本發(fā)明是關(guān)于一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞及其用于生產(chǎn)BsAb抗體的方法，具體而言，本發(fā)明涉及基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞、其制備方法、以及通過(guò)基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)雙特異性單鏈抗體的方法。

背景技術(shù)：

人體的免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)和殺傷性T細(xì)胞(Cytokine induced killer)扮演著重要的角色，它們擁有T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)，能夠?qū)Ρ磉_(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞進(jìn)行特異識(shí)別與結(jié)合，并分泌穿孔素和顆粒酶，從而殺滅病原靶細(xì)胞。但是，癌細(xì)胞等病變區(qū)域常表現(xiàn)為抗原表達(dá)缺陷、缺少免疫粘附分子和共刺激分子等物質(zhì)，使得機(jī)體免疫識(shí)別功能“喪失”。近年來(lái)，依照基因重組方法構(gòu)建的雙靶向抗體(Bispecificantibody,BsAb)，能夠同時(shí)與T細(xì)胞和癌細(xì)胞特異性抗原結(jié)合，并激活T細(xì)胞免疫機(jī)制，實(shí)現(xiàn)“雙靶向抗體介導(dǎo)T細(xì)胞重新定向的抗癌效應(yīng)作用”(Anticancer effectors of BsAb-Retargeting T cell)。這種BsAb抗體協(xié)助功能性T細(xì)胞重新定位病變靶點(diǎn)，恢復(fù)了自體免疫功能。

目前臨床治療中，所使用的BsAb抗體主要通過(guò)體外基因工程生產(chǎn)，經(jīng)蛋白純化后由人體靜脈注射，最終只能依靠血液循環(huán)將BsAb抗體遞送到靶區(qū)域。這種方法獲取的BsAb抗體極易在溫度變化下失活、并且該治療方法費(fèi)用昂貴；同時(shí)，BsAb抗體半衰期較短，因此降低了與靶細(xì)胞的接觸概率，以至于無(wú)法形成理想的治療效果。

另一方面，應(yīng)用干細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和蛋白已有相關(guān)報(bào)道。目前，對(duì)干細(xì)胞的基因修飾方法中大部分都選用病毒載體，如慢病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒載體轉(zhuǎn)染雖然能提高干細(xì)胞基因修飾的效率，但由于病毒的安全性問(wèn)題，使得這種方法存在一定的局限性，如對(duì)操作環(huán)境的要求嚴(yán)格，如感染后病毒基因可能隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組，從而破壞細(xì)胞基因組，造成致癌風(fēng)險(xiǎn)，況且病毒載體應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)其轉(zhuǎn)染效率是不高的，因?yàn)闄C(jī)體本身會(huì)啟動(dòng)沉默病毒功能的機(jī)制。此外，現(xiàn)有的應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn) 行基因轉(zhuǎn)染產(chǎn)生細(xì)胞因子和蛋白的研究方法所產(chǎn)生的蛋白和功能因子分子量相對(duì)較低，并且多見(jiàn)于應(yīng)用核糖核酸類(RNA)如mRNA作為基因載體。

目前尚未見(jiàn)到應(yīng)用干細(xì)胞生產(chǎn)分子量較大的雙特異性單鏈抗體的類似報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞創(chuàng)建生物活性載體，提供一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法與用于生產(chǎn)BsAb抗體的方法，從而進(jìn)一步可利用間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性遷移至治療區(qū)域，通過(guò)細(xì)胞自身分泌BsAb抗體進(jìn)而提高免疫治療效果。

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)來(lái)源于間質(zhì)組織，具備多向分化、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制更新功能。并且，在外界因素作用下，表現(xiàn)出趨向損傷和癌變病變組織的定向遷移能力(歸巢性能)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，將干細(xì)胞構(gòu)建成BsAb抗體的“生產(chǎn)工廠”和靶向性遞送系統(tǒng)，借助干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)將抗體遞送至病變區(qū)域，完成針對(duì)如癌癥等疾病的干細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療(Stem-cell Driven Cancer-targeted Immunotherapy)。

