本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說(shuō)是涉及千金藤堿的應(yīng)用以及一種擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法。
背景技術(shù)：
：造血干細(xì)胞是存在于造血組織中的一群原始造血細(xì)胞，是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，具有長(zhǎng)期自我更新的能力和分化成各類(lèi)成熟血細(xì)胞的潛能。它是研究歷史最長(zhǎng)且最為深入的一類(lèi)成體干細(xì)胞，對(duì)研究各類(lèi)干細(xì)胞，包括腫瘤干細(xì)胞，具有重要指導(dǎo)意義。造血干細(xì)胞是治療白血病、淋巴瘤等惡性腫瘤、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等嚴(yán)重危害人類(lèi)健康疾病的有效方法，可以有效的減輕患者的痛苦。造血干細(xì)胞的主要來(lái)源是骨髓、外周血及胎盤(pán)，骨髓和外周血造血干細(xì)胞增值和分化能力下降，并且易受供者健康狀態(tài)影響，而胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量有限，不能滿足50kg以上成人的使用，大大限制了其臨床應(yīng)用需求。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)中含有大量的早期干細(xì)胞，包括數(shù)量豐富的造血干細(xì)胞。這些干細(xì)胞在胎盤(pán)中行使著造血的功能。胎盤(pán)中所含的造血干細(xì)胞是臍帶血的8-10倍，可供小孩自用幾次，甚至可提供給承認(rèn)患者的治療，因此胎盤(pán)造血干具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞的途徑主要采用加入血清和多種細(xì)胞因子的液體培養(yǎng)基、或與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)等方法，但是上述方法仍不能獲得充足的、具有移植活性的造血干細(xì)胞用于臨床治療，而且容易造成造血干細(xì)胞的干性丟失、造成移植的失敗。中國(guó)專(zhuān)利CN105112374A公開(kāi)了一種臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述體外擴(kuò)增培養(yǎng)基以IMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加血清、血小板生成素、干細(xì)胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體、白介素-1、白介素-6、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子和小檗堿。用于胎盤(pán)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增時(shí)，具有造血干細(xì)胞增殖率高的優(yōu)點(diǎn)，而且能顯著提高造血干細(xì)胞移植到受體內(nèi)的植入能力和造血系統(tǒng)的重建能力，能較好的保持造血干細(xì)胞的特性。但是，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，上述培養(yǎng)基對(duì)于造血干細(xì)胞數(shù)量和含量的增殖仍有所欠缺，有待于進(jìn)一步提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供千金藤堿在培養(yǎng)擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞中的應(yīng)用，使其能夠促進(jìn)胎盤(pán)造血干細(xì)胞的增殖能力，顯著提高在數(shù)量和含量方面的增殖效果。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供包含千金藤堿的培養(yǎng)基，使得所述培養(yǎng)基能夠促進(jìn)胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量和含量的增殖。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種運(yùn)用包含千金藤堿的培養(yǎng)基體外擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞的方法，使得所述方法最終結(jié)果顯著提高了胎盤(pán)造血干細(xì)胞數(shù)量和含量的增殖效果。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：千金藤堿在制備胎盤(pán)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基和/或在體外擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞中的應(yīng)用。千金藤堿，又名千金藤素，是一種從傳統(tǒng)中草藥防己科千金藤屬植物中提取分離出來(lái)的雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，其具有多種生物功能，如抗炎、抑菌、增強(qiáng)免疫功能等，被廣泛地用于治療各種急慢性疾病，而且毒副作用低。在臨床上千金藤堿可使外周血白細(xì)胞增多，用于因腫瘤化療、放療引起的粒細(xì)胞缺乏癥和其他原因引起的白細(xì)胞減少癥。目前未見(jiàn)報(bào)道千金藤堿對(duì)胎盤(pán)造血干細(xì)胞的體外增值作用。本發(fā)明將千金藤堿作為新的組分，添加到胎盤(pán)造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中，相對(duì)于普通擴(kuò)增培養(yǎng)基，其能夠顯著提高胎盤(pán)造血干細(xì)胞在數(shù)量和含量上的增殖效果，使造血干細(xì)胞具有干性強(qiáng)、活性高的特點(diǎn)?；诖耍景l(fā)明提供了一種包含千金藤堿的胎盤(pán)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)基根據(jù)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，千金藤堿在50-100μmol/mL范圍內(nèi)，不僅表現(xiàn)出對(duì)胎盤(pán)造血干細(xì)胞低毒的優(yōu)點(diǎn)，而且還最大程度表現(xiàn)出其優(yōu)異的增殖促進(jìn)效果。同時(shí)，本發(fā)明針對(duì)千金藤堿的優(yōu)勢(shì)，還選擇其它適宜的組分共同作組成胎盤(pán)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)基，這些適宜的組分包括：DMEM培養(yǎng)基、FBS、GM-CSF、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人FMS樣酪氨酸激酶1配體、白介素-3、白介素-6。