專利名稱：Sod基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性輻射綜合癥(ARS)發(fā)生在臨床腫瘤患者的放療及核恐怖、核事故中，人體中細(xì)胞更新快、代謝迅速的組織對(duì)輻射尤為敏感，如造血組織、腸道組織等。在經(jīng)歷2010年日本福島核泄漏事件后，各國(guó)均開始對(duì)核安全問題重新重視起來。尋找更有效的治療和預(yù)防ARS的治療手段，是關(guān)系到國(guó)家安全、國(guó)民健康的重要任務(wù)。對(duì)于ARS的治療，常規(guī)使用一些支持療法，包括輸血、補(bǔ)液、電解質(zhì)、抗生素以及抗病毒藥物，但治療效果并不明顯。當(dāng) 前，國(guó)內(nèi)外均未開發(fā)出有效的預(yù)防和治療ARS的藥物。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, S0D)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)，能清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基，維持機(jī)體中自由基產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡的一種金屬酶。具有保護(hù)生物體，延緩衰老和治療疾病等作用。由于受到半衰期短，相對(duì)分子量大，不易透過細(xì)胞膜，口服時(shí)易被胃蛋白酶分解等因素的限制，外源SOD很難作為藥用酶廣泛應(yīng)用于臨床中。因此，針對(duì)SOD的轉(zhuǎn)基因治療逐漸成為研究熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是骨髓基質(zhì)中的主要干細(xì)胞,是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞。體外擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)植入體內(nèi)后可長(zhǎng)期存活，仍保持其多向分化潛能，并且在損傷環(huán)境中還可以被誘導(dǎo)擴(kuò)增，參與組織修復(fù)或再生反應(yīng)。當(dāng)前，針對(duì)MSC基因修飾的實(shí)驗(yàn)研究才剛剛興起，國(guó)內(nèi)外尚無基因轉(zhuǎn)染MSC治療ARS的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，發(fā)明人出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，將S0D3基因連接到腺病毒載體中并感染間充質(zhì)干細(xì)胞，得到的EC-SOD過表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)輻射小鼠治療效果良好，可延長(zhǎng)輻射小鼠的存活期，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明提供一種SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括如下步驟
A)將S0D3基因連接到腺病毒載體上，得到重組腺病毒載體；
B)培養(yǎng)293細(xì)胞系，利用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑將重組腺病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞系中，常規(guī)培養(yǎng)10 12天，至293細(xì)胞系完全出現(xiàn)病變效應(yīng)，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并確認(rèn)S0D3基因已成功連接到腺病毒載體上；
C)將腺病毒毒株進(jìn)行大量擴(kuò)增，感染293細(xì)胞系，經(jīng)觀察細(xì)胞出毒后收集腺病毒病毒液，對(duì)其進(jìn)行超濾純化濃縮，測(cè)定上清液中腺病毒的滴度；
D)腺病毒病毒液(S0D3-腺病毒)分別以不同條件感染間充質(zhì)干細(xì)胞，確定感染的最佳條件，得到SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞。采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明方法可得到EC-SOD基因的過表達(dá)的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其胞內(nèi)SOD蛋白含量增多，細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD相對(duì)活性明顯增強(qiáng)；將SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于輻射小鼠的治療，可取得良好的治療效果，可延長(zhǎng)輻射小鼠的存活期。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述腺病毒載體采用穿梭質(zhì)粒pDC315。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn),所述包裝質(zhì)粒采用pBHGloxAEl和3Cre質(zhì)粒載體。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述感染的最佳條件為50M0I病毒液結(jié)合5 μ M HP4短肽。