專利名稱：通過基因治療炎性細胞的自我調(diào)節(jié)的細胞凋亡的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過向細胞中引入在這些細胞中誘導細胞凋亡(程序性細胞死亡或非壞死細胞死亡)的基因在炎性細胞中治療性誘導細胞凋亡。細胞凋亡誘導基因(有時在本文稱為AIG)是由TNFα啟動子(TNFp)或其它在炎癥中激活的誘導基因驅(qū)動的。在一個實施方案中，在那些能夠產(chǎn)生TNFα的細胞中選擇性誘導細胞凋亡。使用傳統(tǒng)基因治療技術，可將TNFp-AIG或其它嵌合基因方便地引入體內(nèi)。在嵌合基因在TNFp-AIG的實施方案中，它有利地只在那樣產(chǎn)生炎性細胞因子，TNFα的細胞中表達。此外，由于TNFp-AIG嵌合基因含有TNFα啟動子元件，它亦能螯合誘導性的，TNFp-選擇性轉(zhuǎn)錄因子。這種螯合導致內(nèi)源產(chǎn)生的TNFα減少。本發(fā)明特別涉及TNFp-AIG和類似基因構建體，含嵌合基因的細胞，在使用嵌合基因轉(zhuǎn)染的細胞中誘導細胞凋亡的方法，含嵌合基因的藥物組合物，在產(chǎn)生TNFα的細胞種群中體外選擇不產(chǎn)生TNFα的體細胞變體的方法及類似的確認能夠抑制TNFα產(chǎn)生的顯性陰性/顯性抑制基因的方法以及使用嵌合基因的治療方法。
本發(fā)明的背景在許多炎性條件下，炎性細胞的大量聚集和積累使細胞因子諸如白介素-1(IL-1)，IL-10，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和TNFα過量產(chǎn)生(Brennan F.m.et al.，英國醫(yī)學公報(British Medical Bulletin)1995，51/2，386-384)。在發(fā)炎組織中細胞因子的正調(diào)節(jié)和或相反調(diào)節(jié)可能直接或間接造成慢性炎性疾病的惡化。例如，類風濕性關節(jié)炎(RA)中最顯著的病理學表現(xiàn)于炎癥局部部位(即滑液關節(jié))。因而，很可能RA病人滑液關節(jié)中產(chǎn)生的細胞因子在疾病過程中起重要作用。在這些細胞因子中，相信IL-1和TNFα造成RA特征的軟骨破壞和骨侵蝕(Dayer J.M.et al.，J.Exp.Med.，1985，162，1208-1215；Gowen M.et al.，Nature，1983，306，378-380)。在滑液關節(jié)中IL-1和TNFα的過量存在已顯示加快嚙齒動物中膠原誘導的關節(jié)炎的發(fā)展(Brennan F.M.et al.，Clin，Expt.Immunol.，1994.97/1，1-3)。在滑液組織中過量的TNFα和IL-1是通過軟骨-關節(jié)翳接頭處多種細胞類型產(chǎn)生的，包括巨噬細胞譜系，類巨噬細胞滑液細胞，激活的T細胞以及可能有類成纖維細胞滑液細胞(Chu C.Q.et al.，Arthritis & Rheumatism，1991，34，1125-1132；Deleuran B.W.，et al.，Arthritis & Rheumatism，1992，35，1170-1178)。
除了上述炎性效應，TNFα還在多種炎癥前事件中起著普遍和關鍵的作用，諸如在單核細胞中誘導IL-1活性。實際上，抗TNFα中和抗體已顯示能降低整體的IL-1產(chǎn)生(Portillo，et al.，Immunol.，1989，66，170-175；Brennan F.M.，et al.，British Medical Bulletin 1995，51/2，368-384)。因而，阻礙炎性細胞因子TNFα效用的另一個好處在于降低同等破壞性的炎癥前媒介IL-1的產(chǎn)生。此外，人們熟知TNFα是其它炎癥相關基因的一種轉(zhuǎn)錄激活劑。例如，TNFα的存在刺激其它細胞因子(諸如GM-CSF)和細胞表面受體的產(chǎn)生，包括人類白細胞抗原(HLA)II類抗原和粘附分子(Alvaro-GarciaJ.M.，et al.，J.Exp.Med.，1989，146，865-875)，導致連續(xù)募集激活的T細胞和嗜中性細胞，引起滑液炎癥和增生并最終加重對軟骨和骨的破壞(Allen J.B.，J.Exp.Med.，1990，171，231)。
