專利名稱：混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物能源和生物催化的技術領域，具體涉及生產生物柴油的微生物混合發(fā)酵法。
背景技術：
生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及動物油脂、餐飲垃圾油等為原料油通過酯交換工藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油是生物質能的一種，它是生物質利用熱裂解等技術得到的一種長鏈脂肪酸的單烷基酯。生物柴油是含氧量極高的復雜有機成分的混合物，這些混合物主要是一些分子量大的有機物，幾乎包括所有種類的含氧有機物，如醚、酯、醛、酮、酚、有機酸、醇等。生物柴油具有如下優(yōu)良特性(I)具有優(yōu)良的環(huán)保特性生物柴油和化石柴油相比含硫量低，使用后可使二氧化硫和硫化物排放大大減少。權威數據顯示，二氧化硫和硫化物的排 放量可降低約30%。生物柴油不含對環(huán)境造成污染的芳香族化合物，燃燒尾氣對人體的損害低于化石柴油，同時具有良好的生物降解特性。和化石柴油相比，柴油車尾氣中有毒有機物排放量僅為1/10，顆粒物為20%，二氧化碳和一氧化碳的排放量僅為10%，排放尾氣指標可達到歐洲II號和III號排放標準。(2)低溫啟動性能和化石柴油相比，生物柴油具有良好的發(fā)動機低溫啟動性能，冷濾點達到-20°C。(3)生物柴油的潤滑性能比柴油好可以降低發(fā)動機供油系統(tǒng)和缸套的摩擦損失，增加發(fā)動機的使用壽命，從而間接降低發(fā)動機的成本。(4)具有良好的安全性能生物柴油的閃點高于化石柴油，它不屬于危險燃料，在運輸、儲存、使用等方面的優(yōu)點明顯。(5)具有優(yōu)良的燃燒性能生物柴油的十六烷值比柴油高，因此燃料在使用時具有更好的燃燒抗暴性能，因此可以采用更高壓縮比的發(fā)動機以提高其熱效率。雖然生物柴油的熱值比柴油低，但由于生物柴油中所含的氧元素能促進燃料的燃燒，可以提高發(fā)動機的熱效率，這對功率的損失會有一定的彌補作用。(6)具有可再生性生物柴油是一種可再生能源，其資源不會像石油、煤炭那樣會枯竭。(7)具有經濟性使用生物柴油的系統(tǒng)投資少，原用柴油的引擎、加油設備、儲存設備和保養(yǎng)設備無需改動。(8)可調和性生物柴油可按一定的比例與化石柴油配合使用，可降低油耗，提高動力，降低尾氣污染。(9)可降解性生物柴油具有良好的生物降解性，在環(huán)境中容易被微生物分解利用。生物柴油的優(yōu)良性能使得采用生物柴油的發(fā)動機廢氣排放指標不僅滿足目前的歐洲II號標準，甚至滿足隨后即將在歐洲頒布實施的更加嚴格的歐洲III號排放標準。而且由于生物柴油燃燒時排放的二氧化碳遠低于該植物生長過程中所吸收的二氧化碳，從而改善由于二氧化碳的排放而導致的全球變暖這一有害于人類的重大環(huán)境問題。因而生物柴油是一種真正的綠色柴油。隨著世界工業(yè)的迅速發(fā)展，石油等化石資源的逐漸枯竭，利用可再生資源生產生物能源的研究越來越受到國內外研究者的關注。纖維素是地球上最豐富的可再生資源，具有價廉、可降解和不污染生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點，因此纖維素的開發(fā)與利用對解決人類面臨的資源和能源危機具有重要意義。纖維素材料可以通過制備成生物柴油的方式轉化成燃料。從生物油脂的元素組成來看，主要是C、H、O元素，與石油基柴油的組成類似，因此生物柴油的開發(fā)利用備受關注。但是，纖維素是以葡萄糖基通過糖苷鍵連接起來的、具有線性結構的高分子化合物，其結構復雜，內部存在大量的晶區(qū)、非晶區(qū)結構和氫鍵，造成了纖維素資源化利用的障礙。纖維素酶酶解纖維素被認為最有效的破壞纖維素的復雜結構，高效利用纖維素材料的方法之一。纖維素酶產生菌能夠分泌纖維素酶降解纖維素成為糖，這些糖可以被微生物利用發(fā)酵成為生物柴油、生物乙醇等能源產品，有助于解決能源危機。