本發(fā)明還提供所述SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性輻射綜合癥的藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是采用本發(fā)明提供的構(gòu)建方法，可得到 EC-SOD過表達(dá)的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其胞內(nèi)SOD蛋白含量增多，細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD相對(duì)活性明顯增強(qiáng)；將SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于輻射小鼠的治療，可取得良好的治療效果，可延長(zhǎng)輻射小鼠的存活期，在制備治療急性輻射綜合癥的藥物方面具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I為GFP標(biāo)記的不同滴度腺病毒病毒液結(jié)合5 μ M ΗΡ4短肽感染MSC結(jié)果示意圖。圖2為MTT法測(cè)定50Μ0Ι腺病毒病毒液與5 μ M ΗΡ4多肽共同感染MSC48小時(shí)細(xì)胞存活率結(jié)果示意圖。圖3為流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)感染與未感染S0D3-腺病毒的MSC表面相關(guān)抗原結(jié)果示意圖。圖4為感染S0D3-腺病毒的MSC分化結(jié)果示意圖。圖5為MSC中EC-SOD過表達(dá)的鑒定結(jié)果示意圖；其中，圖5-Α為Western Blot檢測(cè)MSC中EC-SOD蛋白含量結(jié)果示意圖，圖5-B為酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD的相對(duì)活性結(jié)果示意圖。圖6為5. 5Gy射線輻射小鼠經(jīng)不同種類的干細(xì)胞治療效果示意圖。圖7為5. 8IGy射線輻射小鼠經(jīng)不同種類的干細(xì)胞治療效果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例一 SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建。腺病毒pDC315 載體、pBHGlox Δ El 和 3Cre 均購自 Microbix 公司。將S0D3基因連接到腺病毒PDC315載體上，得到腺病毒pDC315重組載體；培養(yǎng)293細(xì)胞系，利用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑將腺病毒pDC315重組載體與pBHGlox Λ El、3Cre質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞系中，常規(guī)培養(yǎng)11天，至293細(xì)胞系完全出現(xiàn)病變效應(yīng)，收集得到腺病毒毒株，保存毒株，確認(rèn)S0D3基因已成功連接到腺病毒載體上；將腺病毒毒株進(jìn)行大量擴(kuò)增，感染293細(xì)胞系，經(jīng)觀察細(xì)胞出毒后收集腺病毒上清液，對(duì)其進(jìn)行超濾純化濃縮，用TCID50 (半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)的方法測(cè)定上清液中腺病毒的滴度；腺病毒病毒液(S0D3-腺病毒)分別以5、10、30、50、70、100 MOI的滴度梯度感染間充質(zhì)干細(xì)胞，為提高干擾效率，在腺病毒病毒液感染的同時(shí)添加5 μ M的穿膜短肽ΗΡ4，結(jié)果如圖I所示，確定50Μ0Ι為最佳感染滴度，得到SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞。如圖2所示，50Μ0Ι腺病毒病毒液與5 μ MΗΡ4多肽共同感染MSC48小時(shí)，細(xì)胞存活率有一定程度的下降。流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)感染與未感染S0D3-腺病毒的MSC表面相關(guān)抗原結(jié)果，如圖3所示，圖3的結(jié)果說明了經(jīng)S0D3-腺病毒感染后臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特性無顯著變化。感染S0D3-腺病毒的MSC分化結(jié)果如圖4所示，可成功分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。實(shí)施例二 MSC中EC-SOD過表達(dá)的鑒定。在得到合適的腺病毒感染條件后，獲得過表達(dá)EC-SOD的MSC細(xì)胞株，經(jīng)WesternBlot檢測(cè)MSC胞內(nèi)EC-SOD蛋白含量，結(jié)果如圖5-A所示；酶標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD相對(duì)活性，結(jié)果如圖5-B所示。圖5說明腺病毒攜帶的EC-SOD基因成功在MSC中表達(dá)，MSC胞內(nèi)的EC-SOD蛋白含量增多，細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD相對(duì)活性增強(qiáng)。實(shí)施例三SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)輻射小鼠的治療效果。本發(fā)明采用銫137伽瑪射線照射小鼠為輻射損傷模型，每組10只小鼠，小鼠在
