紙質(zhì)支持物和從其中回收生物材料的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，所述紙質(zhì)支持物用于生物材料的儲(chǔ)存和進(jìn)一步處理。本發(fā)明具體地涉及至少一個(gè)表面包被有化學(xué)品的紙質(zhì)支持物，所述化學(xué)品提高生物材料從所述支持物的回收率。還描述了制備和使用所述紙質(zhì)支持物的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】紙質(zhì)支持物和從其中回收生物材料的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，特別地涉及可用于儲(chǔ)存、回收和進(jìn)一步處理生物材料例如生物制藥藥物的的紙質(zhì)支持物。
[0002]發(fā)明背景
[0003]使用固體支持物例如濾紙來(lái)收集和分析人血液可回溯至I960年代早期，當(dāng)時(shí)Robert Guthrie博士為檢測(cè)苯丙酮尿癥而使用干血斑(DBS)樣本測(cè)定新生兒中的苯丙氨酸(Mei, J.等,2001 Journal of Nutrition, 131:1631S-1636S)。這一收集血液的新應(yīng)用引發(fā)了新生兒的群體篩查以檢測(cè)可治療的遺傳代謝疾病?，F(xiàn)在DBS用于篩查大量的新生兒代謝疾病已經(jīng)40多年了。
[0004]DBS樣本通過(guò)將來(lái)自靜脈血或直接來(lái)自指尖或足跟針刺的全血點(diǎn)在固體支持物例如膜、玻璃纖維或紙上進(jìn)行收集，使得這種方法特別適合樣本從周邊診所運(yùn)輸?shù)街行膶?shí)驗(yàn)室。此外，包裝在帶有干燥劑的拉鎖(zip-lock)塑料袋中的DBS能夠在室溫下儲(chǔ)存和運(yùn)輸，因此避免需要i)冷鏈儲(chǔ)存和ii)快速專(zhuān)用運(yùn)輸。通過(guò)將血滴涂到吸收材料例如Whatman903新生兒STD紙上收集的DBS不受IATA危險(xiǎn)物品規(guī)定(IATA Dangerous Goods Regulations)(附錄II，2005年3月)的管制。
[0005]其他用于收集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存用于嬰兒和新生兒篩查目的的DBS和其他體液的固體紙質(zhì)支持物包括:
[0006]1.Ahlstrom226
[0007]2.MunktellTFN(CE 標(biāo)記)
[0008]3.Toyo Roshi grade545Advantec Toyo, Tokyo (參見(jiàn)Elvers L等 2007 ;J.1nheritMedtab Dis30,4,609)。
[0009]所有這些紙,例如Whatman903新生兒STD紙，由棉毛纖維構(gòu)成。Whatman903新生兒STD紙和Ahlstr0m226紙被劃分為II類(lèi)醫(yī)療衛(wèi)生器材。有潛力發(fā)展為用于嬰兒和新生兒篩查目的的器材的固體紙質(zhì)支持物包括由Macherey Nagel (例如MN818)、Reeve Angel (例如Doublering)和Hahnemuhle Grade2292生產(chǎn)的那些固體紙質(zhì)支持物。
[0010]DBS的消耗費(fèi)用小于I美元/測(cè)試，而且與需要液體形態(tài)和專(zhuān)用運(yùn)輸條件的血漿相化，運(yùn)輸費(fèi)用顯著下降(Johannessen, A.等，2009;J Antimicrobial Chemotherapy, 64,1126-1129)。盡管實(shí)際測(cè)試費(fèi)用保持未變，并且在中心實(shí)驗(yàn)室從DBS提取分析物包含一些額外的操作時(shí)間，但DBS和特別的固體紙質(zhì)支持物的使用正越來(lái)越多地用于儲(chǔ)存和/或分析生物材料例如核酸、蛋白質(zhì)等。此外，DBS還被用于藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，其中將候選的低分子量藥物化合物注入測(cè)試動(dòng)物，并監(jiān)測(cè)血液中的濃度水平。
[0011]近年來(lái)，生物技術(shù)來(lái)源的重組蛋白、肽和基于抗體的藥物以及用于基因治療的反義寡核苷酸和DNA已發(fā)展成為主流的治療藥劑，并且現(xiàn)在構(gòu)成臨床開(kāi)發(fā)下的化合物的主要部分。這些藥劑通常被稱(chēng)為“生物技術(shù)藥物”或“生物制藥藥物”，以將其與低分子量藥物化合物區(qū)分。
