專利名稱：HLA-A^*1101限制的WT1肽及含有其的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HLA_A*1101限制的WTl肽，具體而言為含有由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中該肽具有結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力，并且具有誘導(dǎo)CTL的能力。本發(fā)明也涉及具有結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力并且具有誘導(dǎo)CTL的能力的肽ニ聚體，其中兩個(gè)肽單體通過ニ硫鍵彼此結(jié)合，所述肽單體各自含有由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成并且含有至少ー個(gè)半胱氨酸殘基的氨基酸序列。此外，本發(fā)明涉及編碼該肽的多核苷酸、含有其的用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物等。
背景技術(shù)：
WTl基因(Wilms氏腫瘤I基因)被鑒定為負(fù)責(zé)兒童腎癌Wilms腫瘤的基因(非專利文件I和2)。WTl是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。最初，認(rèn)為WTl基因是腫瘤抑制基因。然而，后來的研究(非專利文件3、4、5和6)顯示W(wǎng)Tl基因相反在造血腫瘤和實(shí)體癌中起到癌基因的功能。WTl基因在許多類型的惡性腫瘤中高水平表達(dá)。于是，已檢查無突變的WTl基因產(chǎn)物(其是自身蛋白質(zhì))是否在活體中具有免疫原性。結(jié)果掲示，在腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)的衍生自WTl基因的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞內(nèi)加工進(jìn)行片段化，產(chǎn)生的肽與MHC I類分子形成復(fù)合物，且該復(fù)合物被呈遞在細(xì)胞表面，而識(shí)別這種復(fù)合物的CTL可以通過肽接種誘導(dǎo)(非專利文件7、8和9)。在以WTl肽或WTl cDNA免疫的小鼠中也顯示，表達(dá)WTl基因的移植的腫瘤細(xì)胞以高概率被排斥(非專利文件7和10)，然而生理上表達(dá)WTl基因的正常組織沒有被所誘導(dǎo)的CTL損傷(非專利文件7)。使用人細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)使用Dbl26肽或WH187 肽(SEQ ID No 1 的氨基酸 187-195，SLGEQQYSV)刺激具有 HLA_A*0201 的人外周血單核細(xì)胞時(shí)，WTl特異性CTL得到誘導(dǎo)，而誘導(dǎo)的CTL對(duì)內(nèi)源性高水平表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞具有特異的細(xì)胞毒活性，且這種CTL的細(xì)胞毒活性是HLA-A2限制的(非專利文件11)，其中所述Dbl26肽或WH187肽具有結(jié)合人MHC I類分子之一 HLA_A*0201分子的高能力。使用與HLA-A*2402(最常見于日本人HLA-A等位基因)匹配的WTl肽(WT1235 ；SEQ ID No 1的氨基酸235-243，CMTWNQMNL)的人細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)顯示，WTl特異性CTL(TAK-I)得到誘導(dǎo)(非專利文件12)，而誘導(dǎo)的CTL不抑制正常造血干細(xì)胞的集落形成活性，所述正常造血干細(xì)胞部分生理上表達(dá)WTl基因(非專利文件12和13)。這些報(bào)告強(qiáng)烈提示，WTl特異性CTL不僅在小鼠而且在人類中是可誘導(dǎo)的，這種CTL對(duì)以高水平表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，但是對(duì)生理上表達(dá)WTl基因的正常細(xì)胞不具有細(xì)胞毒活性(非專利文件7、10、 11,12 和 13)。WTl基因產(chǎn)物作為核蛋白存在，并在細(xì)胞質(zhì)中由蛋白酶體加工以片段化為肽。片段化的肽由TAP (抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)體)分子轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，與MHC I類分子形成復(fù)合物，并且呈遞在細(xì)胞表面上。作為CTL前體細(xì)胞經(jīng)TCR識(shí)別WTl肽-MHC I類分子復(fù)合物的結(jié)果，WTl特異性CTL得到誘導(dǎo)，從而對(duì)通過MHC I類分子呈遞WTl基因產(chǎn)物的腫瘤細(xì)胞施加細(xì)胞毒作用(非專利文件7、8和9)。于是，至少要求用于靶向WTl基因產(chǎn)物的癌癥免疫治療中的WTl肽是在活體中與MHC I類分子結(jié)合的形式。然而，MHC I類分子是多樣的，與各自MHC I類分子結(jié)合的WTl肽的氨基酸序列彼此不同。因此，要求提供與MHC I類各亞型匹配的肽。然而，迄今為止僅僅已知HLA-A*2402分子、HLA_A*0201分子、HLA_A*2601分子和HLA_A*3303分子限制的肽是HLA分子限制的WTl肽(分別見專利文件I、非專利文件11、專利文件2和專利文件3)。因此，需要發(fā)現(xiàn)HLA-A*1101限制的WTl肽。專利文件I :W0 2003/106682專利文件2 W0 2005/095598專利文件3 :日本專利申請(qǐng)?zhí)?006-45287
非專利文件I =Daniel A. Haber 等人，Cell. 1990 Jun 29 ；61 (7) :1257-69.非專利文件2 Call KM 等人，Cell. 1990 Feb 9 ；60(3) :509-20.非專利文件3 =Menke AL 等人，Int Rev Cytol. 1998 ；181 :151-212.綜述。非專利文件4 =Yamagami T 等人，Blood. 1996 Apr I ；87(7) :2878-84.非專利文件5 =Inoue K 等人，Blood. 1998 Apr 15 ；91(8) :2969-76.非專利文件6 =Tsuboi A 等人，Leuk Res. 1999 May ；23(5) :499-505.非專利文件7:0ka Y 等人，J Immunol. 2000 Feb 15 ；164(4) :1873-80.非專利文件8 :Melief CJ 等人，Immunol Rev. 1995 Jun ; 145 :167-77.非專利文件9 Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb ；12(2) :237-8.非專利文件10 =Tsuboi A 等人，J Clin Immunol. 2000 May ；20(3) :195-202.非專利文件11 0ka Y 等人，Immunogenetics. 2000 Feb ；51 (2) :99-107.非專利文件12 =Ohminami H 等人，Blood. 2000 Jan I ；95(1) :286-93.非專利文件13 Gao L 等人，Blood. 2000 Apr I ；95(7) :2198-203.