本發(fā)明涉及一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化的基質(zhì)材料。

背景技術(shù)：

最近的證據(jù)表明，骨髓間充質(zhì)干細胞可以跨分化為神經(jīng)外胚層細胞。這已經(jīng)引起了科學界用骨髓間充質(zhì)干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性變和自身免疫性疾病巨大的興趣。骨髓細胞容易獲得，不僅克服利用胎兒組織相關(guān)的倫理和免疫問題而且克服從腦中獲得腦神經(jīng)干細胞的有關(guān)風險。盡管已知骨髓間充質(zhì)干細胞有很多潛能，深入了解這些多能干細胞如何發(fā)育成神經(jīng)細胞仍是一個核心問題。各國科學家在不斷探索如何在體外將骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)系統(tǒng)細胞高效誘導分化。除了多種化學品和細胞因子被用于嘗試啟動骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)分化，細胞外微環(huán)境的特性越來越被認為是影響幼稚骨髓間充質(zhì)干細胞增殖，活力和分化的相關(guān)細胞刺激。研究表明，細胞外基質(zhì)的表面化學、剛度和納米形貌都對控制骨髓間充質(zhì)干細胞的命運起著重要的作用。能夠容納骨髓間充質(zhì)干細胞生長并誘導其分化成特定譜系的優(yōu)化支架在各種組織工程和細胞治療應用中是非?？扇〉?。在這里，我們報告如何通過煙草花葉病毒產(chǎn)生的納米形貌結(jié)合多價異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽抗原決定簇顯示與神經(jīng)誘導劑維甲酸協(xié)同啟動骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞表型分化，從而在大鼠脊髓全橫斷后誘導強健的源自骨髓間充質(zhì)干細胞神經(jīng)形成。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化的基質(zhì)材料。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下所述：

利用煙草花葉病毒(TMV)的自然結(jié)構(gòu)特征通過重氮偶聯(lián)和Cu(I)催化疊氮-炔的1,3-偶極環(huán)加成(CuAAC)兩步反應在其殼體Y139基團鉚接IKVAV配體將其開發(fā)成一種MSC神經(jīng)形成優(yōu)化支架，稱為TMV-IKVAV納米管,如示意圖1所示。

上述技術(shù)方案中，所述的IKVAV配體是異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽抗原決定簇；所述的煙草花葉病毒通過市售途徑獲得或可采用植物病毒學方法從感染煙草花葉病毒的煙草葉中提取得到，具體提取方法可參照Gooding GV Jr和Hebert TT所公開的方法實施(Gooding GV Jr,Hebert TT,A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities,Phytopathology,1967,57(11):1285)。

上述TMV-IKVAV納米管的制備方法由以下步驟組成：

(1)按植物病毒學方法從感染煙草花葉病毒的煙草葉中提取煙草花葉病毒，然后將其加入到緩沖液中，使煙草花葉病毒在穩(wěn)定液中的重量濃度為15-30mg/mL，得到含煙草花葉病毒的儲存液；

(2)取3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽；

(3)TMV與3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽在4℃pH 9的緩沖溶液中處理形成炔烴接枝TMV粒子2。

(4)溴-端基GIKVAV用NaN₃在DMSO衍生化為疊氮-端基GIKVAV 3。

(5)2和3用來通過銅(I)催化疊氮-炔環(huán)加成反應(CuAAC))合成IKVAV接枝TMV粒子(TMV-IKVAV)。作為一個通用的CuAAC反應方案，2mg/ml 2和3mM 3加入含CuSO₄(1mM)和抗壞血酸鈉(2mM)的Tris緩沖(10mM，pH 7.8)溶液中。在4℃孵育18h后，TMV-IKVAV粒子通過蔗糖梯度離心純化。

本發(fā)明所述的TMV-IKVAV納米管可按常規(guī)的方法制成涂層覆在細胞培養(yǎng)基質(zhì)表面，以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化。

具體地，本發(fā)明一個方面提供了一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化的支架粒子，所述支架粒子為煙草花葉病毒與異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽的綴合物。