對炎性疾病的常規(guī)治療典型地是直接治療癥狀性炎癥。這種治療只能暫時減輕而不能顯著減緩疾病發(fā)展。相反，以炎性過程中誘導的TNFα和其它因子為靶的治療看來更有希望。例如，在膠原誘導的關節(jié)炎動物模型中，抗TNFα抗體和可溶的TNFα受體-IgG嵌合體能有效降低爪腫脹，關節(jié)累及和軟骨和骨的破壞(Williams R.O.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，1992，89，9784-9788)。使用人源化抗TNF-α抗體和TNFα受體-IgG嵌合分子的人體實驗產(chǎn)生顯著效果(Elliott M.J.，et al.，Arthritis and Rheumatism，1993，36，1681-1690；Elliott M.J.，et al.，Lancet，343，1105-1110)。雖然用這些TNFα抗性劑的治療看來很好忍受，但亦產(chǎn)生抗重組蛋白的抗體。因而，這些治療可能不適于長期治療并且不能獲得真正的疾病減輕。為了實際緩和疾病進展，必須使用TNFα特異療法連續(xù)把TNFα作為目標。用這些生物學藥劑進行這種治療方法是不實際的并且難以長期施用。
在一種替代治療選擇中，發(fā)炎滑膜可使用外科(Herold N.and SchroderH.A.，Act a Orthop Scand.，1995，66，252-254；Ogilvie-Harris D.J.and WeislederL.，Arthroscory，1995，11，91-95)，化學(Cruz-Esteban C.and Wilke W.S.，Bailliere′s Clinical Rheumatol.，1995，9，787-8017或放射引起的滑膜切除術(Cruz-Esteban C.and Wilke W.S.，Bailliere′s Clinical Rheumatol.，1995，9，787-801)切除。關節(jié)鏡外科滑膜切除術后的結果是好的，顯示從手術前狀況到手術后狀況的改善。非外科滑膜切除術是使用不同化學藥劑例如鋨酸，諸如氮芥和塞替派的烷化劑，甲氨蝶呤等進行的。不幸的是，非外科滑膜切除術(包括化學和射線引起的)程序上復雜，只提供短時減輕并且滑液增生只有不規(guī)則減少。此外，多數(shù)非外科替代物是潛在的致畸形藥。另外，在非外科滑膜切除術中對患病組織的化學損傷以及外科引發(fā)的組織損傷，其本身常造成炎癥反應。最后，必須知道這些方法有通常與常規(guī)藥物治療和侵害性外科手術相聯(lián)系的危險和副作用，包括費用和住院及康復的不便。
因此，仍舊存在對治療通常的炎性疾病以及特別是RA的有效治療手段的需要。
本發(fā)明的總結通過提供一種新的治療方法，本發(fā)明克服了與以前治療炎性疾病的療法相關的缺點。依據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在產(chǎn)生TNFα的炎性細胞中選擇性誘導細胞凋亡，引起這些細胞的破壞而沒有相關的炎性反應。
本發(fā)明的一個目的是提供一種治療方法，包括向哺乳動物的炎性細胞，或在炎癥部位的細胞中引入包含自我調(diào)節(jié)的細胞凋亡誘導基因(AIG)的步驟。AIG是由諸如TNFα啟動子(TNFp；參看

圖1和2)的啟動子及優(yōu)選地一個啟動子增強子驅(qū)動。因而，它在所有且只有能產(chǎn)生TNFα的細胞中表達。
本發(fā)明的另一個目的是提供TNFp-AIG及類似嵌合基因構建體，制造它們的過程，使用它們的方法，以及含有它們的制劑。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種在用TNFp-AIG嵌合基因轉(zhuǎn)染的細胞中誘導細胞凋亡的方法，一種在種群中體外選擇不產(chǎn)生TNFα體細胞變體的方法，一種鑒定能夠負責不產(chǎn)生TNFα的種群的產(chǎn)生的顯性/陰性基因的方法以及一種鑒定能夠負責調(diào)節(jié)TNFα產(chǎn)生的產(chǎn)品的方法(圖10)。
這些和其它目的將能基于下面對本發(fā)明的詳細公開由本技術領域普通技術人員容易地理解。
附圖的簡單描述圖1是本發(fā)明TNFp-AIG嵌合基因的圖示。細胞凋亡誘導基因(AIG)可以是任何，但不限于所列基因，即Caspasesl到10，粒酶B，F(xiàn)asligand等。
圖2用圖形描述了使用本發(fā)明的TNFp-AIG嵌合基因進行基因治療的結果。
圖3總結了用于利用螢光素酶基因(Luc)表達作為報告系統(tǒng)鑒定TNFα啟動子的誘導順式元件的缺失構建體。
