專(zhuān)利名稱：快速提取大量樣品微量dna的方法及其在利用ssr標(biāo)記鑒定作物雜交種純度上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及ー種快速提取大量樣品微量DNA的方法及其在作物SSR標(biāo)記雜交種純度鑒定上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，雜交種獲得了廣泛應(yīng)用，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。種子作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，種子純度是保證農(nóng)作物品種增產(chǎn)潛力得以發(fā)揮的關(guān)鍵因素，開(kāi)展種子純度鑒定對(duì)保證種子質(zhì)量具有重要意義。常規(guī)田間鑒定方法一直是各育種單位采用的方法，但此法周期長(zhǎng)、工作量大且易受環(huán)境條件影響，有一定風(fēng)險(xiǎn)，造成種子積壓，影響種 子推廣銷(xiāo)售。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度鑒定上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟在BMT分子測(cè)試指南中，已將構(gòu)建DNA指紋的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP，其中SSR標(biāo)記因其技術(shù)比較成熟，穩(wěn)定性重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，已成為當(dāng)前各個(gè)作物進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定的首選。CTAB法提取植物DNA，已為廣大科研工作者所熟知，是目前各試驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛且最為成熟的DNA提取法，具有實(shí)用、穩(wěn)定、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。常規(guī)提取方法大多用1.5ml或2ml的離心管進(jìn)行提取，獲得基因組DNA較多，可以進(jìn)行幾十次至上百次左右試驗(yàn)。但通常情況下，雜交種純度鑒定所用DNA只需要進(jìn)行I次PCR的DNA量即可滿足要求，常規(guī)方法浪費(fèi)嚴(yán)重，效率低。對(duì)雜交種進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定時(shí)，常常需要在短時(shí)間內(nèi)提取大量樣本的微量DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。提取效率高低、成本多少已經(jīng)成為制約該技術(shù)應(yīng)用的最大限制因素。因此，尋找ー種快速、高效、穩(wěn)定、成本低廉能夠滿足SSR技術(shù)要求的作物基因組DNA提取方法成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供ー種快速、高效、穩(wěn)定、成本低的適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的微量基因組DNA提取方法。本發(fā)明提供的ー種快速提取大量樣品微量DNA的方法，包括如下步驟
1)取深孔板I個(gè)，每孔加1-1.5克石英砂，再加入I個(gè)直徑3mm的小鋼珠球，將幼葉或根尖放入深孔板的每個(gè)孔中，利用排槍向每孔中加入CTAB提取液lOOul，蓋上板蓋，利用研磨機(jī)進(jìn)行研磨，每秒25-30次，研磨2-3分鐘；
2)將深孔板放入65°C水浴10min,水浴后1500 r/min離心I min,然后加入IOOul的氯仿和異戊醇混合液，混合液的兩者體積比為24 :1，蓋上板蓋，輕輕混勻；
3)4000 r/min離心10 min,取上清液30ul,轉(zhuǎn)移至新的普通PCR板中，加入20ul在_20°C下預(yù)冷的異丙醇，蓋上PCR板板蓋；4)4000 r/min離心10 min,快速翻轉(zhuǎn)PCR板,傾倒試管中的全部液體,將試管板在多層干燥的吸水紙上不同的位置吸濕2-3次，以吸去多余的液體；晾干后，加入30ul的TE溶液。_4°C保存?zhèn)溆眉纯伞?br> 本發(fā)明快速提取大量樣品微量DNA的方法在SSR標(biāo)記鑒定作物雜交種純度上的應(yīng)用，其特征是DNA所涉及作物為黃瓜、大白菜、西瓜。本發(fā)明具有如下積極效果
I、本發(fā)明所述的基因組DNA提取方法，所用試劑為常規(guī)CTAB方法涉及的試劑，為大家所熟知。所涉及儀器設(shè)備也為通用的，易于推廣應(yīng)用。2、本發(fā)明在DNA提取過(guò)程中減少了藥品用量，提取成本降低。3、本發(fā)明DNA提取過(guò)程中，全部使用排槍(多孔道進(jìn)樣器)，大大提高DNA提取效率?！?、本發(fā)明所獲得DNA直接放于PCR板中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)，可直接利用IOul排槍進(jìn)行操作(省去分裝DNA過(guò)程)，方便易行，提高效率。