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明擬解決的問題本發(fā)明擬解決的問題是提供HLA-AiIlOl分子限制的且包含WTl蛋白質(zhì)氨基酸序列的肽、編碼其的多核苷酸、以及包含其的用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物等。解決問題的方法作為考慮到上述情況的大量研究的結(jié)果，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在各自含有由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽中，各自具有結(jié)合HLA-A*1101分子的能力的肽能夠以高比率誘導(dǎo)WTl特異性CTL。因此，本發(fā)明得以完成。本發(fā)明提供(I)含有由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中該肽具有結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力，并且具有誘導(dǎo)CTL的能力；(2)根據(jù)⑴的肽，其中氨基酸序列第9位氨基酸是Lys或Arg ；(3)根據(jù)(I)的肽，其中氨基酸序列選自
Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQ ID No:.2),
Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No:3),
Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys(SEQ ID No:4),
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg(SEQ ID No:5),
Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys(SEQ ID No:6),
Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No:7),
Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No:8), Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No: 9),和
Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID No: 10);(4)根據(jù)(3)的肽，其中氨基酸序列是Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQID No 2)；(5)具有結(jié)合HLA-A*1101分子的能力并具有誘導(dǎo)CTL能力的肽ニ聚體，其中兩個(gè)肽單體通過ニ硫鍵彼此結(jié)合，所述肽單體各包含由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成并包含至少ー個(gè)半胱氨酸殘基的氨基酸序列；(6)根據(jù)(5)的肽ニ聚體，其中肽單體的氨基酸序列選自Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg (SEQ ID No :3)，Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No :7)，Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No :8),和Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No 9)；(7)治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，包含⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體；(8)治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向HLA-A*1101陽性受試者施用有效量的⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體；(9)編碼⑴的肽的多核苷酸；(10)含有(9)的多核苷酸的表達(dá)載體；(11)治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，包含(9)的多核苷酸或(10)的載體；(12)治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向HLA-A*1101陽性受試者施用有效量的(9)的多核苷酸或(10)的載體；(13) WTl特異性CTL,所述WTl特異性CTL由(I)的肽和/或(5)的肽ニ聚體誘導(dǎo)；(14)誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法，包括在⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體的存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTL ；(15)誘導(dǎo)WTl特異性CTL的試劑盒，包括⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體作為基本組分；(16)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞由⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體誘導(dǎo)；(17)誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括在⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體的存在下培養(yǎng)未成熟抗原呈遞細(xì)胞，以從未成熟抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞；(18)誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，包括⑴的肽和/或(5)的肽ニ聚體作為基本組分；以及(19)診斷癌癥的方法，包括使用(13)的CTL或(16)的抗原呈遞細(xì)胞。發(fā)明效果 本發(fā)明提供HLA-AiIlOl限制的并含有由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽、編碼其的多核苷酸、以及包含其的治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物等。因此，可能在具有HLA-A*1101的受試者中體內(nèi)或體外誘導(dǎo)WTl特異性CTL。因?yàn)槿毡救酥蠬LA-AiIlOl陽性率是高的(約17.9%)，所以可以在大范圍受試者中誘導(dǎo)WT I特異性CTL。