圖4(a和b)提供了使用圖3所述的構建體獲得結果的總結。在兩個不同的產(chǎn)生TNFα的細胞系，即Jurkat(圖4a)和THP-1(圖4b)中評價了構建體的瞬時表達。每圖中的直方圖代表通過在不同實驗中使用諸如PMA(圖4a)或LPS(圖4b)的激活劑測量誘導性的刺激指數(shù)。每圖中的疊置線表示4到6個實驗的平均誘導性。
圖5是使用TNFα啟動子和原域刪除的AIG(使用的AIG是Caspase和Caspase 4/5)的選擇的天然元件制備TNFpAIG的流程圖。
圖6(a，b和c)提供了所做的觀察嵌合TNFpAIGs表達的代表性實驗的結果總結。使用細胞死亡酶聯(lián)免疫吸附測定(CDE測定)評價了瞬時轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞(圖6a和6b)和THP-1(圖6c)細胞中的細胞凋亡。在三張圖中，具稀疏點(sparse dot)的直方圖代表轉(zhuǎn)染對照，即細胞用不含DNA的轉(zhuǎn)染劑處理。具密集點(dense dot)的直方圖代表驅(qū)動的螢光素酶基因表達的TNFp元件；實心(solid)直方圖代表驅(qū)動的AIG.1或AIG.2的表達的相同的TNFp。實心直方圖上括號內(nèi)的數(shù)值代表富集因子(TNFp AIG誘導的細胞凋亡對TNFpLuc對照載體的比率)。
圖7(a和b)圖示了本發(fā)明的TNFp-AIG嵌合基因，含有隨后驅(qū)動AIG表達的多拷貝的TNFα啟動子誘導順式元件(圖7a)。圖示TNFpAIG嵌合基因，含有多拷貝的TNFα啟動子誘導順式元件，驅(qū)動AIG的表達，在其下游是TNFα基因的3′未翻譯區(qū)(TNF3′UTR)(圖7b)。TNFα基因的3′UTR與TNFα的誘導表達的調(diào)節(jié)有關系(Han，J.，et al.，J.Immunolgy，1991，146，1843-1843，Crawford，E.K.，et al.，J.Biol，Chem.，1997，272，21 120-21137，及圖9)。
圖8(a和b)是制備TNFα超啟動子-AIG嵌合構建體方案的流程表。
圖9顯示了兩個實驗結果的總結，表明TNF3′UTR對螢光素酶報告基因誘導表達的調(diào)節(jié)作用。在成纖維細胞系中進行了瞬時轉(zhuǎn)染。加點的直方圖代表缺少TNF3′UTR時TNFpLuc的誘導性，實心直方圖代表TNF3′UTR存在時TNFpLuc的誘導性。在Jurkat細胞中獲得類似的結果。
圖10圖示從產(chǎn)生TNFα的細胞種群中選擇不產(chǎn)生TNFα的體細胞變體并鑒定負責抑制TNFα產(chǎn)生的顯性陰性抑制基因。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明基于這樣的事實，在特定炎性疾病中的炎性細胞的細胞凋亡是治療上有益的。本發(fā)明特別涉及通過基因治療的自我調(diào)節(jié)細胞凋亡。概括地說，在本發(fā)明實踐中，至少含有一個附著到至少一個功能拷貝的最小啟動子上的啟動子增強子(該啟動子是在炎性細胞或在炎癥部位細胞中激活的基因或基因組合)的嵌合基因結合到至少一個拷貝的細胞凋亡誘導基因(AIG)，這樣由啟動子驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達，從而將炎性細胞作為靶。在炎癥中激活的誘導基因的啟動子舉例包括，但不限于，細胞因子，白介素及其受體，細胞粘附分子及其配體，趨化因子及其受體，促炎酶，及其類似物。依據(jù)本發(fā)明的嵌合基因以直接，遠側，或鄰近結合及其組合包含增強子，啟動子，和AIG元件。如上提及并將在下面詳細討論，在一些實施方案中，為了最大效率使用了多拷貝的增強子，啟動子，和/或AIG。
為了更完整的理解此處描述的發(fā)明，陳述出下面的詳細描述，僅為說明的目的強調(diào)嵌合基因包含至少一個TNFα啟動子增強子，結合到至少一個功能拷貝的最小TNFα啟動子并進一步結合到至少一個拷貝的AIG。雖然隨后的實施例亦使用了這種類型的構建，熟練技術人員將會知道此處描述的基本構建體可以改動以提供其它實施方案，將本發(fā)明的產(chǎn)物，流程，方法和組合物與其它包括諸如上面列出類型的表現(xiàn)出可用于靶定感染部位細胞的類似功能的在炎癥中激活的誘導基因的啟動子共同使用。