圖I是提取西瓜根尖基因組DNA O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖片。圖2是提取大白菜葉片基因組DNA O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖片。圖3是提取黃瓜葉片基因組DNA O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖片。圖4是白菜SSR-PCR擴(kuò)增后經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析圖片。圖5是西瓜SSR-PCR擴(kuò)增后經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析圖片。
具體實(shí)施例方式I)取96孔深孔板I個(gè)，每孔加トI. 5克石英砂，再加入I個(gè)直徑3mm的小鋼珠球，將黃瓜、大白菜或西瓜幼葉或根尖放入96孔深孔板的每個(gè)孔中，利用8道或12道排槍每孔中加入CTAB提取液lOOul，蓋上板蓋。研磨儀研磨，毎秒25-30次，研磨2_3分鐘。2)65°C水浴10 min,水浴后1500 r/min離心I min,加入IOOul氯仿和異戍醇(體積比24 :1)的混合液，蓋上板蓋，輕輕混勻。3)4000 r/min離心10 min，利用8道或12道排槍(多孔道進(jìn)樣器)，取上清液30ul，轉(zhuǎn)移至新的普通PCR板中，加入20ul在_20°C下預(yù)冷的異丙醇，蓋上PCR板板蓋。4) 4000 r/min離心10 min，傾倒試管中的全部液體，將試管板在多層干燥的吸水紙上不同的位置吸濕2-3次，以吸去多余的液體。倒置晾干或65°C恒溫干燥箱10 min后，加入30ul的TE溶液。_4°C保存?zhèn)溆?。DNA所涉及作物為西瓜、大白菜、黃瓜。圖I、圖2、圖3分別示出提取西瓜根尖、大白菜葉片、黃瓜葉片基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖片。圖4、圖5分別示出白菜、西瓜SSR-PCR擴(kuò)增后經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析圖片。本發(fā)明也可應(yīng)用于在作物育種中分子標(biāo)記輔助選擇等領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種快速提取大量樣品微量DNA的方法，其特征是包括如下步驟 1)取深孔板I個(gè)，每孔加1-1.5克石英砂，再加入I個(gè)直徑3mm的小鋼珠球，將幼葉或根尖放入深孔板的每個(gè)孔中，利用排槍向每孔中加入CTAB提取液IOOul，蓋上板蓋，進(jìn)行研磨，每秒25-30次，研磨2-3分鐘； 2)65°C水浴10min,水浴后1500 r/min離心lmin,然后加入IOOul的氯仿和異戍醇混合液，混合液的兩者體積比24 :1，蓋上板蓋，輕輕混勻； 3) 4000 r/min離心10 min,取上清液30ul,轉(zhuǎn)移至新的普通PCR板中，加入20ul在_20°C下預(yù)冷的異丙醇，蓋上PCR板板蓋； 4)4000 r/min離心10 min,快速翻轉(zhuǎn)PCR板,傾倒試管中的全部液體,將試管板在多層干燥的吸水紙上不同的位置吸濕2-3次，以吸去多余的液體；晾干后，加入30ul的TE溶液，-4°C保存?zhèn)溆眉纯伞?br> 2.一種如權(quán)利要求I所述快速提取大量樣品微量DNA的方法在作物SSR雜交種純度鑒定上的應(yīng)用，其特征是DNA所涉及作物為黃瓜、大白菜、西瓜。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種快速提取大量樣品微量DNA的方法及其利用SSR標(biāo)記鑒定作物雜交種純度上的應(yīng)用，適于多種作物雜交種純度鑒定。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)時(shí)，直接利用10ul排槍進(jìn)行操作，省去分裝DNA過(guò)程，方便易行，提高效率，能短時(shí)間提取大量樣品的微量DNA，本發(fā)明所提取的DNA直接用于PCR擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、快速、藥品用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102676504SQ20121015344
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者冀瑞琴, 馮輝, 劉志勇, 李承彧, 王玉剛, 聶子靜, 薛一花 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)