[0012]生物技術(shù)藥物和低分子量藥物化合物的藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)(DMPK)分析很重要，因?yàn)镈MPK分析對(duì)藥物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，其對(duì)候選藥物可能如何被機(jī)體吸收、代謝和排出提供深入的了解。分析通常在藥物發(fā)現(xiàn)階段進(jìn)行，并包括將目的化合物給予動(dòng)物和測(cè)定生物液體中藥物(或代謝物)濃度作為時(shí)間函數(shù)。這產(chǎn)生了有價(jià)值的信息，例如藥物清除、生物利用度等，但是需要大量時(shí)間和資源(Beaudette, P.等，2004 ;J.0fChromatographyB809,153—158)。
[0013]與通常在藥物篩選程序中進(jìn)行的DMPK分析有關(guān)的主要問(wèn)題是明顯缺乏合適的用于在分析前保持血液樣本穩(wěn)定性和完整性的儲(chǔ)存介質(zhì)。目前的方法使用在指定時(shí)間從給藥的動(dòng)物收集的血漿或全血。然而，這種方法有許多缺陷，包括涉及耗時(shí)步驟，其造成分析過(guò)程中的瓶頸。此外，對(duì)于時(shí)程實(shí)驗(yàn)，單只動(dòng)物多次抽血是有限制的。這給高通量帶來(lái)了限制并增加了動(dòng)物的使用，其結(jié)果是較少的先導(dǎo)化合物能夠得以開(kāi)發(fā)。
[0014]DBS需要少的血液體積，使得能夠從一只動(dòng)物連續(xù)取血,而不是從數(shù)只動(dòng)物混合取血，這顯著改善了 DMPK和毒理動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和評(píng)估的質(zhì)量。對(duì)于“3R” (減少、優(yōu)化和代替)，DBS所需要的減少的血液體積(通常15-20 μ I/斑點(diǎn))的倫理學(xué)益處在臨床前藥物研發(fā)中是顯而易見(jiàn)的。測(cè)試動(dòng)物的數(shù)量能夠顯著降低。此外，在幼年毒理學(xué)研究中非末端取血是可能的，當(dāng)局正逐漸要求幼年毒理學(xué)研究作為兒科用藥的安全生評(píng)估的一部分。調(diào)整的動(dòng)物毒理學(xué)研究的另一優(yōu)點(diǎn)是數(shù)據(jù)質(zhì)量的提高。
[0015]因此，由于在藥代動(dòng)力學(xué)研究中迅速分析大量血液樣本的需要的增長(zhǎng)，DBS已經(jīng)成為一個(gè)有吸引力的選擇。對(duì)于作為DBS固體支持物的紙，以下的紙是合乎需要的:所述紙結(jié)合了令人滿(mǎn)意的力學(xué)性能和在穩(wěn)定狀態(tài)下保存目的生物材料的能力，以這樣一種方法致使其可在儲(chǔ)存后經(jīng)受進(jìn)一步處理和/或分析。用于DMPK分析的這類(lèi)紙的實(shí)例為被稱(chēng)為903新生兒樣本收集紙的那些紙，以及例如在US專(zhuān)利號(hào)5，75，126和5，939，259中描述的稱(chēng)為FTA和FTA Elute的那些紙。
[0016]為了有效地下游處理和分析，目的分析物(例如內(nèi)源蛋白質(zhì)或生物技術(shù)藥物)必須易于使用符合高通量處理的相對(duì)簡(jiǎn)單的技術(shù)從固體紙質(zhì)支持物提取。
[0017]DBS和內(nèi)源蛋白質(zhì)檢測(cè)的組合在科學(xué)文獻(xiàn)中已有所描述。例如，囊性纖維化病(CF)的生物標(biāo)志物免疫反應(yīng)性胰蛋白酶(IT)，Ryley等人在1981發(fā)表了來(lái)自DBS的內(nèi)源性IT首次報(bào)道用于CF篩查(J.Clin,Pathol.34，906-910)。從那以后，使用來(lái)自新生兒的DBS, IT已經(jīng)被常規(guī)用作CF指示物。許多商業(yè)化機(jī)構(gòu)提供FDA批準(zhǔn)的免疫測(cè)定試劑盒用于該應(yīng)用。許多人簡(jiǎn)單地使用“紙內(nèi)(paper-1n)”的方法，其中含有DBS的紙孔片(punch)直接應(yīng)用于免疫測(cè)定并在原位提取目的分析物。最近(Lindau-Shepard&Pass, 2010, ClinicalChem.56,445-450)證實(shí)IT以?xún)煞N不同的同工型存在。這些作者報(bào)道開(kāi)發(fā)了一種基于混懸液(或紙內(nèi))陣列的免疫測(cè)定法用于診斷CF，其利用了 IT的兩種不同的同工型。所有這些基于蛋白質(zhì)的研究在未包被的Guthrie卡(Whatman903紙)上進(jìn)行。