例如，在本發(fā)明嵌合基因構建中可用作啟動子的細胞因子和白介素包括，但不限于，TNF-α，TNFβ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-9，GM-CSF，干擾素γ，及其類似物，以及其功能片段和混合物。細胞粘著分子及其配體包括，但不限于，選擇蛋白，整聯(lián)蛋白，和免疫球蛋白超家族成員諸如胞間粘著分子-1(ICAM-1)，血管細胞粘著分子(V-CAM)及類似物，以及其功能性片段和變體及混合物。趨化因子及其受體包括，但不限于，C-X-C和C-C家族成員諸如巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，MIP-1β，巨噬細胞趨化蛋白1-4(MCP1-4)，趨化因子RANTES(RANTES)，Mig，嗜中性白細胞活化蛋白2(NAP2)，IP10，Groα-β及類似物，以及功能性片段和變體及其混合物。促炎酶包括，但不限于COX-2，iNOS，磷脂酶，蛋白酶(包括基質(zhì)金屬蛋白酶)，及其類似物以及功能性片段及其混合物。
為了使下面關于本發(fā)明的實施例TNFp-AIG嵌合基因的討論更清楚，說明下列序列序列1是對應于發(fā)表的(Takashiba S.et al.，Gene，1993，131，307-308)全長參考人TNFα啟動子序列的核苷酸序列。此處使用的核苷酸序數(shù)是指此序列的編號。
序列2是本發(fā)明使用基因的天然TNFα啟動子序列(從轉(zhuǎn)錄起始位點，TSS的-1077核苷酸)。序列1和序列2中的TNFp序列只有少數(shù)不同。已經(jīng)報道了TNFα啟動子核苷酸序列的這些差別(Takashiba S.，et al.，Gene，1993，131，307-308)。
序列3是天然最小TNFα啟動子序列(核苷酸-120通過-TSS，它至少包括一個增強子元件(K1位點；參看Pauli.，U.，Crit.Rev.in Eucaryotic GeneExpression，1994，4，323-344；Rhoades K.L.，et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，22102-22107；and Takashiba S.，et al.，Gene，131，307-108)。
序列4是嵌合基因TNFp120AIG.1(含有-120TNFp，驅(qū)動前域(prodomain)缺失的CPP32基因變體的表達(Caspase3，發(fā)表于Tewari M.et al.，Cell，199581(5)，801-809，變體為V239A)。
序列5是嵌合基因TNFp706AIG.1(含有-706TNFp，驅(qū)動前域(prodomain)缺失的CPP32基因的表達)。
序列6是TNFp1005 AIG.1(含有-1005TNFp，驅(qū)動的前域缺失的CPP32基因的表達)。
序列7是嵌合基因TNFp120 AIG.2(含有-120TNFp，驅(qū)動前域缺失的Ty/x基因的表達。(Ty(Caspase5)和Tx(Caspase4)基因的序列發(fā)表于參考文獻Faucheu，C.，et al.，Eur，J Biochem.，236，207-213，1996；Faucheu，C.，et al.，EMBOJ.，14，1914-1922，1995)。
序列8是嵌合基因TNFp706 AIG.2(含有-706TNFp，驅(qū)動前域缺失的Ty/x基因的表達)。
序列9是TNFp1005 AIG.1(含有-1005TNFp，驅(qū)動前域缺失的Ty/x基因的表達)。
序列10是TNFα啟動子的增強子區(qū)域1(ER1)，包含核苷酸-1005至-905)。
序列11是TNFα啟動子的增強子區(qū)域2(ER2)，包含核苷酸-706至-517。
序列12是附加的多克隆位點(MCS)，遺傳工程操作到-120pGL3構建體的-120最小TNFα啟動子的上游。
序列13是TNFα基因的3′未翻譯區(qū)域(3′UTR)(Nedwin，G.E.，et al.，Nucleic Acid Research，1985，13，6361-6373)。
用于制備依據(jù)本發(fā)明的嵌合基因構建體的TNFα啟動子的元件是從能夠誘導由TNFα啟動子驅(qū)動的治療基因的表達的元件中選擇的。這些啟動子元件此處將稱為TNFα啟動子的“誘導順式元件”，“順式誘導元件”或“增強子元件”。
增強子元件可物理連接到最小啟動子序列，或通過一個可能有或沒有特異限制性位點的接頭序列與最小啟動子分離。因此，如上面所總結，增強子元件可直接，遠端的，鄰近的或其任何組合結合到本發(fā)明嵌合基因。這些典型地構建到啟動子的上游。TNFα增強子元件的例子陳述于序列10和序列11；可使用其功能性片段或變體及組合。依據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選基因構建體包括那些具有多拷貝增強子元件即2或多個拷貝的構建體。一些實施方案有大約2至25，更少的2至10以及甚至更少的2至5個拷貝。