在具體的實(shí)施方式中，上述各組分以DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加如下濃度的各成分：10-20％的FBS、10-30ng/mlGM-CSF、100-200ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、30-60ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.2-0.6ng/ml白介素-3、0.2-0.6ng/ml白介素-6、50-100μmol/ml千金藤堿。作為優(yōu)選地的方案，各成分濃度為15％的FBS、15ng/mlGM-CSF、150ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、45ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.4ng/ml白介素-3、0.4ng/ml白介素-6、75μmol/ml千金藤堿。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，各成分濃度還可選擇如下：(1)10％的FBS、10ng/mlGM-CSF、100ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、30ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.2ng/ml白介素-3、0.2ng/ml白介素-6、50μmol/ml千金藤堿。(2)20％的FBS、30ng/mlGM-CSF、200ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、60ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體、0.6ng/ml白介素-3、0.6ng/ml白介素-6、100μmol/ml千金藤堿。此外，本發(fā)明還提供了一種體外擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞的方法，將胎盤(pán)造血干細(xì)胞接種到本發(fā)明上述任意一種技術(shù)方案提到的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中，所述胎盤(pán)造血干細(xì)胞可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行提取獲得，在本發(fā)明具體實(shí)施過(guò)程中可參照如下：PBS清洗胎盤(pán)表面，廢棄全部清洗液；用鑷子分離臍帶的兩條動(dòng)脈，將輸液器固定在動(dòng)脈的官腔中；將PBS灌注至臍帶動(dòng)脈中，重復(fù)灌注至少1LPBS；收集灌注后的溶液至離心管中，1500rpm離心5-10min；向離心后的沉淀中加入6％羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置20-30min；待分層后，吸取上層溶液1500rpm離心5-10min，離心后的沉淀即是胎盤(pán)造血干細(xì)胞。作為優(yōu)選，所述胎盤(pán)造血干細(xì)胞接種的密度為1×105/mL，所述培養(yǎng)為在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，一般為3-7d。本發(fā)明選取包括CN105112374A實(shí)施例3擴(kuò)增培養(yǎng)基在內(nèi)的多組對(duì)照培養(yǎng)基為對(duì)比對(duì)象，在相同的胎盤(pán)干細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3天和第7天收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和CD34細(xì)胞含量測(cè)定。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述體外擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)的造血干細(xì)胞，在第7天時(shí)擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到72倍左右，細(xì)胞含量達(dá)到98％左右，具有明顯的擴(kuò)增效果。由以上技術(shù)效果可知，本發(fā)明提供了千金藤堿在胎盤(pán)造血干細(xì)胞擴(kuò)增中的相關(guān)應(yīng)用，通過(guò)多種適宜組分與千金藤堿組成的培養(yǎng)基的作用，可顯著提高胎盤(pán)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增效果，使其具有干性強(qiáng)、活性高的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1所示為不同濃度的千金藤堿對(duì)胎盤(pán)造血干細(xì)胞的活性影響曲線；其中，1為培養(yǎng)48h時(shí)的結(jié)果；2為培養(yǎng)72h時(shí)的結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了千金藤堿的應(yīng)用以及一種擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用、培養(yǎng)基和方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述應(yīng)用、培養(yǎng)基和方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的千金藤堿的應(yīng)用以及一種擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基和方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1：胎盤(pán)造血干細(xì)胞的提取分離事先征得華僑醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦同意，以自愿捐贈(zèng)方式，通過(guò)華僑醫(yī)院正規(guī)采集方法采集胎盤(pán)。PBS清洗胎盤(pán)表面，廢棄全部清洗液；用鑷子分離臍帶的兩條動(dòng)脈，將輸液器固定在動(dòng)脈的官腔中；將PBS灌注至臍帶動(dòng)脈中，重復(fù)灌注至少1LPBS；收集灌注后的溶液至離心管中，1500rpm離心5-10min；向離心后的沉淀中加入6％羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置20-30min；待分層后，吸取上層溶液1500rpm離心5-10min，離心后的沉淀即是胎盤(pán)造血干細(xì)胞。實(shí)施例2：千金藤堿對(duì)胎盤(pán)造血干細(xì)胞的安全性試驗(yàn)用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基將千金藤堿稀釋成0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/ml的藥物濃度。將實(shí)施例1中分離的細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板中，分別加入不同濃度千金藤堿，每孔100ul，以不加千金藤堿的胎盤(pán)造血干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為正常細(xì)胞組，置于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48h和72h。