圖I表示以WTl251誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖2表示以WTl279誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖3表示以WTl312誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖4表示以WTl313誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖5表示以WTl338誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖6表示以WTl378誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖7表示以WTl386誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖8表示以WTl415誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖9表示以WTl436誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖10表示以WTl378肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性(a、b和c分別表示使用HLA-AiIlOl-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細(xì)胞毒活性)。圖11表示以WTl378肽ニ聚體誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性(a和b分別表示使用HLA-AiIlOl-陽性健康供體I和2的PBMC觀察到的細(xì)胞毒活性)。圖12表示以修飾的WTl378肽(G — I)誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性(a、b和c分別表示使用HLA-AiIlOl-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細(xì)胞毒活性)。圖13表示以修飾的WTl378肽(G — V)誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性(a、b和c分別表示使用HLA-AiIlOl-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細(xì)胞毒活性)。圖14表不以WTl379肽誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性(a、b和c分別表不使用HLA-AiIlOl-陽性健康供體1、2和3的PBMC觀察到的細(xì)胞毒活性)。
具體實(shí)施例方式一方面，本發(fā)明涉及含有由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中該肽具有結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力，并且具有誘導(dǎo)CTL的能力(在此也稱為“WT1肽”)。人WTl蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ ID No :1。本發(fā)明的肽含有由SEQ ID No :1所示氨基酸序列中9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列。當(dāng)本發(fā)明的肽含有包含半胱氨酸的氨基酸序列時(shí)，可以通過用另ー種物質(zhì)例如另ー個(gè)氨基酸(例如絲氨酸、丙氨酸和α-氨基丁酸)置換氨基酸序列中的半胱氨酸、或者通過以本領(lǐng)域已知的保護(hù)基團(tuán)(例如羧甲基或吡啶基こ基)修飾半胱氨酸的SH基，來增加穩(wěn)定性，所述包含半胱氨酸的氨基酸序列例如下述SEQ ID No :3、7、8或9的氨基酸序列。本發(fā)明的肽是癌抗原肽，作為通過抗原呈遞細(xì)胞呈遞由本發(fā)明的肽在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)加工而產(chǎn)生的肽的結(jié)果，所述癌抗原肽可以誘導(dǎo)CTL。如上所述，本發(fā)明目的是獲得HLA-AiIlOl限制的肽。因此，本發(fā)明的肽具有結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力。可以通過本領(lǐng)域已知方法確定該結(jié)合能力。這種方法的實(shí)例包括基于計(jì)算機(jī)的方法(例如Rankp印、BIMAS或SYFPEITHI)和使用已知具有結(jié)合HLA-A*1101分子的能力的肽的競爭結(jié)合測試。例如，可以將確定的結(jié)合能力與已知HLA-AiIlOl限制的肽的能力相比較，以判斷本發(fā)明的肽是否具有結(jié)合能力。根據(jù)本發(fā)明的具有結(jié)合能力的肽的實(shí)例包括如由實(shí)施例I中所述方法確定的與HLA-AiIlOl分子親和カ分?jǐn)?shù)為4或更高、優(yōu)選5或更高、更優(yōu)選6或更高的肽。
本發(fā)明的肽另外具有誘導(dǎo)CTL的能力。例如在造血腫瘤如白血病、骨髄異常增生綜合征、多發(fā)性骨髄瘤或惡性淋巴瘤和實(shí)體癌如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巣癌中，WTl基因以其天然形式在高水平表達(dá)。因此，本發(fā)明的肽可以在罹患這種疾病的受試者中以高比率誘導(dǎo)CTL。誘導(dǎo)CTL的能力指體內(nèi)或體外誘導(dǎo)CTL的能力?？梢允褂贸Ｓ梅椒ù_定這種能力，例如其中使用Cr釋放測定確定CTL的細(xì)胞毒活性的方法。本發(fā)明的肽可以在氨基酸序列第9位具有Lys或Arg。認(rèn)為該肽結(jié)合HLA-A*1101分子的能力通過具有這種氨基酸而更高。本發(fā)明的肽中包含的由9個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列優(yōu)選是Ala Ala Gly SerSer Ser Ser Val Lys(SEQ ID No :2)、Pro He Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ IDNo :3)、Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys(SEQ ID No :4)、Ser Ala Ser Glu Thr SerGlu Lys Arg(SEQ ID No :5)、Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys(SEQ ID No :6)、ThrGly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No :7)、Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe SerArg (SEQ ID No :8)、Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys (SEQ ID No :9)或 Asn MetHis Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID No :10)。最優(yōu)選的，它是 Thr Gly Val Lys ProPhe Gln Cys Lys (SEQ ID No :7)。另外，它可以在 SEQ ID Nos :2_10 中任ー項(xiàng)的 9 個(gè)氨基酸中具有以其他氨基酸置換一至幾個(gè)、優(yōu)選一至五個(gè)氨基酸。9個(gè)氨基酸或其他置換的氨基酸中任一個(gè)可以經(jīng)過適當(dāng)修飾。在任何情況下，本發(fā)明的肽保持結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力。