發(fā)明內容
解決的技術問題本發(fā)明針對纖維素酶產生菌雖然能夠高效降解纖維素材料，但是不能用于生產生物柴油等產品；而微生物油脂高產菌不能利用纖維素的技術難題，提供 了一種纖維素降解菌和產油微生物混合發(fā)酵的方式生產生物柴油的方法。技術方案本發(fā)明中，構建立了纖維素降解菌和產油微生物混合發(fā)酵的模式。利用纖維素材料作為碳源，纖維素酶降解菌在培養(yǎng)體系中分泌纖維素酶降解纖維素成為可發(fā)酵的糖，然后在培養(yǎng)體系中加入高產油脂微生物進行混合培養(yǎng)。產油脂微生物利用纖維素酶不斷水解產生的糖作為碳源，得出最佳的產油發(fā)酵條件，經過發(fā)酵制備微生物油脂。然后，利用甲酯化的方法將微生物油脂制備成生物柴油。本發(fā)明涉及的一種纖維素降解菌和產油微生物混合發(fā)酵的模式，按照如下步驟進行(I)采用單因素實驗、正交試驗、響應面分析法等方法篩選并且設計出混合發(fā)酵的培養(yǎng)基，并且得到最佳的培養(yǎng)條件；(2)根據前面的發(fā)酵優(yōu)化條件，利用纖維素材料作為碳源，纖維素降解菌降解纖維素成為可發(fā)酵的糖，然后在培養(yǎng)體系中加入高產油脂微生物進行混合培養(yǎng)。產油微生物利用纖維素酶不斷水解產生的糖作為碳源，得出最佳的產油發(fā)酵條件；(3)將步驟(2)得到的培養(yǎng)物用紗網(或紗布等)進行過濾除去纖維素降解微生物和發(fā)酵液中的殘渣，得到只含有產油微生物等產油微生物的培養(yǎng)物，再過濾得到產油微生物細胞。得到的產油微生物用高壓勻質機將細胞破碎，加入萃取劑，浸提，收集上層有機溶劑層，蒸發(fā)回收溶劑，剩余的部分為微生物油脂；(4)利用甲酯化的方法將微生物油脂制備成生物柴油。具體步驟為混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法，包括如下步驟(I)制備微生物種子液將纖維素降解菌和油脂產生菌分別在PDA培養(yǎng)基中25-30°C培養(yǎng)3-5d后制得；(2)將油脂產生菌和纖維素降解菌按照細胞重量比2-3 I添加到混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)5_14d ;其中所述混合發(fā)酵培養(yǎng)基為培養(yǎng)基I : IO-5Og 纖維素材料；9g Na2HPO4 · 12H20 ；1. 5g KH2PO4 ；1. 2mgFeNH4-Citrate ；0. 34g (NH4) 2S04 ;0. 15g 蛋白腺；0. 15g Yeast extract ；0. 3g CaCl2,0. 3gMgSO4,0. 005gFeS04 · 7H20 ；0. 0016g MnSO4 ·Η20 ；0. 0014g ZnSO4 ·Η20 ；0. 002g CoCl2 ； IOOOmLH2O, pH調節(jié)為弱酸性ρΗ6· 0-6. 8 ;或，
培養(yǎng)基II 10-50g 纖維素材料；2g KH2PO4 ；1. 4g (NH4) 2S04 ；0. 3g MgSO4 ；0. 3gCaCl2 ；0. 5g 蛋白胨；0. 005g FeSO4 · 7H20 ;0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H2O ;0. 002gCoCl2, IOOOmLH2O ；pH 調節(jié)為弱酸性 pH6. 0-6. 8 ;或，改造的Mandel 培養(yǎng)基:10_50g 纖維素材料；lg 蛋白胨，2. Og NaNO3,1. 