本發(fā)明的另一個方面提供了上述支架粒子的制備方法，其包括如下步驟：

1)將煙草花葉病毒將加入到緩沖液中，使煙草花葉病毒的重量濃度為15-30mg/ml，得到含煙草花葉病毒的儲存液；

2)取3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽；

3)煙草花葉病毒的儲存液與3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽在處理形成炔烴接枝煙草花葉病毒粒子；

4)將溴-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸六肽用NaN₃衍生化為疊氮-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸六肽；5)將步驟3)所得炔烴接枝煙草花葉病毒粒子和步驟4)所得疊氮-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸六肽加入含CuSO₄和抗壞血酸鈉的Tris緩沖溶液中，在2-10℃下孵育后純化，獲得異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽接枝煙草花葉病毒支架粒子。

本發(fā)明的再一個方面提供了一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化的培養(yǎng)基，其包含煙草花葉病毒或上述的一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化的支架粒子。

進一步地，是將包含煙草花葉病毒或權(quán)利要求1所述的一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化的支架粒子涂覆在氨基丙基三乙氧基甲硅烷涂層基板。

進一步地，其還含維甲酸，優(yōu)選維甲酸的含量為10-50μM，更優(yōu)選為15-30μM。

進一步地，其還含有胎牛血清、青霉素和/或鏈霉素。

本發(fā)明另一個方面提供了上述支架粒子在促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化的應用。

本發(fā)明另一個方面提供了上述的支架粒子在制備促進骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化的培養(yǎng)基的應用。

本發(fā)明另一個方面提供了上述培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的神經(jīng)細胞，以及該神經(jīng)細胞在制備治療神經(jīng)損傷疾病的藥物中的應用。

由于煙草花葉病毒為一種具有一定的剛性的自然分子支架，可近似為一個納米桿，長300nm，直徑18nm，其獨特的形狀類似于主要的細胞外基質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)。此外，TMV其衣殼蛋白外表面提供2130個非?；钴S的酪氨酸-139(Y139)基團，可以很容易地用各種各樣的小分子修飾。因此它提供了一種理想的多價顯示支架能夠沿此納米棒多重顯示活性序列。每個TMV-IKVAV顆粒上有共約2130個IKVAV抗原決定簇。充分研究的TMV結(jié)構(gòu)允許精確控制配體的間距和空間取向，其結(jié)果是，大多數(shù)的抗原決定簇可用于與受體結(jié)合；且IKVAV抗原決定簇在TMV-IKVAV表面上高濃度呈現(xiàn)，進一步促進有效和強大的細胞-配體相互作用和信號轉(zhuǎn)導。

附圖說明

圖1為用IKVAV修飾TMV示意圖。

圖2為天然煙草花葉病毒(17528m/z)，炔衍生物2(17656m/z)和TMV-IKVAV(18380m/z)亞基蛋白的基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)。

圖3a-f為骨髓間充質(zhì)干細胞在TMV，TMV-IKVAV，laminin和APTES基板的行為結(jié)果。

圖4a-f為骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)分化結(jié)果。

圖5a-b為動物實驗五組后肢隨著時間的推移BBB開放場行走評分以及術(shù)后三個月所有五組大鼠的典型表現(xiàn)。

具體實施方式

實施例1誘導分化的基質(zhì)材料的制備

(1)煙草花葉病毒通過市售途徑獲得或按植物病毒學方法從感染煙草花葉病毒的煙草葉中提取，然后將其加入到10mM pH7.4磷酸鹽緩沖液中，使煙草花葉病毒在穩(wěn)定液中的重量濃度為15-30mg/mL，得到含煙草花葉病毒存儲液；

(2)取3-乙炔苯胺原位生成的重氮鹽；

(3)將步驟(1)所得的含煙草花葉病毒緩沖液與3-乙炔苯胺原位生成的重氮鹽在4℃100mM pH 9的硼酸鹽緩沖溶液中處理2小時形成炔烴接枝煙草花葉病毒粒子；

(4)將溴-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(GIKVAV)用NaN₃在DMSO中衍生化為疊氮-端基GIKVAV；