術語“TNF啟動子”，“TNFα啟動子”和“TNFp”此處可互換使用。除非另有注明，這些術語指相應于接合了一個或多個上游增強子元件的天然TNFα最小啟動子序列的完整核苷酸序列(天然存在的即天然的或在實驗室中遺傳工程產(chǎn)生的)。例子包括，但不限于，序列1，序列2，和序列3，及它們中任一個的功能性片段，變體和混合物。這些TNFα序列的許多功能性片段和變體及此處描述的其它序列與它們的天然和遺傳工程相應物具有至少大約80％，在有些情況下超過90％的序列同源性，但這些為熟練技術人員熟知并詳細說明于此處引用的文獻中。
可將任何細胞凋亡誘導基因用于嵌合基因和此處描述的方法中。用于本發(fā)明嵌合治療基因的細胞凋亡誘導基因可以與產(chǎn)生TNFα的炎性細胞(如果這些細胞天然含有細胞凋亡基因)的天然序列中細胞凋亡誘導基因類型相同或不同。優(yōu)選的AIGs包括，但不限于，細胞凋亡誘導蛋白酶的ICE/CED3家族成員(諸如Caspase-1(ICE)，hICE，ICE-LAP45，Mch2α)，Caspase-2(ICH1)，Caspase-3(CPP32，Yama，Apopain)，Caspase-4(TX，ICH2，ICErel II)，Caspase-4(ICE rel III，IY)，Caspase-6(Mch-2)，Caspase-7(Mch-3，ICE-LAP3，CMH-1)，Caspase-8(MACH，F(xiàn)LICE，Mch-5)，Caspase-9(ICE-LAp6，Mch6)和Caspase-10(Mch4))，粒酶家族成員(諸如粒酶A和粒酶B)，F(xiàn)as配體(FasL)，以及它們的功能性片段，變體和混合物。一些實施方案使用Caspase3，Caspase4，Caspase5，粒酶B，及其功能性片段，變體和混合物。除了FasL之外，這些基因在轉(zhuǎn)染后過量表達時，在轉(zhuǎn)染細胞中誘導細胞凋亡(Miura M.el al.，Cell，1993，75，653-660；Chinnayan A.M.et al.，Cell，1995，81，505-512；Los，et al.，Nature，1995，375，81；Muzio，et al.，Cell，1996，85，817-827)。
在FasL情況下，只在表達Fas的細胞中誘導細胞凋亡(自分泌或旁分泌方式)。因而，TNFp-FasL嵌合基因構建體提供了第二個水平的選擇性。TNFp-FasL嵌合基因的另一個優(yōu)點在于選擇性的以那些滑膜中疾病產(chǎn)生的不表達TNFα(因而不能驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達)但在表面表達Fas的細胞為靶。在這種情況下，F(xiàn)asL將由能夠產(chǎn)生TNFα的細胞諸如激活的巨噬細胞和T細胞表達。然后這些細胞能在表達Fas的細胞中諸如危險的激活T細胞和表達Fas的滑膜細胞中誘導細胞凋亡。
本發(fā)明提供了一種新的治療方法，包括向哺乳動物細胞中引入含有由TNFα啟動子(TNFp)驅(qū)動的細胞凋亡誘導基因(AIG)的嵌合基因的步驟。本發(fā)明嵌合基因的例子陳述于序列4，5，6，7，8和9；亦可使用它們的功能性片段或變體。因為不想受理論約束，作為由TNFp控制的結果，AIG只在那些產(chǎn)生炎性細胞因子，TNFα的細胞中表達。因而，任何表達TNFα的細胞是自我破壞的，而不表達TNF-α的細胞不受影響。有利的是，本方法能靶向任何產(chǎn)生TNFα的細胞(諸如激活的巨噬細胞，激活的T細胞及類巨噬細胞以及可能的類成纖維細胞滑膜細胞)而不論其細胞類型。實際上，靶向的產(chǎn)生TNFα的細胞可以是在其天然未改變形式時正常攜帶或表達或正常不攜帶或不表達細胞凋亡基因的細胞。因此，使用本發(fā)明的嵌合基因和方法，TNFα的細胞來源可通過高選擇方式破壞。