一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，其是利用攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞而得到的。該基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效分泌雙特異性單鏈抗體。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞可以來(lái)源于脂肪、臍帶、胎盤、骨髓、子宮內(nèi)膜或牙髓等。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，是利用非病毒類基因載體承載BsAb抗體基因，這些非病毒載體可以選自質(zhì)粒DNA(Plasmid DNA，下文縮寫為DNA)或微環(huán)質(zhì)粒DNA(Minicircle Plasmid DNA,下文縮寫為MCDNA)等。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，所述BsAb抗體可以選自antiCD19×antiCD3、antiCD20×antiCD3、antiEGFR×antiCD3、antiGPC3×antiCD3、antiEpCAM×antiCD3、anticMet×antiCD3、antiEGFRvIII×antiCD3、antiIGF1R×antiCD3、antiCD44v6×antiCD3或antiPDL-1×antiCD3等。不限于以上所述的序列模式，同樣適用于antiCD3×anti“靶點(diǎn)”的序列模式。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，該方法包括：

將攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞，完成對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾，得到基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，是利用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法、或電穿孔轉(zhuǎn)染方法實(shí)現(xiàn)針對(duì)干細(xì)胞的基因修飾。具體而言，所述化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑可以包括：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(如Invitrogen公司的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑)，聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑(如聚乙烯亞胺、聚氨基酯、殼聚糖等)，或是無(wú)機(jī)納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑、有機(jī)納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑、或無(wú)機(jī)有機(jī)雜化納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑(如磁性納米顆粒、磷酸鹽納米顆粒等)。所述電穿孔轉(zhuǎn)染方法可以為常規(guī)電轉(zhuǎn)儀操作方法。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞用于生產(chǎn)BsAb抗體中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)BsAb抗體的方法，該方法包括：

培養(yǎng)本發(fā)明所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞以分泌表達(dá)雙特異性單鏈抗體。具體地，所述培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂靜置培養(yǎng)。其中優(yōu)選的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。采用本發(fā)明的方法，通常在培養(yǎng)72-96小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)可持續(xù)表達(dá)雙特異性單鏈抗體，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了BsAb的持續(xù)供給。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的生產(chǎn)BsAb抗體的方法還包括將攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞完成對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾的過(guò)程。如前所述，可以是利用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法、或電穿孔轉(zhuǎn)染方法實(shí)現(xiàn)針對(duì)干細(xì)胞的基因修飾。所述化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑可以包括：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(如Invitrogen公司的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑)，聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑(如聚乙烯亞胺、聚氨基酯、殼聚糖等)，或是無(wú)機(jī)納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑、有機(jī)納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑、或無(wú)機(jī)有機(jī)雜化納米顆粒轉(zhuǎn)染試劑(如磁性納米顆粒、磷酸鹽納米顆粒等)。所述電穿孔轉(zhuǎn)染方法可以為常規(guī)電轉(zhuǎn)儀操作方法。

根據(jù)本發(fā)明的更具體實(shí)施方案，本發(fā)明的生產(chǎn)BsAb抗體的方法可以按照下述方法中的任意一種進(jìn)行：

方法一：將具有抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA或微環(huán)MCDNA 4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時(shí)Lipofectamine2000基因轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen公司)10μl加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min后，用移液器將質(zhì)粒溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成Lipofectamine2000基因載體復(fù)合物。將間充質(zhì)干細(xì)胞以每孔5×10⁵個(gè)/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個(gè)細(xì)胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70％，更換opti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后每孔加入200μl基因載體復(fù)合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時(shí)后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

方法二：將具有抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA或微環(huán)MCDNA 4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時(shí)取適量的聚陽(yáng)離子納米顆粒,如ε-己內(nèi)酯修飾的改性聚乙烯亞胺(專利申請(qǐng)?zhí)?01310390436.1)，溶解于opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl配制成轉(zhuǎn)染劑溶液，靜置5min后，用移液器將質(zhì)粒溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成納米復(fù)合物。將人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞以每孔5×10⁵個(gè)/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個(gè)細(xì)胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70％，更換為opti-MEM培養(yǎng)基800μl/孔，然后每孔加入200μl納米復(fù)合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時(shí)后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

方法三：將18μl Supplement溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]與82μl NucleofectorTM溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]充分混勻，構(gòu)成電轉(zhuǎn)液(100μl體系/電轉(zhuǎn)杯)；用胰酶消化間充質(zhì)干細(xì)胞，使其從培養(yǎng)皿壁上脫落下來(lái)，離心(1000rpm，5min)，棄去上清，用100μl電轉(zhuǎn)液將間充質(zhì)干細(xì)胞重新懸浮，使其密度達(dá)到1×10⁷個(gè)/ml；向100ul間充質(zhì)干細(xì)胞重懸液中加入6μg具有抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA或微環(huán)MCDNA，用移液槍輕輕混勻，使細(xì)胞同質(zhì)粒充分混勻；將混合液加入到電轉(zhuǎn)杯中，使用Lonza公司生產(chǎn)的AmaxaTM4D-NucleofectorTM細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀，選取轉(zhuǎn)染儀U-023程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將提前預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液加入電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min，用吸管輕輕吸出，加入到6孔盤培養(yǎng)皿中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基更換，繼續(xù)培養(yǎng)。