[0018]自從匿名人類(lèi)免疫缺陷(HIV)篩查開(kāi)始，已經(jīng)進(jìn)行了超過(guò)120萬(wàn)份的DBS測(cè)試，用于在孕婦血液中的內(nèi)源性抗-HIV抗體的血清學(xué)檢測(cè)。
[0019]這些研究已經(jīng)證實(shí):i)證實(shí)關(guān)于血液和任何相關(guān)目的蛋白的長(zhǎng)期儲(chǔ)存的擔(dān)憂(yōu)是沒(méi)有根據(jù)的；和ii)DBS中存在的血紅素不干擾測(cè)定進(jìn)行。
[0020]因此，生產(chǎn)為生物材料提供簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的儲(chǔ)存介質(zhì)的紙質(zhì)支持物是合乎需要的，所述生物材料包括i)內(nèi)源性部分和ii)生物制藥或生物技術(shù)藥物，所述紙質(zhì)支持物在進(jìn)一步處理中提供生物材料的高產(chǎn)率或回收率。本發(fā)明提出這些需求并提供提高從固體紙質(zhì)支持物上的以DBS儲(chǔ)存的生物樣本中生物材料例如生物制藥藥物的回收水平的方法。
[0021]定義
[0022]本文所用術(shù)語(yǔ)“生物材料”意指如下定義的任何“生物分子”、“合成來(lái)源的生物分子”、“生物制藥藥物”或“細(xì)胞包組分”:
[0023]i)生物分子是由生命體產(chǎn)生的任何有機(jī)分子，包括大的多聚體分子例如蛋白質(zhì)、多糖和核酸，以及小的低分子量分子例如初級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物和天然產(chǎn)物。
[0024]ii)合成來(lái)源的生物分子是采用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生或通過(guò)其他非生命的體外方法化學(xué)合成的如上文i)中定義的“生物分子”。
[0025]iii)生物制藥藥物(或“生物技術(shù)藥物”)是生物技術(shù)來(lái)源的重組蛋白質(zhì)、肽或基于抗體的藥物，或用于基因治療的反義寡核苷酸、蛋白質(zhì)核酸(PM)或脫氧核糖核酸(DNA)。
[0026]iv)細(xì)胞組分是獨(dú)特的、高度組織化的構(gòu)成細(xì)胞和有機(jī)體的一種或多種物質(zhì)。實(shí)例包括膜、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸。同時(shí)，細(xì)胞組分的大部分位于細(xì)胞本身內(nèi)部，而一些可能存在于生物體的細(xì)胞外區(qū)域。
[0027]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0028]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，其具有至少一個(gè)表面包被有提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非尚子去垢劑和二糖。
[0029]一方面，所述化學(xué)品是聚乙烯醇(PVA)。
[0030]另一方面，所述非離子去垢劑是Tween20。
[0031]又一方面，所述二糖是α-β-海藻糖。
[0032]一方面，所述紙質(zhì)支持物是903新生兒STD紙。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種從紙質(zhì)支持物回收生物材料的方法，包括以下步驟:
[0034]i)將上文所述的紙質(zhì)支持物的表面與包含生物材料的樣本接觸；
[0035]ii)干燥紙質(zhì)支持物表面上的樣本；
[0036]iii)儲(chǔ)存紙質(zhì)支持物；和
[0037]iv)從所述表面提取生物材料。
[0038]一方面，步驟iii)包括在15_40°C的溫度范圍內(nèi)儲(chǔ)存紙質(zhì)支持物。優(yōu)選溫度在20-300C的范圍內(nèi)。另一方面，根據(jù)生物材料的熱穩(wěn)定性，將紙質(zhì)支持物儲(chǔ)存在較低的溫度。
[0039]樣本的性質(zhì)取決于生物材料的來(lái)源。例如，所述來(lái)源可以是來(lái)自一定范圍的生物有機(jī)體，包括但不限于病毒、細(xì)菌、植物和動(dòng)物。優(yōu)選所述來(lái)源是哺乳動(dòng)物或人類(lèi)受試者。對(duì)于哺乳動(dòng)物和人類(lèi)來(lái)源，樣本可以選自組織、細(xì)胞、血液、血漿、唾液和尿液。
[0040]另一方面，所述生物材料選自生物分子、合成來(lái)源的生物分子、細(xì)胞組分和生物制藥藥物。