使用本發(fā)明的TNFp-AIG嵌合基因的另一個優(yōu)點是TNFp螯合內(nèi)源TNFp所需的轉(zhuǎn)錄因子，從而導致內(nèi)源TNFα產(chǎn)生的降低。在一個優(yōu)選實施例中，TNFp大量存在于治療的靶細胞。這可通過將多拷貝轉(zhuǎn)染基因引入到細胞中完成。另外，依據(jù)本發(fā)明的TNFp-AIG嵌合基因可包含多拷貝的TNFα啟動子的誘導順式元件。如上面提及，多拷貝的TNFp“誘導增強子元件”存在于本發(fā)明的一些TNFp-AIG嵌合基因?qū)嵤├小Ｍㄟ^包括TNFp構建體的多拷貝誘導順式元件，通過外源引入的序列螯合了轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生TNFα所需的轉(zhuǎn)錄因子。這種優(yōu)選嵌合TNFp-AIG構建體特征為，與本發(fā)明只含有連接到TNFp的單個增強子元件的嵌合基因相比在競爭TNFp特異轉(zhuǎn)錄因子時有增強的效能。這種方法構建的“誘導超啟動子”能夠(1)更有效競爭TNFα特異誘導轉(zhuǎn)錄因子以及(2)由于多個增強元件而以增強方式驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達。
例如，已經(jīng)顯示在類風濕性關節(jié)炎病人，滑膜切除術，即去除了滑膜組織中臨床有益。與常規(guī)和外科滑膜切除方法不同，此處描述的以細胞為靶的治療方法只以產(chǎn)生TNFα的細胞為靶。因而，有益的是，TNFp-AIG嵌合基因的引入和表達，及隨后細胞凋亡的誘導不會誘導炎性反應。相應地，本發(fā)明的方法相對為選擇性的并導致最少的組織損傷并且減輕炎癥。
此處描述的產(chǎn)品和方法同樣可用于治療其它炎性疾病。這些炎性疾病包括，但不限于，多發(fā)性硬化，急性熱病性多神經(jīng)炎，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，銀屑病，移植體抗宿主病(graft versus host disease)，紅斑狼瘡，胰島素依賴性糖尿病，銀屑樣關節(jié)炎(psoriatic arthritis)，結節(jié)病，過敏性肺炎，類風濕性脊椎炎及相關脊椎關節(jié)病，賴特綜合征和全身性硬皮病。這樣，本發(fā)明包括通過向細胞引入本發(fā)明的至少一個嵌合基因在病人炎性細胞或炎癥部位細胞誘導細胞凋亡治療病人炎性疾病的方法。這一點典型地通過制備至少含有一個本發(fā)明嵌合基因和典型的藥物學可接受載體的藥物組合物，以及使用標準方法向病人施用這種組合物來完成。在一些實施方案中，藥物組合物是使用局部的，靜脈的，腹膜內(nèi)的，及類似方法直接傳送到炎癥部位。進一步的方法在下面討論。
除了治療的指示，可將依據(jù)本發(fā)明的基因和細胞用于多種有用的篩選和選擇方法。在一個這種方法中，能將TNFp-AIG嵌合基因引入產(chǎn)生TNFα的細胞種群從產(chǎn)生TNFα的細胞種群中體外選擇出不產(chǎn)生TNFα的體細胞變體。產(chǎn)生TNFα的細胞會發(fā)生細胞凋亡。不產(chǎn)生TNFα的細胞將會存活。選擇具有存活表型的那些細胞變體是一種確認不產(chǎn)生TNF-α細胞的簡單方法。這種選擇方案可用于確定與TNF-α啟動子調(diào)節(jié)活性相反的基因的表達，從而降低TNF-α的產(chǎn)生。這種基因特征為其它系統(tǒng)中的顯性失活(DN)/顯性抑制基因(Behrends S.，et al.，J.Biol，Chem，1995，270，21109-21113；Zhang S.，et al.，J.Biol，Chem.，1995，270，23934-23936；Watowich S.S.，et al。Mol.Cell Biol.，1994，1416，3535-3549)。
在進一步體外方法中，可使用依據(jù)本發(fā)明的TNFp-AIG嵌合基因鑒定負責不產(chǎn)生TNFα細胞種群起源的顯性失活基因。依據(jù)本發(fā)明，將一個依據(jù)本發(fā)明的TNFp-AIG嵌合基因引入產(chǎn)生TNFα的細胞。阻礙顯性失活基因的存在，這些細胞會在活化時發(fā)生細胞凋亡。因此，可以推論存活的變體含有能下調(diào)TNFα產(chǎn)生的顯性失活基因?？赏ㄟ^產(chǎn)生cDNA文庫并轉(zhuǎn)染細胞系(例Jurkat和THP-1)容易地確認顯性失活基因。這些細胞是誘導TNFp-AIG嵌合基因或TNFp-螢光素酶基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。體外激活后選擇TNFp-AIG轉(zhuǎn)染細胞的存活表型；存活表型指示DN基因的作用。在用TNFp-螢光素酶基因轉(zhuǎn)染的細胞中，螢光素酶活性的降低指示DN基因的作用。使用這種方案確定的顯性失活基因本身可用于將來的治療藥劑。這類基因可作為降低TNFα產(chǎn)生的基因治療的候選。