5g K2HPO4,O. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005g FeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H2O,0. 5g CoCl2,1. 5g Yeast extract, H2O IOOOmL, pH7. 0 ;或，改造的察氏培養(yǎng)基IOg纖維素材料；3g NaNO3 ；IgK2HPO4 ；0. 5g MgSO4 · 7H20 ；0. 5gKCl ；0. 005g FeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 002g CoCl2 ;蒸餾水lOOOmL，pH調節(jié)為弱酸性ρΗ6· 0-6. 8 ；(3)將所得到的培養(yǎng)物過濾除去纖維素降解菌和發(fā)酵液中的殘渣，得到含有產油微生物的培養(yǎng)液，再過濾得到產油微生物細胞；(4)產油微生物細胞用高壓勻質機將細胞破碎，加入萃取劑，浸提，收集上層有機溶劑層，蒸發(fā)回收溶劑，剩余的部分為微生物油脂；(5)微生物油脂經過甲酯化反應得到生物柴油。上述纖維素材料為微晶纖維素、秸桿、麥麩或紙。上述纖維素降解囷為里氏木霉、綠色木霉、康寧木霉、瑞士木霉或黑曲霉；油脂廣生菌為紅球菌或粘紅酵母。上述高壓勻質機的壓力為60_80MPa，萃取溶劑與破碎細胞的體積比為2-3 1，萃取劑為正己烷，浸提溫度為40-50°C，浸提2-3次，每次30-40min。上述甲酯化方法為離子液體甲酯化將相同摩爾數的微生物油脂、甲醇和[NMP][CH3SO3]加入容器中，攪拌4-12h，倒入分液漏斗靜置分層成為兩層，除去下層得到上層生物柴油。有益效果I、綠色環(huán)保的生物柴油生產技術石油生產柴油需要高溫高壓，同時其廢水、廢氣造成了環(huán)境污染。而微生物轉化能在水相、室溫和中性PH的環(huán)境下進行，無需高壓和極端條件，節(jié)省了能源，減少了化學合成工藝對環(huán)境的污染，是一項相對“綠色”的技術，符合可持續(xù)發(fā)展的需要。2、以可再生原料生物合成生物柴油傳統(tǒng)的柴油以石油為原料；而本研究采用可再生的秸桿等富含纖維素的廢棄物為原料，原料豐富，再生循環(huán)迅速，有助于解決能源短缺問題?？傊景l(fā)明針對石油資源短缺和價格飛漲，開發(fā)石油替代品，利用可再生資源通過微生物發(fā)酵生產生物柴油，實現(xiàn)了秸桿等纖維素廢棄物的高值轉化。3、直接高效利用纖維素材料制備生物油脂本研究直接利用纖維素材料，不需要外加糖類就可以制備生物油脂。纖維素酶產生菌將纖維素水解成糖，混合培養(yǎng)的產油微生物直接利用這些還原糖發(fā)酵制備生物油脂，還原糖的消耗解除了糖積累對于纖維素降解的反饋抑制，提高了纖維素的利用效率。


圖I為紅球菌油脂制備的生物柴油氣相色譜圖。
具體實施例方式實施例I混合發(fā)酵的培養(yǎng)基的確定根據纖維素分解微生物和產油微生物的培養(yǎng)特點，利用單因素實驗、正交試驗、響應面分析等方法將步驟(I)所述的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，篩選并且設計出混合發(fā)酵培養(yǎng)基如下培養(yǎng)基I 10g 纖維素；9g Na2HPO4 · 12H20 ；1. 5g KH2PO4 ；1. 2mg FeNH4-Citrate ；0. 34g(NH4)2SO4 ；0. 15g Peptone蛋白腺;0. 15g Yeast extract ；0. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005gFeS04 · 7H20 ；0. 