本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種共同過表達(dá)R-spondin1和Noggin細(xì)胞株(CHO-Rspon-Noggin)及其構(gòu)建方法和在腸道干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

R-spondin1作為R-spondin家族的一員，是一種分泌型蛋白，可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)腸腺上皮細(xì)胞分裂，加速腸腺及小腸絨毛的再生，從而保持小腸和大腸腸粘膜的完整性，也可以調(diào)節(jié)腸道隱窩的體外3D生長。 Noggin是BMP信號通路的抑制劑，在腸腔表面分化成熟的柱狀上皮細(xì)胞中可以檢測到BMP信號通路中的Smad1、Smad5和Smad8的表達(dá)，Noggin作為BMP信號通路抑制劑，可以維持腸道干細(xì)胞的干性。

腸道類器官或者說“迷你腸子”，是將提取的腸道隱窩或腫瘤組織在體外利用基質(zhì)膠培養(yǎng)生長出與來源相似的類器官。類器官可以幫助我們進(jìn)行腸道干細(xì)胞、腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腸道腫瘤治療方式的研究，包括傳統(tǒng)的放療、化療及生物靶向治療，甚至新興的基因治療研究。但是類器官目前的培養(yǎng)主要依賴于價格高昂的商業(yè)化細(xì)胞因子（R-sponding1， Noggin等) ，從而造成整個培養(yǎng)費用太高，嚴(yán)重阻礙了類器官的研究和推廣。本發(fā)明涉及的一種共同過表達(dá)R-spondin1和Noggin細(xì)胞株(即CHO-Rspon-Noggin)，能夠同時分泌這兩種細(xì)胞因子到培養(yǎng)上清中，并保持長時間有活性。該條件培養(yǎng)基能代替商業(yè)化的因子用于腸道類器官的培養(yǎng)，在類器官培養(yǎng)及后續(xù)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同時過表達(dá)R-spondin1和Noggin的細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，包括對R-spondin1和Noggin進(jìn)行基因工程改造以及進(jìn)行慢病毒包裝和感染CHO細(xì)胞的方法，以及含R-spondin1和Noggin細(xì)胞因子的培養(yǎng)基上清液收集方法和該上清液在腸道干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的能同時過表達(dá)R-spondin1和Noggin的細(xì)胞株，記為CHO-Rspon-Nog，能夠同時過表達(dá)了人R-spondin1和人Noggin兩個基因，能同時穩(wěn)定分泌這R-spondin1和Noggin兩個基因至其細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，由該上清液配制的培養(yǎng)基能夠穩(wěn)定培養(yǎng)小鼠隱窩和人腸道正常隱窩及腫瘤組織。如圖1、圖2所示。

本發(fā)明提供的能同時過表達(dá)R-spondin1和Noggin的細(xì)胞株的構(gòu)建方法，具體步驟包括：

包裝pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin兩個慢病毒，采用293T細(xì)胞作為工具細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，輔助質(zhì)粒選擇psPAX和pMD2.G，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時后收集細(xì)胞上清，也即慢病毒RsponV－GFP和NogginV－puro。RsponV－GFP感染CHO細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分選術(shù)篩選GFP－Rspondin高表達(dá)的CHO－Rspon細(xì)胞，然后用NogginV－puro感染CHO－Rspon細(xì)胞，采用200ug/ml puromycin的篩選壓力選擇高表達(dá)Noggin CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞，并且在mRNA和蛋白水平上進(jìn)行過表達(dá)驗證。如圖3、圖4所示。

本發(fā)明還提供兩個慢病毒質(zhì)粒pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin的構(gòu)建和純化方法，所述方法包括：人R-spondin1和人Noggin兩個基因的慢病毒載體構(gòu)建：選擇EcoRI和BamHI兩個酶切位點,將R-spondin1和Noggin兩個基因CDS區(qū)擴(kuò)增出來，其中：

PCR擴(kuò)增R-spondin1基因的上游引物為R-spondin F（5’-CCGGAATTCATGCGGCTTGGGCTGTGTGT-3’（SEQ.ID.NO.1）,EcoRI）

PCR擴(kuò)增R-spondin1基因的下游引物為R-spondin R（5’-GCGGGATCCCTAGGCAGGCCCTGCAGATG-3’ （SEQ.ID.NO.2）,BamHI）；

PCR擴(kuò)增Noggin基因的上游引物為Noggin F（5’-CCGGAATTCATGGAGCGCTGCCCCAGCCT-3’ （SEQ.ID.NO.3）, EcoRI）；

PCR擴(kuò)增Noggin基因的下游引物為Noggin R (5’- GCGGGATCCCTAGCACGAGCACTTGCACT-3’ （SEQ.ID.NO.4） ,BamHI)；

將這兩個基因全長分別連接到表達(dá)質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin，采用大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增質(zhì)粒；并分別命名為pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-puromycin-Noggin。

本發(fā)明還提供上述細(xì)胞株（CHO-Rspon-Noggin）的應(yīng)用。包括：

收集R-spondin1和Noggin兩個細(xì)胞因子的方法，所述的方法包括正常培養(yǎng)CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞，細(xì)胞生長到100%后按1:10比例傳代，待細(xì)胞生長到100%后將培養(yǎng)基換成無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)一周后收集培養(yǎng)基，用0.22um的濾器過濾培養(yǎng)液，于-80度保存。