采用本發(fā)明的方法，應(yīng)用干細(xì)胞作為BsAb抗體生產(chǎn)工廠，可在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)持續(xù)分泌表達(dá)BsAb抗體。

綜上所述，本發(fā)明中，主要是利用攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體，借助化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑及電轉(zhuǎn)染方法，完成對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾，將干細(xì)胞構(gòu)建成BsAb抗體的“生產(chǎn)工廠”和遞送系統(tǒng)與分泌系統(tǒng)，本發(fā)明與現(xiàn)有BsAb的臨床應(yīng)用技術(shù)相比，其有益效果主要表現(xiàn)為：

(1)現(xiàn)有臨床應(yīng)用中BsAb抗體主要通過(guò)基因工程生產(chǎn)，為防止免疫熱源等有毒物質(zhì)的危害必須經(jīng)蛋白純化后注入體內(nèi)，并且BsAb抗體極易在溫度變化下失活因此增加了保存難度。而本發(fā)明應(yīng)用干細(xì)胞作為BsAb抗體生產(chǎn)工廠，可以將被轉(zhuǎn)染干細(xì)胞注射，減少了純化環(huán)節(jié)；

(2)臨床應(yīng)用中BsAb抗體只能依靠血液循環(huán)將BsAb抗體遞送到靶區(qū)域，然而現(xiàn)有研究表明腫瘤等病灶的微環(huán)境十分復(fù)雜，如實(shí)體腫瘤常表現(xiàn)出瘤內(nèi)的內(nèi)部高壓，這使得體液中的抗體難以進(jìn)入病灶區(qū)域。而本發(fā)明將干細(xì)胞作為BsAb抗體生產(chǎn)工廠，利用間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤等病灶的主動(dòng)趨化歸巢遷移行為，到達(dá)目標(biāo)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)BsAb抗體的遞送；

(3)BsAb抗體體內(nèi)半衰期較短(小于12小時(shí))，因此降低了與靶細(xì)胞的接觸概率，以至于無(wú)法形成理想的治療效果；而本發(fā)明應(yīng)用干細(xì)胞作為BsAb抗體生產(chǎn)工廠，可以在一定時(shí)期內(nèi)(試驗(yàn)檢測(cè)72-96小時(shí))持續(xù)表達(dá)，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了BsAb的持續(xù)供給；

(4)本發(fā)明摒棄了常規(guī)的病毒載體，選用了非病毒基因載體來(lái)完成干細(xì)胞基因修飾，解決了體內(nèi)應(yīng)用可行性的問(wèn)題；

(5)本發(fā)明中創(chuàng)新地使用了質(zhì)粒DNA和微環(huán)MCDNA作為BsAb的基因載體對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，DNA質(zhì)粒和微環(huán)MCDNA性質(zhì)穩(wěn)定，且微環(huán)MCDNA生物安全性高并且能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)；

(6)本發(fā)明中借助干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗體分泌，干細(xì)胞作為“生產(chǎn)工廠”產(chǎn)生分子量較大的雙特異性單鏈抗體，生物效應(yīng)持久，動(dòng)員大量的免疫細(xì)胞完成對(duì)靶標(biāo)的免疫攻擊，并且干細(xì)胞能夠歸巢至腫瘤或病灶部位，從而可形成干細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療(Stem-cell Driven Cancer-targeted Immunotherapy)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的技術(shù)方案的流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中所用載體SZ63.pMC.ZY781.CMVmax.intron.bpA基因圖譜。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中改造后得到重組質(zhì)粒SZ66.pMC.ZY781.CMVmax.intron.CD20Bite.bpA基因圖譜。

圖4為L(zhǎng)ipofectamine2000/質(zhì)粒DNA對(duì)人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，上清培養(yǎng)基中antiCD20×antiCD3 BsAb抗體的western blot檢測(cè)結(jié)果。