如上所述，本發(fā)明的肽可以是任ー個(gè)肽，只要其含有衍生自WTl蛋白質(zhì)并由9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的肽可以是例如僅由SEQ ID No :2-10任ー項(xiàng)所示氨基酸序列組成的肽，或者是包含SEQ ID No :2-10任一項(xiàng)所示氨基酸序列的WT I蛋白質(zhì)或其部分。本發(fā)明的肽中包含的氨基酸數(shù)目沒有具體限制，且該數(shù)目可以是例如9-500、9-300、9-200、9-100、9-50、9-30和9_12個(gè)氨基酸?？梢詫⒏鞣N物質(zhì)附著在本發(fā)明的肽中由 9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列的N末端和/或C末端。例如，可以附著氨基酸、肽或其類似物。如果將這種物質(zhì)附著在本發(fā)明的肽上，可以由活體中的酶或者通過例如細(xì)胞內(nèi)加 エ等過程對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行加工，且最終，可以產(chǎn)生由9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列，并將其作為與HLA-AiIlOl分子的復(fù)合物呈遞在細(xì)胞表面，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)CTL的作用。該物質(zhì)可以是調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的溶解度或増加其穩(wěn)定性(對(duì)蛋白酶的抗性等)的物質(zhì)。另外，它可以是將本發(fā)明的肽特異性遞送到例如給定組織或器官的物質(zhì)，或者它可以具有増加抗原呈遞細(xì)胞的吸收效率等作用。該物質(zhì)可以是增加誘導(dǎo)CTL的能力的物質(zhì)，例如輔助肽等?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域通用方法或其修改合成本發(fā)明的肽。在例如Peptide Synthesis,interscience, New York, 196d ；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York,1976 ;Peptide_Gosei, Maruzen Co., Ltd. ,1975 ;Peptide_Gosei No Kiso To Jikken,Maruzen Co. , Ltd. ,1985 ;以及 Iyakuhin No Kaihatsu(Zoku), Vol. 14, Peptide-Gosei,Hirokawa-Book store, 1991中對(duì)這種方法進(jìn)行了描述。也可以使用遺傳工程技術(shù)制備本發(fā)明的肽，所述遺傳工程技術(shù)基于編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列信息。這種遺傳工程技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。另ー方面，本發(fā)明涉及具有結(jié)合HLA-AiIlOl分子的能力和誘導(dǎo)CTL的能力的肽ニ聚體，其中兩個(gè)肽單體通過ニ硫鍵彼此結(jié)合，所述肽單體各包含由WTl蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸組成并含有至少ー個(gè)半胱氨酸殘基的氨基酸序列(此后稱為“WT1肽ニ聚體”)。與肽單體相比，本發(fā)明的肽ニ聚體的穩(wěn)定性通過形成ニ聚體而増加。本發(fā)明的肽ニ聚體是腫瘤抗原肽ニ聚體，作為通過抗原呈遞細(xì)胞呈遞本發(fā)明的肽在細(xì)胞中經(jīng)加工而產(chǎn)生的肽的結(jié)果，所述腫瘤抗原肽ニ聚體可以誘導(dǎo)CTL。兩個(gè)肽単體通過存在于單體中的半胱氨酸殘基之間的ニ硫鍵而結(jié)合，形成本發(fā)明的肽ニ聚體。因此，本發(fā)明的WTl肽ニ聚體中包含的各個(gè)肽單體是如上所述的WTl肽，并且含有至少ー個(gè)半胱氨酸殘基。本發(fā)明的WTl肽ニ聚體可以是同ニ聚體或異ニ聚體。在本發(fā)明的WTl肽ニ聚體中，肽單體包含的氨基酸序列優(yōu)選是Pro He Leu CysGly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No :3)、Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No 7)、Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No :8)或 Ser Cys Arg Trp Pro SerCys Gln Lys (SEQ ID No :9)。最優(yōu)選的，它是Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQID No 7)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方法制備本發(fā)明的WTl肽ニ聚體。例如，如果肽單體含有一對(duì)半胱氨酸，那么可以通過例如去除所有保護(hù)基團(tuán)(包括半胱氨酸側(cè)鏈上的)，然后將產(chǎn)生的單體溶液在堿性條件下空氣氧化，或者在堿性或酸性條件下加入氧化劑以形成ニ硫鍵，來制備本發(fā)明的WTl肽ニ聚體。氧化劑的實(shí)例包括碘、ニ甲基亞砜(DMSO)和鐵氰化鉀。當(dāng)各肽單體包含兩個(gè)或更多半胱氨酸殘基時(shí)，也可以通過上述方法制備本發(fā)明的WTl肽ニ聚體。對(duì)于這種情況，由于不同類型的ニ硫鍵而獲得異構(gòu)體?？蛇x擇地，可以通過選擇半胱氨酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的組合而制備本發(fā)明的WTl肽ニ聚體。保護(hù)基團(tuán)組合的實(shí)例包括MeBzl(甲芐基)基團(tuán)和Acm(こ酰氨基甲基)基團(tuán)、Trt (三苯甲基)基團(tuán)和Acm基團(tuán)、Npys (3-硝基-2-吡啶基硫代)基團(tuán)和Acm基團(tuán)、以及S_Bu_t (S-叔丁基)基團(tuán)和Acm基團(tuán)的組合。例如，對(duì)于MeBzl基團(tuán)與Acm基團(tuán)的組合的情況,可以通過去除除了 MeBzl基團(tuán)之外的保護(hù)基團(tuán)和除了半胱氨酸側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)之外的保護(hù)基團(tuán)，將產(chǎn)生的単體溶液進(jìn)行空氣氧化，以形成受保護(hù)的半胱氨酸殘基之間的ニ硫鍵，然后去保護(hù)并使用碘氧化，以形成先前以Acm保護(hù)的半胱氨酸殘基之間的ニ硫鍵，來制備WTl肽ニ聚體。另ー方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體。WTl基因在各種癌癥和腫瘤中高水平表達(dá)，所述癌癥和腫瘤包括造血腫瘤例如白血病、骨髄異常增生綜合征、多發(fā)性骨髄瘤或惡性淋巴瘤和實(shí)體癌如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巣癌。因此，本發(fā)明的藥物組合物可用于癌癥的治療或預(yù)防。