(5)將2mg/ml步驟(3)所得炔烴接枝煙草花葉病毒粒子和3mM步驟(4)所得疊氮-端基GIKVAV加入含CuSO₄(1mM)和抗壞血酸鈉(2mM)的Tris緩沖(10mM，pH 7.8)溶液中，在4℃下孵育18h后通過蔗糖梯度離心純化，獲得IKVAV接枝TMV粒子(TMV-IKVAV)；其基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜見圖2。

(6)氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)涂層基板可由市售途徑獲得，將IKVAV接枝TMV粒子涂覆到細胞培養(yǎng)APTES基板表面形成致密層，獲得APTES-TMV-IKVAV基板。同時，也將TMV粒子和層粘連蛋白(laminin)分別涂覆到APTES基板表面，分別得到APTES-TMV和APTES-laminin基板。

實施例2骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)，粘附和鋪展研究

(1)實驗方法

初級骨髓間充質(zhì)干細胞是從80g Sprague-Dawley大鼠的骨髓中分離。該程序是按照南方醫(yī)科大學動物護理和倫理委員會動物實驗的指導方針進行。MSC在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素的完全DMEM培養(yǎng)基中，在37℃濕潤的5％CO ₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在生長階段(約90％匯合)的骨髓間充質(zhì)干細胞單層用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化2分鐘從培養(yǎng)板上剝離，并重新懸浮于完全培養(yǎng)基中用于隨后的細胞粘附研究。

APTES-TMV，APTES-TMV-IKVAV，APTES-laminin和APTES基板(10×10mm²)放入6孔板；在完全DMEM溶液中2mL骨髓間充質(zhì)干細胞密度為1×10⁵個/mL細胞懸浮液加入到6孔板的每個孔中，并在濕潤的5％CO₂培養(yǎng)箱中于37℃保溫。在接種后2小時和24小時分別檢查細胞在預涂基板粘附和鋪展，在玻片上的非貼壁細胞通過用PBS洗滌去除，貼壁細胞用甲醛固定和蘇木精-伊紅染色，得到染色的細胞顯微照片。用INFINITY分析軟件(lumenera公司，渥太華，加拿大)進行細胞形態(tài)學分析。使用單因素方差分析SNK-q檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05的值被認為是顯著。

(2)實驗結(jié)果

實驗結(jié)果見圖2。由圖2可見，骨髓間充質(zhì)干細胞附著在TMV-IKVAV表面比TMV，laminin和APTES基質(zhì)多4倍，附著增加有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；與在TMV，Laminin和APTES上的培養(yǎng)相比，TMV-IKVAV上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖加快，24小時達到高匯合，TMV-IKVAV細胞密度增加達到近四倍，表明在TMV的表面引入高密度IKVAV抗原決定簇有利于更好的細胞粘附和增殖。

實施例3骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化實驗

(1)實驗方法

神經(jīng)預誘導培養(yǎng)基為含10％胎牛血清，1％青霉素/鏈霉素和15μM維甲酸的DMEM培養(yǎng)基。神經(jīng)誘導培養(yǎng)基為含10％胎牛血清，1％青霉素/鏈霉素和30μM維甲酸的DMEM培養(yǎng)基。兩種方案被用來評估神經(jīng)源性分化。在方案一中，骨髓間充質(zhì)干細胞以1×10⁵細胞/毫升在原代培養(yǎng)基中接種在APTES-TMV，APTES-TMV-IKVAV，APTES-laminin和APTES基板上24小時，接著用預誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，然后將培養(yǎng)基替換為含30μM視黃酸的神經(jīng)誘導培養(yǎng)基。在方案二中，骨髓間充質(zhì)干細胞在神經(jīng)誘導培養(yǎng)基中在ATI基板上以1×10⁵cells/mL接種和培養(yǎng)兩周，每3天換一次培養(yǎng)基。非誘導對照MSCs在同一時間內(nèi)只喂含10％小牛血清和1％青霉素/鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