采用CHO-Rspon-Nog細(xì)胞株收集的細(xì)胞上清液配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)小鼠和人腸道隱窩及腫瘤組織的方法如下：配制含50%收集上清液的Advanced DMED/F12培養(yǎng)基，并加入其他細(xì)胞因子，進(jìn)行小鼠腸道隱窩的3D培養(yǎng)；或配制含20%收集上清液的培養(yǎng)基，進(jìn)行人腸道正常隱窩和腫瘤組織的3D培養(yǎng)。通過培養(yǎng)使兩者生長成與來源相似的類器官組織--“迷你腸子”，然后對“迷你腸子”進(jìn)行基因干擾，如過表達(dá)或敲除等，開展腸道干細(xì)胞的研究，以及腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的研究；或者采用藥物或放射線等處理“迷你腸子”，進(jìn)行腸道腫瘤的治療包括化療、放療、靶向治療等方面研究。因此CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞株在“迷你腸子”培養(yǎng)及后續(xù)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1 為CHO-Rspon-Nog細(xì)胞收集的上清液和商品化細(xì)胞因子培養(yǎng)的小鼠隱窩示意圖。

圖2為CHO-Rspon-Nog細(xì)胞收集的上清液培養(yǎng)的人腸道正常隱窩和腫瘤組織示意圖。

圖3 為CHO-Rspon-Nog細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)情況示意圖。

圖4 為CHO-Rspon-Nog細(xì)胞的蛋白水平表達(dá)情況示意圖。

具體實施方式

下面采用具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。

以下內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1：慢病毒載體pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin的構(gòu)建方法

通過高保真PCR的方法，選擇EcoRI和BamHI兩個酶切位點,將R-spondin1和Noggin兩個基因CDS區(qū)擴(kuò)增出來：

R-spondin的上游擴(kuò)增引物是R-spondin F：（5’-CCGGAATTCATGCGGCTTGGGCTGTGTGT-3’,EcoRI）,

R-spondin的下游擴(kuò)增引物是R-spondin R：（5’-GCGGGATCCCTAGGCAGGCCCTGCAGATG-3’,BamHI），

Noggin的上游擴(kuò)增引物是Noggin F（5’-CCGGAATTCATGGAGCGCTGCCCCAGCCT-3’, EcoRI）,

Noggind的下游擴(kuò)增引物是Noggin R (5’- GCGGGATCCCTAGCACGAGCACTTGCACT-3’,BamHI

然后用分子克隆方法將這兩個基因全長分別克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin兩個載體上，將重組載體轉(zhuǎn)化到DH5α中，以氨芐西林為選擇壓力，轉(zhuǎn)接重組菌株于含氨芐西林選擇壓力的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12-16小時，挑選單個克隆的重組轉(zhuǎn)接菌株至含氨芐西林選擇壓力的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時，抽提質(zhì)粒后送測序，確定后R-spondin1和Noggin兩個基因全長均分別克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin兩個載體上，并分別命名為pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-puromycin-Noggin。

實施例2. 同時過表達(dá)R-spondin1和Noggin的CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞株的構(gòu)建方法

采用慢病毒感染方式構(gòu)建CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞，以293T細(xì)胞作為慢病毒包裝細(xì)胞。待293T細(xì)胞生長至50-60%時，將目的基因質(zhì)粒（分別是pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-CMV-Noggin），包裝質(zhì)粒psPAX和pMD2.G按4:3:1的比例輕均勻加入293T細(xì)胞中，48小時之后收集293T細(xì)胞的病毒上清，分別命名為RsponV和NogginV，0.45um濾器過濾病毒上清供后續(xù)實驗使用。

以CHO細(xì)胞為目的細(xì)胞，首先將含RsponV的病毒上清感染CHO細(xì)胞，通過流式分選術(shù)將GFP高表達(dá)的細(xì)胞篩選出來，此為高表達(dá)R-spondin1的CHO-Rspon細(xì)胞，然后再將含有NogginV的病毒上清感染CHO-Rspon細(xì)胞，通過200ug/ml puromycin的篩選壓力選擇高表達(dá)Noggin的CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞，并采用Real-time PCR和Western Blotting兩種方法,從mRNA和蛋白水平驗證R-spondin1和Noggin的過表達(dá)情況。

實施例3. 收集含R-spondin1和Noggin兩個細(xì)胞因子的培養(yǎng)基

含10%FBS和10ug/mlpuromycin的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-Rspon-Noggin細(xì)胞，細(xì)胞生長到100%后按1:10比例傳代，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長到100%后將培養(yǎng)基換成含1%Glutamax和1%Hepes的Advanced DMED/F12無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)一周后收集細(xì)胞上清，用0.22um的濾器過濾細(xì)胞上清，并-80度保存。

實施例4. 含R-spondin1和Noggin兩個細(xì)胞因子培養(yǎng)基的應(yīng)用

收集小鼠隱窩，采用含100%收集的R-spondin1和Noggin上清液配制的培養(yǎng)基在基質(zhì)膠中培養(yǎng)小鼠隱窩，小鼠隱窩能夠生長成類器官組織----“迷你腸子”。

收集結(jié)腸癌患者大腸正常隱窩和腫瘤組織，用含20%收集的R-spondin1和Noggin上清液配制的培養(yǎng)基在基質(zhì)膠中進(jìn)行培養(yǎng)，同樣能夠生長成人的正常腸道類器官組織和人腺癌組織。

SEQUENCE LISTING

<110> 復(fù)旦大學(xué) 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

<120> 同時過表達(dá)R-spondin1和Noggin的細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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