當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物施用于HLA-AiIlOl陽性受試者吋，WTl特異性CTL由該藥物組合物中包含的HLA-A*1101限制的WTl肽或WTl肽ニ聚體誘導(dǎo)，而受試者中的癌細(xì)胞被這種CTL損傷。本發(fā)明的藥物組合物除了作為活性成分的HLA_A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體之外，可以包含例如載體、賦形劑等。本發(fā)明的藥物組合物中包含的HLA-AiIlOl限制的WTl肽或WTl肽ニ聚體誘導(dǎo)WTl特異性CTL。因此，本發(fā)明的藥物組合物可以包含合適的佐劑，或可以與合適的佐劑一起施用以增強(qiáng)誘導(dǎo)效率。優(yōu)選佐劑的實(shí)例包括但不限于完全或不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁?？梢砸蕾囉跔顩r例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點(diǎn)，適當(dāng)選擇本發(fā)明的藥物組合物的施用方法。這種方法的實(shí)例包括但不限于皮內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、經(jīng)鼻施用和經(jīng)ロ施用?？梢砸蕾囉跔顩r例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點(diǎn)，適當(dāng)選擇本發(fā)明的藥物組合物中包含的肽或肽ニ聚體的量，以及本發(fā)明的藥物組合物的劑量形 式、施用次數(shù)等。該肽的單次劑量通常為O. OOOlmg-IOOOmgdt- O. OOlmg-lOOOmg。另ー方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將有效量的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體施用于HLA-AiIlOl陽性受試者。治療或預(yù)防的癌癥可以是任ー種，且其實(shí)例包括造血腫瘤例如白血病、骨髄異常增生綜合征、多發(fā)性骨髄瘤或惡性淋巴瘤和實(shí)體癌如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巣癌。另ー方面，本發(fā)明涉及確定HLA-AiIlOl陽性受試者中WTl特異性CTL的存在或量的方法，包括(a)將WTl肽和HLA-A*1101分子的復(fù)合物與來自受試者的樣品反應(yīng)；并(b)確定該樣品中所含的識(shí)別復(fù)合物的CTL的存在或量。來自受試者的樣品可以是任ー種，只要其可能含有淋巴細(xì)胞。樣品實(shí)例包括體液例如血液或淋巴和組織?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知方法例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白方法，將WTl肽和HLA-AiIlOl分子的復(fù)合物制備為例如四聚體或五聚體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法測量識(shí)別這種復(fù)合物的CTL的存在或量。在本發(fā)明的這一方面，可以將復(fù)合物標(biāo)記?？梢詫⒁阎獦?biāo)記例如熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記用作標(biāo)記。標(biāo)記使得CTL存在或量的確定容易且快速。因此，本發(fā)明也提供在HLA-AiIlOl陽性受試者中確定WT I特異性CTL存在或量的組合物，其含有HLA-A*1101限制的WTl肽。另外，本發(fā)明提供在HLA-AiIlOl陽性受試者中確定WTl特異性CTL存在或量的試劑盒，其含有HLA-A*1101限制的WTl肽。另ー方面，本發(fā)明涉及使用WTl肽和HLA_A*1101分子復(fù)合物產(chǎn)生WTl特異性CTL的方法，包括(a)將該復(fù)合物與樣品反應(yīng)；并(b)獲得該樣品中所含的識(shí)別復(fù)合物的CTL。WTl肽和HLA-A*1101分子的復(fù)合物如上所述。樣品可以是任ー種，只要其可能含有淋巴細(xì)胞。樣品實(shí)例包括來自受試者的樣品，例如血液和細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知方法例如FACS或MACS獲得識(shí)別該復(fù)合物的CTL。本發(fā)明允許培養(yǎng)獲得的WTl特異性CTL，并將其用于治療或預(yù)防各種癌癥。因此，本發(fā)明也涉及WTl特異性CTL，可以通過使用WTl肽和HLA_A*1101分子的復(fù)合物產(chǎn)生WTl特異性CTL的方法獲得所述WTl特異性CTL。另ー方面，本發(fā)明涉及編碼H LA-AiIlOl限制的WTl肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA?？梢曰贖LA-AiIlOl限制的WTl肽的氨基酸序列確定本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列?？梢酝ㄟ^合成DNA或RNA的已知方法(例如化學(xué)合成方法)、PCR方法等制備所述多核苷酸。另ー方面，本發(fā)明涉及含有所述多核苷酸的表達(dá)載體?？梢砸蕾囉谒氡景l(fā)明的表達(dá)載體的宿主類型、使用目的等，適當(dāng)選擇表達(dá)載體的類型、除多核苷酸序列之外所含序列等。通過將本發(fā)明的表達(dá)載體施用于HLA-AiIlOl陽性受試者，以在活體中產(chǎn)生HLA-AiIlOl限制的WTl肽及誘導(dǎo)WTl特異性CTL，并在受試者中損傷造血腫瘤細(xì)胞或?qū)嶓w癌細(xì)胞，可能治療或預(yù)防造血腫瘤或?qū)嶓w癌。另ー方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，包括多核苷酸或表達(dá)載體。在此方面，本發(fā)明的藥物組合物的組成、施用方法等如上所述。另ー方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將有效量的多核苷酸或表達(dá)載體施用于HLA-AiIlOl陽性受試者。治療或預(yù)防的癌癥的實(shí)例包括造血腫瘤例如白血病、骨髄異常增生綜合征、多發(fā)性骨髄瘤或惡性淋巴瘤和實(shí)體癌如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巣癌。另ー方面，本發(fā)明涉及含有所述表達(dá)載體的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^例如以表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞例如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞而制備本發(fā)明的細(xì)胞?？梢詮母鞣N方法中適當(dāng)選擇將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞的方法。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、且回收并純化產(chǎn)生的WT I肽，可以制備本發(fā)明的肽。另ー方面，本發(fā)明涉及WTl特異性CTL，所述WTl特異性CTL由HLA_A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體誘導(dǎo)。