5.5Gy射線輻射后4小時(shí)，通過尾靜脈輸入SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行治療，觀察小鼠的存活情況，結(jié)果如圖6所示。其中，UC :臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；UC+Null :空載腺病毒感染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；UC+S0D S0D3-腺病毒感染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；BM :骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，BM+Null :空載腺病毒感染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；BM+ S0D3 :S0D3_腺病毒感染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。S0D3基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞注射量5X105，兩次干細(xì)胞注射治療，其注射間隔時(shí)間為72小時(shí)。其結(jié)果說明，在輻射后通過靜脈輸入間充質(zhì)細(xì)胞(MSC)、經(jīng)腺病毒空載體感染的MSC(MSC-Null)、或S0D3-腺病毒感染的MSC(MSC-SOD)對(duì)延長(zhǎng)輻射小鼠存活期的有一定影響。在各種治療處理中，MSC-SOD組顯示出最好的治療效果，受輻射小鼠的生存期提高44%。采用銫137伽瑪射線照射小鼠為輻射損傷模型，每組10只小鼠，小鼠在5. SlGy射線輻射后3小時(shí)，通過靜脈輸入SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞治療，觀察小鼠的存活結(jié)果，結(jié)果如圖7所示。其中，UC :臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；UC+Null :空載腺病毒感染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；UC+S0D3 S0D3-腺病毒感染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；UC+S0D3兩次以UC+S0D3進(jìn)行兩次注射治療；UC+S0D3三次以UC+S0D3進(jìn)行三次注射治療。S0D3基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞注 射量為5X105，每次注射的間隔時(shí)間為72小時(shí)，結(jié)果表明干細(xì)胞治療以2次效果最佳。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.ー種SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 A)將S0D3基因連接到腺病毒載體上，得到重組腺病毒載體； B)培養(yǎng)293細(xì)胞系，利用Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑將腺病毒重組載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞系中，常規(guī)培養(yǎng)10 12天，至293細(xì)胞系完全出現(xiàn)病變效應(yīng)，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并確認(rèn)S0D3基因已成功連接到腺病毒載體上； C)將腺病毒毒株進(jìn)行大量擴(kuò)增，感染293細(xì)胞系，經(jīng)觀察細(xì)胞出毒后收集腺病毒上清液，對(duì)其進(jìn)行超濾純化濃縮，測(cè)定上清液中腺病毒的滴度； D)腺病毒上清液分別以不同條件感染間充質(zhì)干細(xì)胞，確定感染的最佳條件，得到SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于所述腺病毒載體采用穿梭質(zhì)粒PDC315。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于所述包裝質(zhì)粒采用pBHGloxAEl和3Cre質(zhì)粒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于所述感染的最佳條件為50M0I病毒液結(jié)合5 μ M HP4短肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法構(gòu)建的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療急性輻射綜合癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括如下步驟A)將SOD3基因連接到腺病毒載體上，得到重組腺病毒載體；B)利用轉(zhuǎn)染試劑將重組腺病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞系中，培養(yǎng)至293細(xì)胞系完全出現(xiàn)病變效應(yīng)，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并確認(rèn)SOD3基因已連接到腺病毒載體上；C)將腺病毒毒株擴(kuò)增，感染293細(xì)胞系，收集腺病毒上清液，超濾純化濃縮后測(cè)定滴度；D)腺病毒病毒液分別以不同條件感染間充質(zhì)干細(xì)胞，確定最佳的感染條件，得到SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明方法可得到EC-SOD基因過表達(dá)的SOD基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，將其應(yīng)用于輻射小鼠的治療，可延長(zhǎng)輻射小鼠的存活期。
文檔編號(hào)C12N15/861GK102660580SQ20121015516
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者丁長(zhǎng)才, 劉宗才, 姜新根, 姜舒, 孟繁偉, 李嬋, 李陶, 甘靖毅, 胡祥 申請(qǐng)人:深圳市北科生物科技有限公司