用于基因轉(zhuǎn)移的方法可分為兩大類1.直接方法使用合適的載體作為治療基因的載體將治療基因原位轉(zhuǎn)導進入靶細胞例如滑膜細胞。將含有治療基因的載體直接注射到損傷區(qū)域(例如關節(jié)炎關節(jié))。2.間接方法治療基因來自體內(nèi)轉(zhuǎn)染到諸如滑膜細胞的靶細胞。在此方法中，從關節(jié)中除去滑膜，體外分離和培養(yǎng)滑膜細胞。用治療基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細胞，并將遺傳改變的滑膜細胞移植回滑膜。
對于體內(nèi)轉(zhuǎn)移，評價了多種載體在基因傳送中的效率(Nita，et al.，Arthritis & Rheumatism，1996，3915，820-828)。在用于基因治療的載體中，從反轉(zhuǎn)錄病毒衍生的載體目前發(fā)展的最好。它們能將遺傳物質(zhì)插入宿主基因組并產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。這些載體雖然不能感染不分裂細胞，由于它們插入到宿主基因組，不能排除插入誘變的可能性。與此相反，從腺病毒衍生的載體感染分裂及不分裂的細胞并游離型傳送DNA?；谙俨《镜妮d體的缺點是這些載體在感染的細胞中繼續(xù)產(chǎn)生病毒蛋白使它們潛在是抗原的。第三種基于病毒的載體來源于單純皰疹病毒(HSV)，亦能夠感染分裂著及未分裂著的細胞。
在非病毒載體系統(tǒng)中，評價了陽離子脂質(zhì)體和裸質(zhì)粒DNA。雖然諸如肌肉和皮膚的特定類型細胞吸收，保持和表達裸質(zhì)粒DNA，脂質(zhì)體處于發(fā)展的最前沿階段。
顆粒介導的基因傳送系統(tǒng)亦是可能的(Rakhmilevich，et al.，PNAS，1996，93，6291)并且是一種有希望的方法。
下面的“體內(nèi)”基因傳遞方案可用于傳送本發(fā)明的嵌合基因(1)Nita等，Arthritis and Rheumatism，1996，39，820-823兔子體內(nèi)實驗將各載體關節(jié)內(nèi)注射到1膝關節(jié)。對于病毒載體，每膝中注射懸浮于0.5毫升平衡鹽溶液中的108至109顆粒。
每膝中注射1毫升平衡鹽溶液中的脂質(zhì)體-DNA復合物(200納摩爾DC-Chol與20微克DNA/毫升復合)。(2)分子醫(yī)學方法基因治療方法(Methods in Molecular MedicineGeneTherapy Protocds)，Paul Robbins編，1997，Barr等，205-212頁基于腺病毒的載體傳遞到肝細胞100克(g)動物中大鼠肝細胞1×1011噬斑形成單位(PFU)。
在狗中(12-17公斤(kg))，用大約1.5×1011PFU/kg灌注門靜脈，每宿主DNA二倍體拷貝給出1腺病毒基因組拷貝在兔中(2-4kg)，1.5×1013病毒顆粒(大約1.5×1011PFU)給出100％肝細胞轉(zhuǎn)導；4×1012病毒顆粒給出50-75％轉(zhuǎn)導。Yang N-S等，281-296金顆粒介導的基因傳遞哺乳動物皮膚組織的轉(zhuǎn)染-0.1，0.5，1.0和2.5微克(μg)DNA/毫克(mg)顆粒給出與轉(zhuǎn)基因表達水平的線性關系。Nabel等，297-305在人體中脂質(zhì)體介導的基因傳遞方案115nmol DC-Chol/Dope脂質(zhì)體與1μgDNA混合于0.7ml。
取上述混合液0.2ml注射到病人黑素瘤結。對于導管傳遞，將0.6ml溶液傳遞到動脈中。
方案2將15nmol DMRIE/Dope脂質(zhì)體與5μg DNA混合于1.0ml。
對于直接腫瘤內(nèi)注射，DNA濃度范圍從3μg與4.5nM DMRIE/Dope混合至300μg與450nM DMRIE/Dope混合。(3)Roessler等，369-374基因轉(zhuǎn)移到滑膜使用了劑量范圍109-1012含治療基因/關節(jié)的腺病毒顆粒。然而，對任何特定實驗系列最適劑量需要經(jīng)驗來確定，并且依賴于使用的重組腺病毒基因組主鏈的特征以及表達的轉(zhuǎn)基因。
對于間接方法，已很好建立了多種方法，包括使用基于陽離子脂質(zhì)或陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染及電穿孔。
