉，被稀釋之前的Biomiga GenetranⅢ不能接觸到管壁，然后輕輕旋轉(zhuǎn)移動離心管，室溫放5分鐘。

本實施例中所用的轉(zhuǎn)染試劑Biomiga GenetranⅢ，是陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，使用綠色熒光蛋白作為標(biāo)記，用標(biāo)準病毒滴定法滴定病毒的上清，如圖1和圖2所示

圖1采用本實施例中的慢病毒包裝方法1.5*10⁷轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/毫升，總的病毒顆粒是1.2*10⁸；

圖2是現(xiàn)有技術(shù)中的標(biāo)準方法8*10⁵轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/毫升，總的病毒顆粒是1.6*10⁷。

通過上述對比，采用本實施例中的慢病毒包裝方法，病毒的滴定大大提高。

本實施例中所指的陽離子脂質(zhì)體，由一個單一陽離子兩親化合物和一個中性脂質(zhì)組成，此為現(xiàn)有技術(shù)，此處不再贅述。

本說明書中所描述的以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明說明書的內(nèi)容或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。