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同時過表達R?spondin1和Noggin的細胞株及其構(gòu)建方法和應用與流程

文檔序號:12108643閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種能同時過表達R-spondin1和Noggin的細胞株,記為CHO-Rspon-Nog,其特征在于,同時過表達人R-spondin1和人Noggin兩個基因,能同時穩(wěn)定分泌這R-spondin1和Noggin兩個基因至其細胞培養(yǎng)上清液中,由該上清液配制的培養(yǎng)基能夠穩(wěn)定培養(yǎng)小鼠隱窩和人腸道正常隱窩及腫瘤組織。

2.一種如權(quán)利要求1所述的能同時過表達R-spondin1和Noggin的CHO-Rspon-Nog細胞株的構(gòu)建方法,其特征在于,具體步驟包括:

包裝pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin兩個慢病毒,并依次將這兩個病毒感染CHO細胞,使CHO細胞能夠同時高表達人R-spondin1和人Noggin兩個基因,并且在mRNA和蛋白水平上驗證。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,包括:人R-spondin1和人Noggin兩個基因的慢病毒載體構(gòu)建:選擇EcoRI和BamHI兩個酶切位點,將R-spondin1和Noggin兩個基因CDS區(qū)擴增出來,其中:

PCR擴增R-spondin1基因的上游引物為:SEQ.ID.NO.1;

PCR擴增R-spondin1基因的下游引物為:SEQ.ID.NO.2;

PCR擴增Noggin基因的上游引物為:SEQ.ID.NO.3;

PCR擴增Noggin基因的下游引物為:SEQ.ID.NO.4;

將這兩個基因全長分別連接到表達質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin,采用大腸桿菌DH5α進行轉(zhuǎn)化擴增質(zhì)粒;并分別命名為pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-puromycin-Noggin。

4.如權(quán)利要求1所述的CHO-Rspon-Noggin細胞株的應用,其特征在于,收集R-spondin1和Noggin兩個細胞因子,包括正常培養(yǎng)CHO-Rspon-Noggin細胞,細胞生長到100%后按1:10比例傳代,待細胞生長到100%后將培養(yǎng)基換成無血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)一周后收集培養(yǎng)基,用0.22um的濾器過濾培養(yǎng)液,于-80℃保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO-Rspon-Noggin細胞株的應用,其特征在于,采用CHO-Rspon-Nog細胞株收集的細胞上清液配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)小鼠和人腸道隱窩及腫瘤組織,包括按照不同比例配制隱窩培養(yǎng)基進行隱窩的3D培養(yǎng)并生長成與來源相似的類器官組織。

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