[0041 ] 又一方面，所述生物材料是生物制藥藥物。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種制備上文所述的紙質(zhì)支持物的方法，包括將紙質(zhì)支持物的至少一個(gè)表面用提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品的溶液包被，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非離子去垢劑和二糖。
[0043]—方面,所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、Tween20和α-β-海藻糖。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供上文所述的紙質(zhì)支持物在提高生物材料從其中的回收率中的用途。
[0045]一方面，所述生物材料是生物制藥藥物。
[0046]附圖簡(jiǎn)述
[0047]圖1表示從施加到各種紙質(zhì)基質(zhì)上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。
[0048]圖2表示從施加到包被有各種化學(xué)品的903新生兒STD紙上的干血斑中外源加入的IL-2的回收率。
[0049]發(fā)明詳述
[0050]重組IL一2 土 載體(R&D Syshems ;分別為目錄號(hào) 202-1L-CF-10 μ g ;批次AE4309112 和目錄號(hào) 202-1L-10 μ g ;批次 AE4309081)以 50pg 或 lOOpg/μ I 溶解于不含鈣和鎂的Dulbecco’s PBS (PAA ;目錄號(hào)H15-002，批次H00208-0673)，EDTA抗凝的人、兔或馬血(TCS BiOsciences)。
[0051]將等份試樣(I μ I包含0、50或IOOpg IL-2)施加于下列GE Healihcare濾紙:903新生兒STD卡，目錄號(hào)10538069，批次6833909W082 ;DMPK_A卡，目錄號(hào)WB129241，批次FT6847509 ；DMPK-B 卡，目錄號(hào) WB129242，批次 FE6847609 和 DMPK-C 卡，目錄號(hào) WB129243，批次FE6847009。在室溫和環(huán)境濕度下過(guò)夜使樣本干燥。
[0052]用合適大小的Harris Un1-core 打孔器(Sigma,目錄號(hào) Z708860_25ea,批次 3110)從各紙質(zhì)類(lèi)型打取孔片(直徑3毫米)。將單個(gè)孔片放入源自人IL-2Quantikine ELISA (R&DSystems,目錄號(hào)D0250，批次273275)的IL一2微孔板的單獨(dú)孔中。這些板由小鼠抗IL-2單克隆抗體包被。使用Quantikine試劑盒提供的測(cè)試緩沖液(100 μ I)將IL_2蛋白從紙孔片上洗脫。所有后續(xù)步驟都按照Quantikine試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)使用“紙內(nèi)”的方法(直接將紙孔片置入測(cè)定緩沖液中并原位直接洗脫分析物)進(jìn)行。測(cè)定完成，使用ThermoElectron Corporation, Multiskan Ascent在450nm監(jiān)測(cè)微孔板的光密度。通過(guò)與已知IL-2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較數(shù)值確定IL-2的回收率。對(duì)于每一單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)制作新的IL-2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0053]另外的實(shí)驗(yàn)包括903新生兒STD卡在數(shù)種化學(xué)溶液(如下文所述)中飽和浸泡之后，將加有IL-2的血液施加到所述卡上。
[0054]使用的化學(xué)品
[0055]下文給出化學(xué)品及其來(lái)源的列表。
[0056]聚乙烯醇(Sigma;目錄號(hào) P8136，批次 039k0147)。
[0057]聚乙烯亞胺，含50%于水中(Fluka，目錄號(hào)P3143，批次29kl492)。
[0058]菊粉，含1%于水中(Sigma，目錄號(hào) 12255-lOOg，批次 079F7110)。
[0059]Tween20，含 1%于水中(Sigma，目錄號(hào) P7949_100ml，批次 109k01021)。