圖5為針對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用Lipofectamine2000介導(dǎo)質(zhì)粒DNA和微環(huán)MCDNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染96小時(shí)后，對(duì)上清培養(yǎng)基中antiCD20×antiCD3 BsAb抗體的western blot檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)具體實(shí)施例并配合附圖進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

請(qǐng)參見(jiàn)圖1所示，本發(fā)明的技術(shù)方案中，主要是利用化學(xué)試劑-基因轉(zhuǎn)染方法、或是電穿孔轉(zhuǎn)染方法，將攜帶BsAb抗體基因的非病毒載體轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞，得到基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，然后培養(yǎng)所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞以分泌表達(dá)雙特異性單鏈抗體。

實(shí)施例1、針對(duì)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染

(1)制備Lipofectamine2000/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物

a、含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA的制備

本實(shí)施例中，先利用分子生物學(xué)方法將antiCD20×antiCD3基因序列(SEQ ID No.1，該序列是在人源化單抗anti-CD20序列的基礎(chǔ)上改造而成雙特異性單鏈抗體序列。antiCD20序列來(lái)源于：GA101(Obinutuzumab，羅氏Roche)，antiCD3部分來(lái)源于專利US008076459)克隆到載體SZ63.pMC.ZY781.CMVmax.intron.bpA.(由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院醫(yī)藥所基因與細(xì)胞治療研究室提供，其詳細(xì)譜圖如圖2所示，序列如SEQ ID No.2(人工序列)所示，其中藥物篩選標(biāo)記為卡那霉素Kanamycin)，改造后得到重組質(zhì)粒SZ66.pMC.ZY781.CMVmax.intron.CD20Bite.bpA(6880bp)如圖3，該重組質(zhì)粒即為含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因質(zhì)粒DNA antiCD20×antiCD3序列。具體制備過(guò)程如下：

利用上下游引物,其中PCR引物序列：(5’-3’)正向： GAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATC(SEQ ID No.3)；反向：TGAGTCGACCTAATGATGATGGTGATGA(SEQ ID No.4)和含有目的基因序列模板(antiCD20×antiCD3序列：SEQ ID No.1)使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)大量擴(kuò)增該基因序列，而后利用TaKaRa膠回收試劑盒純化回收得到較高純度的目的基因；利用雙酶切方法對(duì)載體SZ63.pMC.ZY781.CMVmax.intron.bpA及目的基因進(jìn)行處理，在37℃條件下進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)為Nhe I和Sal I，酶切后利用TaKaRa膠回收試劑盒經(jīng)過(guò)膠回收得到純度較高的載體片段及目的基因片段；酶切后載體片段和目的基因序列，載體片段與目的基因片段按物質(zhì)的量比1:3混勻，在16℃條件下借助TAKARA T4連接酶連接載體片段和目的基因；獲得得到克隆重組質(zhì)粒DNA；將連接得到克隆重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，10ul重組質(zhì)粒輕輕加入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，輕柔混勻，在冰上放置30分鐘而后置于42℃條件下90秒鐘，再置于冰上5分鐘，加入500ul LB培養(yǎng)基混勻，置于37℃，220rpm條件下擴(kuò)增1小時(shí)，最后涂在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)16小時(shí)；而后，在LB培養(yǎng)板上挑取單克隆，按照質(zhì)粒提取試劑盒方法，搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，得到含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA，即圖3所示重組質(zhì)粒SZ66.pMC.ZY781.CMVmax.intron.CD20Bite.bpA(6880bp)；

b、制備Lipofectamine2000/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備

將具有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時(shí)Lipofectamine2000基因轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)10μl加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min后，用移液器將質(zhì)粒溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成Lipofectamine2000/質(zhì)粒DNA復(fù)合物。

(2)針對(duì)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染

人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(深圳南山醫(yī)院提供)以每孔5×10⁵個(gè)/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個(gè)細(xì)胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70％，更換opti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后每孔加入200μl含有Lipofectamine2000/質(zhì)粒DNA復(fù)合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時(shí)后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，取上清液保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

同時(shí)按照上述方法設(shè)定陰性對(duì)照組，應(yīng)用含有eGFP(綠色熒光蛋白)表達(dá)基因的PMAX質(zhì)粒(編號(hào)PMAX-eGFP，購(gòu)置于Lonza公司)構(gòu)建Lipofectamine2000/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，96小時(shí)后采集的細(xì)胞的上清培養(yǎng)液成分，進(jìn)行蛋白鑒定。