0016g MnSO4 · H2O ；0. 0014g ZnSO4 · H2O ；0. 002g CoCl2 ； IOOOmL H2O,pH調節(jié)為弱酸性ρΗ6· 0-6. 8。培養(yǎng)基II 10g 纖維素；2g KH2PO4 ；1. 4g (NH4)2SO4 ；0. 3g MgSO4 ；0. 3g CaCl2 ；0. 5g蛋白胨；0. 005g FeSO4 · 7H20 ；0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H2O ；0. 002g CoCl2,IOOOmLH2O ;pH 調節(jié)為弱酸性 ρΗ6· 0-6. 8，121°C滅菌 20min。改造的Mandel培養(yǎng)基IOg纖維素；lgPeptone蛋白胨,2. Og NaNO3,1. 5g K2HPO4,O. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005g FeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H2O,0. 5g CoCl2,1. 5gYeast extract, H2O IOOOmL, pH7. 0,121°C滅菌 20min。改造的察氏培養(yǎng)基10g纖維素；3g NaNO3 ；IgK2HPO4 ；0. 5g MgSO4 · 7H20 ；0. 5gKCl ；0. 005g FeSO4 · 7H20，0. 0016g MnSO4 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H20,0. 002g CoCl2 ;蒸餾水IOOOmL, pH 調節(jié)為弱酸性 ρΗ6· 0-6. 8。混合發(fā)酵模式的建立(I)菌種的活化制備微生物種子液的方法如下將纖維素降解菌(里氏木霉、綠色木霉、康寧木霉、瑞士木霉或黑曲霉)和油脂產生菌(紅球菌或粘紅酵母)分別在PDA培養(yǎng)基中25-30°C培養(yǎng)3_5d后制得。(2)培養(yǎng)模式活化完畢的纖維素降解菌菌液按照5% Wt的比例接入培養(yǎng)基，以活化的油脂產生菌推遲接入O (同時接入)、I、2、3、4、5d的組合形式接入混合培養(yǎng)基，30°C、180r/min搖床培養(yǎng)。從第二天開始每天取樣，在5000r/min、4°C條件下離心IOmin取上清液(粗酶液)測定濾紙酶活力(FPA)和β-葡萄糖苷酶活力(β-GA)，同時測定3組平行樣，取平均值。(3)產生物柴油方法活化后的產油微生物，與產酶菌液以不同的推遲接種時間(因素Α)、不同的初始PH(因素B)、不同的培養(yǎng)溫度(因素C)混合，做三因素四水平的正交試驗。從2d開始每天取樣，測定產油微生物的生物量和微生物油脂的產量。混合發(fā)酵生產生物油脂確定了混合培養(yǎng)的最佳條件，纖維素酶產生菌和產油微生物培養(yǎng)的pH6. 5、溫度30 0C，在相同培養(yǎng)條件下可以較好的混合發(fā)酵?；旌习l(fā)酵培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基3. 5L，121°C滅菌25min，冷卻至30°C時按2% wt的接種量進行無菌接種。通過溫度電極和pH電極感應，自動調節(jié)發(fā)酵液的溫度和pH，使其保持在合適的參數，培養(yǎng)溫度30°C發(fā)酵培養(yǎng)5-8d，培養(yǎng)物用紗網(或8層紗布)過濾除去大部分絲狀真菌(纖維素降解菌)和發(fā)酵液中的殘渣，得到只含有產油微生物的培養(yǎng)液，再濾紙過濾或離心得到產油微生物細胞。