本發(fā)明的CTL識(shí)別WTl肽和HLA-A*1101分子的復(fù)合物。因此，本發(fā)明的CTL可用于特異性損傷HLA-AiIlOl陽性和高水平表達(dá)WTl的腫瘤細(xì)胞。另ー方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將WTl特異性CTL施用于HLA-AiIlOl陽性受試者?？梢砸蕾囉跔顩r例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點(diǎn)，適當(dāng)選擇WTl特異性CTL的施用方法。這種方法的實(shí)例包括但不限于靜脈內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi)施用、經(jīng)鼻施用和經(jīng)ロ施用。另ー方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法，包括在HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體的存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTL。夕卜周血單核細(xì)胞來自的受試者可以是任ー個(gè)，只要其是HLA-AiIlOl陽性的。通過在HLA-AiIlOl限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體的存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，從在外周血單核細(xì)胞中包含的CTL前體細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTL。通過向受試者施用根據(jù)本發(fā)明獲得的WTl特異性CTL，可能在HLA-A*1101陽性受試者中治療或預(yù)防造血腫瘤或?qū)嶓w癌。另ー方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)WTl特異性CTL的試劑盒，包含HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體作為基本組分。優(yōu)選的，該試劑盒用于誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法。本發(fā)明的試劑盒除了 HLA-AiIlOl限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體之外，可以包含例如獲得外周血單核細(xì)胞的工具、佐劑、反應(yīng)容器等。一般而言，試劑盒附有說明書手冊(cè)。通過使用本發(fā)明的試劑盒，可以有效誘導(dǎo)WTl特異性CTL。另ー方面，本發(fā)明涉及通過HLA-AiIlOl分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)，所述細(xì)胞由HLA-A*1101限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體誘導(dǎo)。通過使用本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞，可以有效誘導(dǎo)WTl特異性CTL。另ー方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防癌癥的方法，包括將通過HLA-AiIlOl分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞施用于HLA-AiIlOl陽性受試者。可以依賴于狀況例如疾病類型、受試者的狀況或靶位點(diǎn)，適當(dāng)選擇抗原呈遞細(xì)胞的施用方法。這種方法的實(shí)例包括但不限于靜脈內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、皮下施用、肌內(nèi)施用、經(jīng)鼻 施用和經(jīng)ロ施用。另ー方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)通過HLA-AiIlOl分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括在HLA-AiIlOl限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體的存在下培養(yǎng)未成熟抗原呈遞細(xì)胞，以從未成熟抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)通過HLA-AiIlOl分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞。未成熟抗原呈遞細(xì)胞指例如可以成熟為抗原呈遞細(xì)胞的未成熟樹突細(xì)胞的細(xì)胞。未成熟抗原呈遞細(xì)胞所來自的受試者可為任ー種，只要其是HLA-AiIlOl陽性的。因?yàn)槲闯墒炜乖蔬f細(xì)胞包含于例如外周血單核細(xì)胞中，所以可以在WTl肽和/或WTl肽ニ聚體的存在下培養(yǎng)這種細(xì)胞。另ー方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)通過HLA-AiIlOl分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，包含HLA-AiIlOl限制的WTl肽和/或WTl肽ニ聚體作為基本組分。優(yōu)選的，該試劑盒用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。本發(fā)明的試劑盒包含的另ー個(gè)組分等如上所述。本發(fā)明的試劑盒可用于有效誘導(dǎo)通過HLA-AiIlOl分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞。另ー方面，本發(fā)明涉及抗HLA-AiIlOl限制的WT I肽或編碼該肽的多核苷酸的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。另ー方面，本發(fā)明涉及診斷癌癥的方法，包括使用WTl特異性CTL、通過HLA-A*1101分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞、或抗HLA_A*1101限制的WTl肽或編碼該肽的多核苷酸的抗體。優(yōu)選的，將WTl特異性CTL用于本發(fā)明的診斷方法。例如，通過將CTL、抗原呈遞細(xì)胞或抗體與來自HLA-AiIlOl陽性受試者的樣品溫育，或者將其施用于HLA-AiIlOl陽性受試者，并確定例如其位置、位點(diǎn)或量，可能診斷癌癥?？梢詫TL、抗原呈遞細(xì)胞或抗體進(jìn)行標(biāo)記。通過附著標(biāo)記，可以有效實(shí)施本發(fā)明的診斷方法。
實(shí)施例下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)說明，但不將其解釋為對(duì)其范圍的限制。實(shí)施例I :WT1肽的選擇使用 RANKPEP (http://bio, dfci. harvard. edu/Tools/rankpep. html)選擇衍生自來自WTl蛋白質(zhì)(SEQ ID No :1)的肽、具有高的結(jié)合HLA-A*1101分子的能力的WT1251、WT1279、WT1312、WT1313、WT1338、WT1378、WT1386、WTl415 和 WTl436O 這些肽的氨基酸序列、SEQ IDNo 1氨基酸編號(hào)及與HLA-AiIlOl分子的親和カ分?jǐn)?shù)示于表I。表I肽氨基酸編號(hào)氨基酸序列親和カ分?jǐn)?shù)