(2)實驗結(jié)果

骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)誘導分化(方案一)實驗結(jié)果見圖3。由圖3可見，TMV-IKVAV基質(zhì)快速促進大量的神經(jīng)突起生長，遠遠超過了在TMV、層粘連蛋白、APTES基板上所觀察到的。實時熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，在TMV-IKVAV基質(zhì)上向神經(jīng)分化的MSCs中Otx1呈27.4倍上調(diào)，比在煙草花葉病毒、層粘連蛋白和APTES基質(zhì)上的表達高3倍多，此外，TMV-IKVAV基質(zhì)上的細胞nestin的表達也比在TMV，laminin和APTES基質(zhì)上的細胞上調(diào)2-3倍。也就是說，正如所期望的，TMV-IKVAV顯著上調(diào)Otx1和nestin表達。

實施例4脊髓橫斷大鼠移植向神經(jīng)誘導分化骨髓間充質(zhì)干細胞動物實驗

(1)實驗方法

所有的動物實驗由南方醫(yī)科大學動物護理和倫理委員會批準(ACEC，SMU)。共有30只成年SD大鼠(150-200g)為研究對象。將大鼠麻醉，在顯微鏡下進行完全的T10橫斷損傷產(chǎn)生的一個2.0mm的完全橫斷腔，病變腔仔細地檢查，確保腹側(cè)和橫向完全橫斷病變。動物隨機分為五組，每組6只，如下：組1，在脊髓損傷部位注射0.1ml生理鹽水，作為非治療對照組，稱為損傷對照(LC)組；組2，在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細胞/毫升在TMV板上培養(yǎng)的似神經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細胞，命名為TMV組；組3，在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細胞/毫升在TMV-IKVAV板上培養(yǎng)的神經(jīng)源性骨髓間充質(zhì)干細胞，命名為TMV-IKVAV組；組4，在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細胞/毫升在Laminin板上培養(yǎng)的神經(jīng)源性骨髓間充質(zhì)干細胞，命名為Laminin組；組5,在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細胞/毫升在APTES板上培養(yǎng)的神經(jīng)源性骨髓間充質(zhì)干細胞，命名為APTES組。逐層縫合關(guān)閉切口。手術(shù)后，大鼠分籠飼養(yǎng)，在12h光/暗周期獲得食物和水自由采食?？股亟o藥，每天兩次，持續(xù)兩周和膀胱輕輕按摩手動清空直至反射性膀胱排空約10天后恢復。

行為評價是以開放場BBB評分系統(tǒng)進行(Basso等人，1995，1996)。在一個開放場(75×120厘米)，動物的行為，由兩名研究人員觀察。從0(完全癱瘓)到21(正常步態(tài))的分數(shù)，在手術(shù)后的第一個星期每天記錄，此后每周三次，直到手術(shù)后13周。

(2)實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，LC組導致永久性癱瘓和損傷部位以下的感覺喪失。APTES組和Laminin組后肢運動恢復慢，在3個月的過程中，左、右后肢BBB評分沒有比4更高的；且Laminin組大鼠術(shù)后背部皮膚反復脫毛，進食少，蜷縮畏寒；而APTES組大鼠出現(xiàn)明顯駝背。相比之下，TMV-IKVAV組大鼠術(shù)后第二周后肢肚關(guān)節(jié)即可向前彎曲，BBB評分最高，并在康復期繼續(xù)穩(wěn)步上升至3個月時BBB評分達12.2-16.4，且后肢肌無萎縮，無鼓槌指，很活躍，能跨上籠壁伸展身體。TMV組能慢步跛行，緩慢扶籠壁站立，康復情況優(yōu)于Laminin組和APTES組，但不及TMV-IKVAV組。

在本研究中，TMV納米管被設(shè)計用來向骨髓間充質(zhì)干細胞多價呈遞促進神經(jīng)突起抗原決定簇IKVAV。我們的研究表明TMV-IKVAV可以用于增強骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附和增殖，并能促進其向神經(jīng)誘導分化；在TMV-IKVAV上骨髓間充質(zhì)干細胞衍生的神經(jīng)性細胞移植入嚴重脊髓損傷部位可以整合入宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)并促進恢復神經(jīng)連接。我們的研究結(jié)果勾勒出一種形式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生，對治療外傷性脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。