得到的產油微生物細胞用高壓勻質機將細胞破碎，加入萃取劑正己烷，浸提，收集上層有機溶劑層，蒸發(fā)回收溶劑，剩余的部分為微生物油脂，利用甲酯化的方法將微生物油脂制備成生物柴油。其中，高壓勻質機的壓力為60-80MPa，萃取劑與破碎細胞的體積比為2-3 1，萃取溶劑為正己烷，浸提溫度為40-50 0C，浸提 2-3 次，每次 30-40min。微生物油脂制備生物柴油(1)BF3甲酯化大量樣品制備取50mL的菌液，離心取沉淀，用IOmL提取劑(氯仿甲醇體積比為2 I)抽提沉淀過夜。離心除去沉淀，氮吹(氮氣保護)濃縮上清液至2mL，加內標二十烷酸(2mL，lmg/mL)。加入5mL皂化試劑為甲醇水溶液(甲醇水體積比為 4 1，含6% wtNa0H)70°C皂化4h。加入5mL的甲酯化劑(BF3 甲醇質量比為I 4)70°C甲酯化4h。用IOmL正己烷萃取濃縮到2mL。得到的脂肪酸甲酯(生物柴油)直接用GC-MS和NaOH滴定的方法檢測確定含量，計算產率。(2)離子液體甲酯化采用離子液體[NMP] [CH3SO3]作為催化劑催化合成脂肪酸甲酯(生物柴油)，將相同摩爾數的微生物油脂、甲醇和[NMP] [CH3SO3]加入圓底燒瓶，二十烷酸作為內標加入各個樣品當中，配合磁力攪拌4-12h，加入分液漏斗靜置分層成為兩層，除去下層得到上層即是脂肪酸甲酯(生物柴油)，得到的脂肪酸甲酯直接GC-MS檢測確定含量，得到的脂肪酸采用NaOH滴定的方法確定濃度，計算產率。(3)脂肪酸甲酯成分分析用正己烷溶解得到的脂肪酸甲酯，離心后取上清夜，用氣相色譜-質譜連用儀分析油脂的含量和組成。30m HP-5氣相色譜柱(30X0. 32X0. 25)。檢測器為氫火焰離子檢測器(FID)。進樣口溫度225°C，檢測器溫度250°C，分流比10 1，線速30cm/min,衰減16。程序升溫條件為柱溫100°C,維持5min, 15min升至250°C,再以4°C /min 升至 25CTC,維持 IOmin0實施例2采用產油微生物渾池紅球菌(Rhodococcus opacus ACCC41043)與纖維素降解菌里氏木霉(Trichoderma reesei ATCC 26921)作為混合菌種進行混合發(fā)酵。混合發(fā)酵培 養(yǎng)基采用培養(yǎng)基 I 15g 纖維素；9g Na2HPO4 · 12H20 ；1. 5g KH2PO4 ；1. 2mg FeNH4-Citrate ；0. 34g (NH4) 2S04 ；0. 15g Peptone ；0. 15g Yeast extract ；0. 3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005gFeSO4 · 7H20 ；0. 0016gMnS04 · H2O ；0. 0014g ZnSO4 · H2O ；0. 002g CoCl2 ； IOOOmL H2O, pH 調節(jié)到pH6. 8。發(fā)酵罐為5L發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度為28°C，里氏木霉按照2% v/v接種量接種,培養(yǎng)12h后渾濁紅球菌按照2% v/v接種量接種進入發(fā)酵罐進行混菌發(fā)酵。脂肪酸的提取發(fā)酵5d，取2L的菌液，離心取沉淀，用500mL提取劑(體積比氯仿甲醇=2 I)抽提沉淀過夜。離心除去沉淀，用氮吹儀氮吹濃縮，加入500mL皂化試劑為甲醇水溶液(體積比甲醇水=4 I，含6 % WtNaOH) 60 V皂化Ih。生物柴油的制備用離子液體N-methyl-2-pyrrolidonium methylsulfonate ([NMP] [CH3SO3])作為催化劑進行甲酯化，在70°C條件下，甲醇菌產脂肪酸離子液體([NMP] [CH3SO3])按體積比=1 I O. 3，反應6h將皂化的脂肪酸甲酯化成為生物柴油。用氣質聯(lián)用儀檢測生物柴油的成分和含量(見圖I)。結果表明生產的生物柴油主要成分為C18和C16的脂肪酸甲酯占總量的81. 11%，其余18. 89 %為十七烷酸和二十烷酸，是性質較優(yōu)良的生物柴油。表I.產生的生物柴油主要成分