[0060]α-β -海藻糖，10mg/ml (Sigma,目錄號(hào) T0299_50mg，批次 128kl337)。
[0061]聚乙二醇1000，含 1%于水中(Biochemika,目錄號(hào) 81189，批次 1198969)。
[0062]聚乙二醇200，含I %于水中(Fluka，目錄號(hào)81150，批次1384550)。
[0063]實(shí)駘結(jié)果[0064]當(dāng)IL-2溶解于EDTA抗凝血中時(shí)，903和DMPK-C卡促進(jìn)該細(xì)胞因子的回收率為45-55%，而從DMPK-A和B卡只有2-3%被回收(見(jiàn)表I和圖1)。903和DMPK-C卡是基礎(chǔ)紙，沒(méi)有被任何化學(xué)品浸泡或包被，而DMPK-A和B卡分別被促進(jìn)蛋白質(zhì)、微生物和細(xì)胞變性和失活的化學(xué)品的專(zhuān)有混合物包被。這些卡被設(shè)計(jì)為利于核酸的運(yùn)輸和長(zhǎng)期儲(chǔ)存。因此，使用DMPKA和B卡時(shí)發(fā)現(xiàn)的低IL-2回收水平實(shí)際上可能是存在這些變性試劑和所用的基于ELISA的抗體檢測(cè)系統(tǒng)的反映。ELISA檢測(cè)系統(tǒng)要求洗脫的IL-2顯示完整的天然結(jié)構(gòu)。
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種用于新生兒篩查的紙質(zhì)支持物，其具有至少一個(gè)表面包被有提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非離子去垢劑和二糖。
2.權(quán)利要求1的紙質(zhì)支持物，其中所述化學(xué)品是聚乙烯醇(PVA)。
3.權(quán)利要求1的紙質(zhì)支持物，其中所述非離子去垢劑是TWeen20。
4.權(quán)利要求1的紙質(zhì)支持物，其中所述二糖是α-β_海藻糖。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物，其中所述支持物是903新生兒STD紙。
6.一種從紙質(zhì)支持物回收生物材料的方法，包括以下步驟: i)將前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物的表面與含有生物材料的樣本接觸； ii)干燥在所述紙質(zhì)支持物的所述表面上的所述樣本； iii)儲(chǔ)存所述紙質(zhì)支持物；和 iv)從所述表面提取所述生物材料。
7.權(quán)利要求6的方法，其中步驟iii)包括在15-40°C的溫度范圍內(nèi)儲(chǔ)存所述紙質(zhì)支持物。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述樣本選自組織、細(xì)胞、血液、血漿、唾液和尿液。
9.權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物材料選自生物分子、合成來(lái)源的生物分子、細(xì)胞組分和生物制藥藥物。
10.權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物材料是生物制藥藥物。
11.一種制備權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物的方法，包括將紙質(zhì)支持物的至少一個(gè)表面用提高生物材料從所述表面的回收率的化學(xué)品的溶液包被，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、非離子去垢劑和二糖。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述化學(xué)品選自聚乙烯醇(PVA)、TWeen20和α-β-海藻糖。
13.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物在提高生物材料從其中的回收率中的用途。
14.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的紙質(zhì)支持物在提高生物制藥藥物從其中的回收率中的用途。
【文檔編號(hào)】G01N33/96GK103460052SQ201280010443
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月25日
【發(fā)明者】J·K·霍頓, P·J·塔特內(nèi)爾, S·L·J·斯圖布斯 申請(qǐng)人:通用電氣醫(yī)療集團(tuán)英國(guó)有限公司