(3)對(duì)針對(duì)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染BsAb，對(duì)細(xì)胞的上清培養(yǎng)液中蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)。其步驟如下：

(A)SDS-PAGE凝膠配制，先制備分離膠，待膠凝固后，配制濃縮膠，按照下述

配方配制：

10％分離膠：

濃縮膠：

(B)制樣及電泳

從-80℃冰箱取出細(xì)胞上清樣品，4℃融化后，取100μl上清，加入25μl 5×SDS-loading buffer，混勻后100℃煮10min。冷卻至室溫，上樣至加樣孔內(nèi)。80-120V電泳90min。

(C)轉(zhuǎn)膜后封閉孵育抗體

PVDF用甲醇活化5min后，將膠和膜固定在bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕法轉(zhuǎn)膜裝置內(nèi)，轉(zhuǎn)膜電流為300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1h。轉(zhuǎn)膜完畢，將膜取出在TBST洗滌液中洗滌1min，加入至5％的脫脂奶粉中封閉1h。封閉完成后，用TBST洗滌3次，每次5min后，加入MonoclonalM2antibody(1:500，sigma-aldrich)一抗于4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌一抗3次，每次5min，加入Goat anti-mouse-HRP(1:3000，Abcam)二抗溶液，室溫孵育1h，用TBST洗滌一抗5次，每次5min。

(D)ECL法檢測(cè)蛋白

500μl Thermo Pierce ECL Western Blotting Substrate顯影底物加至膜上，用凝膠成像儀捕捉化學(xué)發(fā)光條帶，成像30s-2min。

檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。應(yīng)用ANTI-FLAG抗體(購(gòu)置于Sigma-Aldrich公司)對(duì)蛋白進(jìn)行識(shí)別。陽(yáng)性對(duì)照組(Psitive control)為antiCD20×antiCD3 BsAb抗體標(biāo)準(zhǔn)品；陰性對(duì)照組(PMAX-eGFP)，其為應(yīng)用攜帶含有eGFP(綠色熒光蛋白)表達(dá)基因的PMAX質(zhì)粒(購(gòu)置于Lonza公司)，構(gòu)建Lipofectamine2000/DNA復(fù)合物針對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)上清液的蛋白鑒定。其中轉(zhuǎn)染步驟與實(shí)施例1相同；實(shí)驗(yàn)組為將具有antiCD20×antiCD3表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA構(gòu)建成Lipofectamine2000/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)上清液的蛋白鑒定。結(jié)果顯示干細(xì)胞表達(dá)的antiCD20×antiCD3 BsAb抗體與標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)在同一個(gè)條帶位置，證實(shí)轉(zhuǎn)染成功，干細(xì)胞可以分泌抗體。

實(shí)施例2、針對(duì)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染

將18μl Supplement溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]與82μl NucleofectorTM溶液[P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit，Lonza公司]充分混勻，構(gòu)成電轉(zhuǎn)液(100μl體系/電轉(zhuǎn)杯)；用胰酶消化間充質(zhì)干細(xì)胞(深圳南山醫(yī)院提供)，使其從培養(yǎng)皿壁上脫落下來(lái)，離心(1000rpm，5min)，棄去上清，用100μl電轉(zhuǎn)液將間充質(zhì)干細(xì)胞重新懸浮，使其密度達(dá)到1×10⁷個(gè)/ml；向100μl間充質(zhì)干細(xì)胞重懸液中加入6μg具有antiCD20×antiCD3-BsAb抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA質(zhì)粒(質(zhì)粒制備參見(jiàn)實(shí)施例1)，用移液槍輕輕混勻，使細(xì)胞同質(zhì)粒充分混勻；將混合液加入到電轉(zhuǎn)杯中，使用Lonza公司生產(chǎn)的AmaxaTM4D-NucleofectorTM細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀，選取轉(zhuǎn)染儀U-023程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將提前預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液加入電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min，用吸管輕輕吸出，加入到6孔盤培養(yǎng)皿中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后用含10％ 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基更換，而后加入10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)(期間不進(jìn)行換液)，而后收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，收集上清培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白鑒定。檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖5。

實(shí)施例3、針對(duì)人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行納米復(fù)合物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染

將具有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA質(zhì)粒(質(zhì)粒制備參見(jiàn)實(shí)施例1)4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時(shí)取適量的ε-己內(nèi)酯修飾的改性聚乙烯亞胺(專利申請(qǐng)?zhí)?01310390436.1)溶解于opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl配制成轉(zhuǎn)染劑溶液，靜置5min后，用移液器將質(zhì)粒溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物。