十六燒酸十六烯酸十Λ燒酸十八烯酸 百分比％ 23. 2618. 1216. 7223. 01實施例3采用產油微生物渾池紅球菌(Rhodococcus opacus ACCC41043)與纖維素降解菌黑曲霉(Aspergillus niger DSMZ 821)作為混合菌種進行混合發(fā)酵。培養(yǎng)基II :18g甘鹿渣；2g KH2PO4 ；1. 4g(NH4)2S04 ；0. 3g MgSO4 ；0. 3g CaCl2 ；0. 5g Peptone ；0. 005g FeSO4 ·7Η20 ；0. 0016gMnS04 · H20,0. 0014g ZnSO4 · H2O ；0. 002g CoCl2, IOOOmL H2O ;pH 調節(jié)為 pH 6. 8 ;發(fā)酵容器為250mL錐形瓶，培養(yǎng)溫度為28°C，黑曲霉按照2% v/v接種量接種，培養(yǎng)12h后渾濁紅球菌按照2% v/v接種量接種進入進行混菌發(fā)酵。脂肪酸的提取發(fā)酵5d，取50mL的菌液，離心取沉淀，用500mL提取劑(體積比氯仿甲醇=2 I)抽提沉淀過夜。離心除去沉淀，用氮吹儀氮吹濃縮，加入500mL皂化試劑為甲醇水溶液(體積比甲醇水=4 I，含6 % WtNaOH) 60 V皂化Ih。生物柴油的制備用離子液體N-methyl-2-pyrrolidonium methylsulfonate ([NMP] [CH3SO3])作為催化劑進行甲酯化，在70°C條件下，甲醇菌產脂肪酸離子液體([NMP] [CH3SO3])按體積比=1 I 0.3，反應6h將皂化的脂肪酸甲酯化成為生 物柴油。用氣質聯(lián)用儀檢測生物柴油的成分和含量(見圖I)。結果表明生產的生物柴油主要成分為C18和C16的脂肪酸甲酯占總量的84. 29%，其余15. 89 %為十七烷酸和二十烷酸，是性質較優(yōu)良的生物柴油。表2.產生的生物柴油主要成分
十六燒酸十六烯酸十Λ燒酸十八烯酸 百分比％ 24. 8019. 3115. 2524. 9權利要求
1.混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)制備微生物種子液將纖維素降解菌和油脂產生菌分別在PDA培養(yǎng)基中25-30°C培養(yǎng)3-5d后制得； (2)將油脂產生菌和纖維素降解菌按照細胞重量比2-3 I添加到混合發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)5_14d ;其中所述混合發(fā)酵培養(yǎng)基為 培養(yǎng)基 I :10-50g 纖維素材料；9g Na2HPO4 12H20 ; I. 5g KH2PO4 ；1. 2mgFeNH4-Citrate ；0. 34g (NH4)2SO4 ；0. 15g Peptone ；0. 15g Yeast extract ；0. 3g CaCl2,0. 3gMgSO4,0. 005gFeS04 7H20 ；0. 0016g MnSO4 .H2O ；0. 0014g ZnSO4 .H2O ；0. 002g CoCl2 ； IOOOmLH2O, pH調節(jié)為弱酸性pH6. 0-6. 8 ;或，培養(yǎng)基 II :10-50g 纖維素材料；2g KH2PO4 ；1.4g (NH4)2SO4 ；0. 3g MgSO4 ；0. 3g CaCl2 ；0.5g 蛋白胨；0. 005g FeSO4 *7H20 ；0. 