WTl25I251-259AAGSS SSVK15.18
(SEQ ID No: 2)
WTl279279-287PILCGAQYR11.47 (SEC) ID No: 3)
WTl312312-320RSASETSEK14.96
(SEQ ID No: 4)
WTl3I3313-321SASETSEKR6.87
(SEQ ID No: 5)
WTl338338-346SHLQMHSRK13.72
(SEQ ID No: 6)
WTl378378-386TGVKPFQCK11.33
(SEQ ID No:フ)
WTl386386-394KTCQRKFSR13.82
(SEQ ID No: 8)
WTl415415-423SCRWPSCQK10.29
(SEQ ID No: 9)
WTl436436-444NMHQRNMTK14.19
(SEQ ID No: 10)B-LCL細(xì)胞的制備通過Ficoll-Hypaque梯度密度離心方法從收集自HLA-AiIlOl陽性健康供體的外周血分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。然后將PBMC在含有10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中以約IxlO7的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并加入B95-8細(xì)胞(產(chǎn)生EB病毒的細(xì)胞)培養(yǎng)上清液。將其以5% CO2在37°C培養(yǎng)約I個(gè)月。獲得以EB病毒轉(zhuǎn)化的B-LCL細(xì)胞，其是B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞。經(jīng)證實(shí)，產(chǎn)生的B-LCL細(xì)胞不表達(dá)WTl基因。通過將B-LCL細(xì)胞與20 μ g/ml WT1251、WT1279、WT1312、WT1313、WT1338、WT1378、WT1386、WT1415 或 WTl436 溫育 2 小時(shí)來脈沖 B-LCL細(xì)胞，并以80Gy放射線進(jìn)行照射。在后面實(shí)驗(yàn)中將產(chǎn)生的B-LCL細(xì)胞(此后稱為以WTl肽脈沖的B-LCL細(xì)胞)用作抗原呈遞細(xì)胞。WTl特異性CTL的誘導(dǎo)在含有20μ g/ml WT1251、WT1279、WT1312、WT1313、WT1338、WT1378、WT1386、WTl415 或 WTl436的完全培養(yǎng)基(45% RPMI、45% AMI-V培養(yǎng)基和10%人AB血清)中將3xl06個(gè)自身PBMC于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以5% CO2在37°C培養(yǎng)I周以獲得相應(yīng)細(xì)胞。將2xl06個(gè)產(chǎn)生的相應(yīng)細(xì)胞與IxlO6個(gè)以相同WTl肽脈沖的B-LCL細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中共培養(yǎng)I周(第一次刺激)。將PBMC與以WTl肽脈沖的B-LCL細(xì)胞另外共培養(yǎng)三次(第二至第四次刺激)，所述培養(yǎng)在如下加入的20IU/ml (終濃度)IL2條件下進(jìn)行第二次刺激刺激起始后三天起，每隔一天兩次；第三和第四次刺激從刺激起始后那天起，每隔一天三次。使用負(fù)選擇柱重力上料(Negative Selection Columns Gravity Feed)試劑盒(StemSp)濃縮所得細(xì)胞，從而⑶8陽性T細(xì)胞比率變?yōu)榧s80%，并使其與以WTl肽脈沖的B-LCL細(xì)胞共培養(yǎng)(第五次刺激)。將最后刺激后5天獲得的CD8陽性T細(xì)胞(CTL)用于細(xì)胞毒活性的測量。CTL的細(xì)胞毒活性使用51Cr釋放測定測量CTL的細(xì)胞毒活性。CTL細(xì)胞(此后稱為效應(yīng)細(xì)胞)以I I至30 I的比率(E/T比)與已整合了 51Cr的靶細(xì)胞在200 μ I培養(yǎng)基中混合，并在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以5% CO2于37°C培養(yǎng)4小吋。將用與誘導(dǎo)CTL的相同的WT I肽脈沖的B-LCL細(xì)胞(BLCL-Ps)和沒有以WTl肽脈沖的B-LCL細(xì)胞(BLCL-NPs)用作靶細(xì)胞。培養(yǎng)后，通過離心收集上清液。使用液體閃爍計(jì)數(shù)器測量釋放到上清液中的51Cr量。使用下列公式確定細(xì)胞毒活性)(樣品上清液中的51Cr釋放-自發(fā)性51Cr釋放V(最大51Cr釋放-自發(fā)性51Cr釋放)xlOO
其中自發(fā)性51Cr釋放是當(dāng)已整合了 51Cr的靶細(xì)胞在相同條件下單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)所觀察到的51Cr釋放，且最大51Cr釋放是當(dāng)使用1% Triton X-100將已整合了 51Cr的靶細(xì)胞完全裂解時(shí)觀察到的51Cr釋放。結(jié)果顯示于圖1-9。圖中，縱軸代表比裂解(％)，而橫軸代表E/T比。使用實(shí)線代表BLCL-Ps，并使用點(diǎn)線代表BLCL-NPs。經(jīng)證實(shí)，與BLCL-NPs相比，以 WTl251、WTI279、WT1312、WT1313、WT1338、WT1378、WTl386, WTl415 或 WTl436 誘導(dǎo)的 CTL 特異性損傷作為與 HLA-A*1101 分子的復(fù)合物呈遞 WTl 肽的 BLCL-Ps。將以 WT1251、WT1279、WT1313、WTl338或WTl386誘導(dǎo)的CTL用于下面的其他實(shí)驗(yàn)。CTL對(duì)內(nèi)源性表達(dá)WTl的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性使用上述方法確定以WT1251、WTl279, WT1313、WTl338或WTl386誘導(dǎo)的CTL對(duì)表達(dá)WTl的B-LCL的細(xì)胞毒活性。表達(dá)WTl的細(xì)胞是指引入人WTl基因、并在細(xì)胞中表達(dá)WTl蛋白質(zhì)、并在HLA-AiIlOl分子上呈遞由加工所得的約9個(gè)氨基酸組成的肽的B-LCL。結(jié)果顯示于圖1、2、4、5和7中。圖中，使用短劃線代表表達(dá)WTl的B-LCL。經(jīng)證實(shí)，以WT1251、WT1279、WT1313> WTl338或WTl386誘導(dǎo)的CTL對(duì)內(nèi)源性表達(dá)WTl基因的細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。WTl肽ニ聚體的制備將227. 5mg WTl378 妝單體、227. 5mg N-葡甲胺(N-methylglucamine) (NMG)和 23ml水的混合物通過在室溫下攪拌約2天而空氣氧化。向得到的混合物加入2gこ酸鈉溶于5ml水中的水溶液，并將該混合物在室溫下攪拌約20分鐘。將200ml水和約200mlこ腈加入產(chǎn)生的溶液中，并將混合物經(jīng)Kiriyama漏斗過濾(濾紙?zhí)?C),并以水洗漆(約50ml x 3)。將約200ml水加入殘余物，并將殘余物凍干以獲得158mg粗WTl378肽ニ聚體。粗WTl肽ニ聚體的純化將158mg 粗 WTl378 肽ニ聚體溶解于 9ml DMSO 并注射到 ODS C18 柱(5ο Φχ 50cmL, YMC Co.，LTD.)，所述 ODS 柱與 HPLC (Shimadzu, LC8AD 型)附著，并用 HPLC 泵以溶液