按照MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)利用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，無(wú)論是培養(yǎng)48h還是72h，當(dāng)千金藤堿的濃度50-100μmol/ml時(shí)，造血干細(xì)胞的存活率最高，因此以50-100μmol/ml作為本發(fā)明中千金藤堿的安全濃度。實(shí)施例3：不同擴(kuò)增培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果對(duì)比試驗(yàn)1、培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基1：DMEM/F12+10％FBS；對(duì)照培養(yǎng)基2：CN105112374A實(shí)施例3擴(kuò)增培養(yǎng)基；陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)基：DMEM/F12+10％FBS+15ng/ml血小板生成素+100ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+33ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.2ng/ml白介素-1+0.2ng/ml白介素-6+1uMSR-1(注：SR-1是已經(jīng)通過(guò)篩選技術(shù)得到的一種嘌呤霉素衍生物，是目前為止已經(jīng)證實(shí)的能促進(jìn)人CD34+造血干細(xì)胞大量擴(kuò)增和自我更新的小分子，一般可使細(xì)胞數(shù)量增加50倍，因此可選作為陽(yáng)性對(duì)照藥，但其成本較高，并且不易采購(gòu))；本發(fā)明培養(yǎng)基1：DMEM+15％FBS+15ng/mlGM-CSF+150ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+45ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.4ng/ml白介素-3+0.4ng/ml白介素-6+75μmol/ml千金藤堿。本發(fā)明培養(yǎng)基2：DMEM+10％FBS+10ng/mlGM-CSF+100ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+30ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.2ng/ml白介素-3+0.2ng/ml白介素-6+50μmol/ml千金藤堿。本發(fā)明培養(yǎng)基3：DMEM+20％FBS+30ng/mlGM-CSF+200ng/ml干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+60ng/ml人FMS樣酪氨酸激酶1配體+0.6ng/ml白介素-3+0.6ng/ml白介素-6+100μmol/ml千金藤堿。2、試驗(yàn)方法將實(shí)施例1中分離的造血干細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于6孔板中，2ml/孔，分別加入各組擴(kuò)增培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)3天、7天后收獲細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和CD34細(xì)胞含量測(cè)定。利用countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表1，利用流式細(xì)胞儀分析CD34+細(xì)胞的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。表1造血干細(xì)胞數(shù)量增殖情況培養(yǎng)天數(shù)對(duì)照培養(yǎng)基1對(duì)照培養(yǎng)基2陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基0d2*1052*1052*1053d2.10*1053.1*1068.2*1067d2.05*1056.81*1061.15*107培養(yǎng)天數(shù)本發(fā)明培養(yǎng)基1本發(fā)明培養(yǎng)基2本發(fā)明培養(yǎng)基30d2*1052*1052*1053d7.9*1068.1*1068.14*1067d1.34*1071.23*1071.45*107由表1可知，對(duì)照培養(yǎng)基1的造血干細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯變化；而陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基和本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)造血干細(xì)胞都具有明顯的擴(kuò)增效果。在第7d時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到57倍，本發(fā)明培養(yǎng)基的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到72倍，而現(xiàn)有專(zhuān)利的對(duì)照培養(yǎng)基2明顯低于本發(fā)明培養(yǎng)基和陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)基的擴(kuò)增倍數(shù)，說(shuō)明千金藤堿和陽(yáng)性藥SR-1的對(duì)造血干細(xì)胞增殖效果無(wú)明顯差異，甚至高于陽(yáng)性藥，可以在體外快速擴(kuò)增胎盤(pán)造血干細(xì)胞。表2造血干細(xì)胞含量增殖情況由表2可知，對(duì)照組培養(yǎng)基1的造血干細(xì)胞含量沒(méi)有明顯變化；而陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基和本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)造血干細(xì)胞的含量都具有明顯提高。在第7d時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基的CD34+細(xì)胞含量達(dá)到97.2％，本發(fā)明培養(yǎng)基的細(xì)胞含量達(dá)到98％左右，現(xiàn)有專(zhuān)利的對(duì)照培養(yǎng)基2明顯低于本發(fā)明培養(yǎng)基和陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)基的細(xì)胞含量，說(shuō)明千金藤堿和陽(yáng)性藥SR-1對(duì)造血干細(xì)胞的含量影響無(wú)明顯差異，可以在體外很好的保持造血干細(xì)胞的干性。以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3