0016g MnSO4 .H20,0. 0014g ZnSO4 .H2O ；0. 002g CoCl2,IOOOmL H2O ;pH 調節(jié)為弱酸性 pH6. 0-6. 8 ;或， 改造的 Mandel 培養(yǎng)基10_50g 纖維素材料；Ig Peptone, 2. Og NaN03,1. 5g K2HPO4,0.3g CaCl2,0. 3g MgSO4,0. 005g FeSO4 7H20，0. 0016g MnSO4 H20,0. 0014g ZnSO4 H2O,0.5g CoCl2,1. 5g Yeast extract, H2O IOOOmL, pH7. 0 ;或， 改造的察氏培養(yǎng)基10g 纖維素材料；3g NaNO3 ；IgK2HPO4 ；0. 5g MgSO4 7H20 ；0. 5gKCl ；0.005g FeSO4 7H20，0. 0016g MnSO4 H20,0. 0014g ZnSO4 H20,0. 002g CoCl2 ;蒸餾水IOOOmL, pH 調節(jié)為弱酸性 pH6. 0-6. 8 ； (3)將所得到的培養(yǎng)物過濾除去纖維素降解菌和發(fā)酵液中的殘渣，得到含有產油微生物的培養(yǎng)液，再過濾得到產油微生物細胞； (4)產油微生物細胞用高壓勻質機將細胞破碎，加入萃取劑，浸提，收集上層有機溶劑層，蒸發(fā)回收溶劑，剩余的部分為微生物油脂； (5)微生物油脂經過甲酯化反應得到生物柴油。
2.根據權利要求I所述的混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法，其特征在于所述纖維素材料為微晶纖維素、秸桿、麥麩或紙。
3.根據權利要求I所述的混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法，其特征在于所述纖維素降解菌為里氏木霉、綠色木霉、康寧木霉、瑞士木霉或黑曲霉；油脂產生菌為紅球菌或粘紅酵母。
4.根據權利要求I所述的混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法，其特征在于所述高壓勻質機的壓力為60-80MPa，萃取溶劑與破碎細胞的體積比為2-3 1，萃取劑為正己烷，浸提溫度為40-50°C，浸提2-3次，每次30-40min。
5.根據權利要求I所述的混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法，其特征在于所述甲酯化方法為離子液體甲酯化將相同摩爾數的微生物油脂、甲醇和[NMP] [CH3SO3]加入容器中，攪拌4-12h，倒入分液漏斗靜置分層成為兩層，除去下層得到上層生物柴油。
全文摘要
本發(fā)明公開一種混合發(fā)酵直接利用纖維素制備生物柴油的方法。本發(fā)明涉及利用植物纖維降解菌和油脂生產菌進行混菌發(fā)酵直接利用秸稈等天然植物纖維生產乙醇。首先采用響應面等優(yōu)化方法設計出混菌發(fā)酵的培養(yǎng)基，然后利用正交試驗、響應面分析法等方法優(yōu)化得到最佳的混合發(fā)酵溫度、菌種混合比例和菌種混合時間等發(fā)酵條件。根據優(yōu)化的發(fā)酵條件，利用植物纖維作為碳源，纖維素酶產生菌降解纖維素成為可發(fā)酵的糖，在培養(yǎng)體系中加入產油脂微生物進行混合發(fā)酵。油脂產生菌利用植物纖維不斷酶解產生的糖作為碳源，發(fā)酵生產油脂，微生物油脂經過甲酯化反應得到生物柴油。
文檔編號C12P7/64GK102660623SQ20121015421
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權日2012年5月17日
發(fā)明者唐玉斌, 季更生, 李強, 谷緒頂, 費娟娟 申請人:江蘇科技大學