人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞以每孔5×10⁵個(gè)/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個(gè)細(xì)胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70％，更換weiopti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后每孔加入200μl含有質(zhì)粒DNA納米復(fù)合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時(shí)后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，而后在37℃、5％CO₂、含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)(期間不進(jìn)行換液)，而后收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，收集上清培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白鑒定。檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖5。

實(shí)施例4、針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行微環(huán)DNA(MCDNA)和質(zhì)粒DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染

(1)制備Lipofectamine2000/MCDNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物

a、含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的MCDNA的制備

本實(shí)施例中所用的含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的MCDNA，為針對(duì)含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)得到攜有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的MCDNA。其具體制備過(guò)程如下：

將常規(guī)方法成功構(gòu)建的antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌(菌株名稱DH5α，全式金公司)種加入2ml的TB培養(yǎng)基(含有卡那霉素50μg/ml)，在37℃，250rpm條件下震蕩培養(yǎng)，5小時(shí)后對(duì)其中1ml菌液按照質(zhì)粒提取試劑盒方法進(jìn)行質(zhì)粒提?。?/p>

將上述質(zhì)粒DNA的剩余大腸桿菌液100ul加入到400ml的TB培養(yǎng)基中(含有卡 那霉素50μg/ml)，于37℃，250rpm條件下震蕩培養(yǎng)過(guò)夜不超過(guò)16小時(shí)；

而后向400ml攜帶有上述質(zhì)粒DNA的大腸桿菌液中加入微環(huán)誘導(dǎo)混合試劑(400ml LB培養(yǎng)基中含有1N NaOH，20％Arabinose，具體參見(jiàn)表1)，再置于32℃，250rpm條件下振蕩搖菌5-8小時(shí)；將菌液置于6000-rpm，4℃，離心10分鐘，而后利用Qiagen質(zhì)粒提取大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，最后獲得含有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的MCDNA。

表1、微環(huán)誘導(dǎo)混合試劑(ml)

b、Lipofectamine2000/MCDNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備

將具有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒MCDNA4μg加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min；同時(shí)Lipofectamine2000基因轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)10μl加入至適量的opti-MEM培養(yǎng)基中，終體積為100μl，靜置5min后，用移液器將質(zhì)粒溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液輕柔上下吹吸混合，室溫放置30min，制成Lipofectamine2000/MCDNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

(2)針對(duì)人源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染

人源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(深圳南山醫(yī)院提供)以每孔5×10⁵個(gè)/ml的密度接種于6孔板中(每孔5×10⁵個(gè)細(xì)胞)，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70％，換opti-MEM培養(yǎng)基800ul/孔，然后，每孔加入200μl含有Lipofectamine2000/MCDNA的復(fù)合物。在37℃、5％CO₂條件下孵育4小時(shí)后，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)(期間不進(jìn)行換液)，而后收集細(xì)胞上清培養(yǎng)液，4℃，10000rpm離心5min，收集上清培養(yǎng)液進(jìn)行western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)圖5。

參見(jiàn)圖5所示，western blot檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)用ANTI-FLAG抗體對(duì)蛋白進(jìn)行識(shí)別。Western條帶檢測(cè)，從左至右分別為①陽(yáng)性對(duì)照組antiCD20×antiCD3 BsAb抗體標(biāo)準(zhǔn)品；②應(yīng)用Lipofectamine2000/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，針對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染具有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA，antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達(dá)結(jié)果；③應(yīng)用Lipofectamine2000/MCDNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染具有 antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA，antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達(dá)結(jié)果；④應(yīng)用Lipofectamine2000/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染具有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA，96小時(shí)檢測(cè)的細(xì)胞上清培養(yǎng)液中antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達(dá)結(jié)果；⑤應(yīng)用納米DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物針對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染具有antiCD20×antiCD3抗體表達(dá)基因的質(zhì)粒DNA，96小時(shí)檢測(cè)的細(xì)胞上清培養(yǎng)液中antiCD20×antiCD3 BsAb蛋白表達(dá)結(jié)果。結(jié)果表明干細(xì)胞表達(dá)的antiCD20×antiCD3 BsAb抗體與標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)在同一個(gè)條帶位置，證DNA和MCDNA在轉(zhuǎn)染試劑和納米粒子體系下轉(zhuǎn)染成功，干細(xì)胞可以分泌抗體。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。