I(H2O/1 % AcOH)平衡。將柱放置約30分鐘，并在360分鐘內(nèi)以濃度梯度0%到40%的溶液2(CH3CN/1% AcOH)洗脫。在220nm監(jiān)控UV吸收時(shí)，使用自動(dòng)級(jí)分收集器收集含有WTl肽ニ聚體的級(jí)分。將收集的級(jí)分組合，注射到ODS C18柱(4.6πιπιΦχ 25cm L，YMC Co.，LTD.)，所述ODS柱與HPLC(Hitachi，L-4000型)附著，并以17%的溶液2平衡，并在30分鐘內(nèi)以濃度梯度0%到47%的溶液2過洗脫，以在20. 51分鐘的保留時(shí)間獲得46. 6mg純化的WT I378肽ニ聚體。FAB. MS 2365. O (理論值:2342. 70)Na+F = O. 25%通過WTl肽ニ聚體誘導(dǎo)CTL根據(jù)上述方法，使用來自HLA-AiIlOl陽性健康供體1_3的PBMC檢查產(chǎn)生的WTl378肽ニ聚體、WTl378 肽、修飾的 WTl378 肽(G — I) (SEQ ID No 11)和修飾的 WTl378 肽(G — V)(SEQ ID No 12)以及WTI379 肽(SEQ ID No:13，公開于WO 2002/28414)誘導(dǎo)CTL的能力。結(jié)果示于圖10-14。圖中，縱軸代表比裂解(％ )，而橫軸代表E/T比。使用實(shí)線表示BLCL-Ps，并使用點(diǎn)線表示BLCL-NPs。經(jīng)證實(shí)，WTl378肽ニ聚體具有誘導(dǎo)CTL的能力。另外，發(fā)現(xiàn)各WTl379肽誘導(dǎo)CTL的能力遠(yuǎn)低于WTl378肽的能力，所述WT I379肽的氨基酸序列通過WTl蛋白質(zhì)氨基酸序列中一個(gè)氨基酸不同于WTl378肽，且因此，與已知肽相比，本發(fā)明的WTl肽具有卓越且出乎意料的作用。エ業(yè)適用性本發(fā)明提供了 HLA-AiIlOl限制的WTl肽、編碼該肽的多核苷酸、含有其的藥物組合物等。因此，本發(fā)明可用于醫(yī)藥等領(lǐng)域，例如，預(yù)防或治療高水平表達(dá)WTl基因的各種造血腫瘤和實(shí)體癌的藥物組合物的開發(fā)和制備領(lǐng)域。序列表自由文本SEQ ID NO 11 :修飾的 WTl 肽
SEQ ID NO 12 :修飾的 WTl 肽。
權(quán)利要求
1.由氨基酸序列Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO 7)組成的肽，其中1-5個(gè)氨基酸被其他氨基酸置換，其中所述肽具有結(jié)合HLA-A*1101分子的能力，并且具有誘導(dǎo)CTL的能力。
2.月太二聚體，其中Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO 7)的妝單體通過二硫鍵與Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No 7)的肽單體結(jié)合，其中在SEQ ID No :7中1-5個(gè)氨基酸被其他氨基酸置換，其中所述肽二聚體具有結(jié)合HLA-A*1101分子的能力，并且具有誘導(dǎo)CTL的能力。
3.編碼權(quán)利要求I的肽的多核苷酸。
4.含有權(quán)利要求3的多核苷酸的表達(dá)載體。
5.WTl特異性CTL，其通過下述誘導(dǎo) (a)權(quán)利要求I的肽， (b)權(quán)利要求2的肽二聚體，或 (C)妝二聚體，其中 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO 7)的妝單體通過二硫鍵與 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No 7)的肽單體結(jié)合。
6.誘導(dǎo)WTl特異性CTL的體外方法，包括在下述的存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WTl特異性CTL (a)權(quán)利要求I的肽， (b)權(quán)利要求2的肽二聚體，或 (C)妝二聚體，其中 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO 7)的妝單體通過二硫鍵與 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No 7)的肽單體結(jié)合。
7.呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞，通過下述誘導(dǎo) (a)權(quán)利要求I的肽， (b)權(quán)利要求2的肽二聚體，或 (C)妝二聚體，其中 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO 7)的妝單體通過二硫鍵與 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No 7)的肽單體結(jié)合。
8.誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的體外方法，包括在下述的存在下培養(yǎng)未成熟抗原呈遞細(xì)胞，以從未成熟抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞 (a)權(quán)利要求I的肽， (b)權(quán)利要求2的肽二聚體，或 (C)妝二聚體，其中 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID NO 7)的妝單體通過二硫鍵與 Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys (SEQ ID No 7)的肽單體結(jié)合。
9.誘導(dǎo)WTl特異性CTL或誘導(dǎo)呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，包含 (a)權(quán)利要求I的肽，或 (b)權(quán)利要求2的肽二聚體。
全文摘要
公開的是HLA-A*1101限制的WT1肽，具體而言為含有由WT1蛋白質(zhì)9個(gè)鄰接氨基酸殘基組成的氨基酸序列的肽，能夠結(jié)合HLA-A*1101分子，并且具有誘導(dǎo)CTL的能力；包含兩個(gè)肽單體的肽二聚體，所述肽單體各自包含含有至少一個(gè)半胱氨酸殘基且來自WT1蛋白質(zhì)的由9個(gè)鄰接氨基酸組成的氨基酸序列，其中兩個(gè)肽單體通過二硫鍵彼此結(jié)合，且所述肽二聚體能夠結(jié)合HLA-A*1101分子并且具有誘導(dǎo)CTL的能力；編碼該肽的多核苷酸；含有肽或肽二聚體的用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物；等等。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102659924SQ201210153918
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月28日
發(fā)明者杉山治夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所