任何上面的參考技術均可加以改變以適應那些本技術領域普通技術人員的具體需要。這種改進完全在普通操作者擁有的技術水平內(nèi)而不需要過度的實驗。這些明顯的改變在本發(fā)明范圍內(nèi)。
實施例為了更完整的理解本發(fā)明，陳述了下列實施例。這些實施例是為了說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例，而不應解釋為任何意義上對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1產(chǎn)生TNFp-AIG構建體為了在單或多拷貝的相同區(qū)域或不同區(qū)域構建由TNF啟動子的增強子順式元件驅(qū)動的嵌合AIG，進行了負責報告基因的最優(yōu)化誘導表達的感興趣區(qū)域的鑒定。
選擇TNF-α啟動子元件用于構建嵌合基因。使用包含TNFα啟動子多種缺失構建體的引物(圖3)通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增了TNF-α啟動子區(qū)域。使用由其它研究者在多種其它細胞系統(tǒng)中確定的區(qū)域作為參照(Rhoades，et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，22102-22107；Leitman，et al.，Mol.Cell Biol.，1992，12，1352-1356；Pauli U.，Crit.Reviews Eukaryotic GeneExpression，1994，4，323-344)。然后將PCR擴增基因克隆到商業(yè)存在的無啟動子載體中報告基因諸如螢光素酶的上游。在多種細胞系諸如Jurkat(T類成淋巴細胞(T lymphoblastoid))，U973(骨髓單核細胞(myelomonocytic))，THP-1(單核細胞(monocytic))，成纖維細胞和體外培養(yǎng)的人滑膜細胞中檢測這些構建體的組成型和誘導表達。負責報告基因誘導表達的區(qū)域主要基于使用兩種產(chǎn)生TNFα的細胞系，即Jurkat(用PMA激活后)和THP-1(用LPS激活后)(圖4a和b)獲得的結果得到確認。通過使用已良好建立的方法和商品試劑例如DEAE葡聚糖和Superfect瞬時轉(zhuǎn)染這些細胞。然后將負責報告基因誘導表達的TNFα啟動子的順式元件用于構建TNFp-AIG嵌合基因。
構建TNFp-AIG嵌合基因。在此處描述的細胞凋亡誘導基因中，下列基因是優(yōu)選的i)半胱氨酸蛋白酶-CPP32(亦稱為Yama，apopain或Caspase3)以及ii)半胱氨酸蛋白酶-Tx/Ty(Caspase4/Caspase5)AIGs用作“前域缺失的”截短物以潛在地增加Caspase的自催化。這對無活Caspase到活性形式的轉(zhuǎn)換是必要的。
使用相應于密碼子29-36和271-278(278是終止密碼子)的引物擴增了前域缺失的CPP32。截短形式的CPP32此處稱為“α CPP32”或“AIG.1”。
為了PCR擴增前域缺失的Ty，合成了相應于Ty基因中序列的引物。目前發(fā)現(xiàn)的所有Caspases具有與Caspase家族其它成員的同源性。相應于密碼子359-365(密碼子365是終止密碼子)的3′引物與Tx基因中的密碼子372-378(密碼子378是終止密碼子)具有100％序列同源性。然而，相應于Ty基因中密碼子81-87的5′引物與Tx基因中的相應區(qū)域(Tx密碼子94-100)并不100％同源。Ty基因中87位殘基(丙氨酸)與Tx基因中100位殘基(甘氨酸)不同。由于Tx轉(zhuǎn)錄物明顯豐富，從使用激活的人周圍血淋巴細胞制備的cDNA產(chǎn)生的PCR擴增產(chǎn)物包含Tx的序列。因此，使用相應于Ty中序列的合成寡核苷酸引物產(chǎn)生的截短形式的AIG，雖然側翼為引物的Ty序列，實際上與Tx中的序列一樣。除了一個密碼子之外，使用的引物的Ty序列亦與Tx序列一樣。因此本發(fā)明使用的基因與殘基甘氨酸(G)100變?yōu)楸彼?A)的截短Tx基因一致。這個基因此處稱為“ΔTy/x”或“AIG.2”。
AIG.1和AIG.2通過替代螢光素酶報告基因插入到TNFα啟動子刪除構建體(-120，-706和-1005)中TNFα啟動子下游(圖5)。刺激瞬時感染的Jurkat和THP-1細胞后檢測了這些構建體對細胞凋亡的誘導(圖6a，b和c)。
構建TNFα超啟動子-AIG嵌合基因。用PCR擴增了含有負責如上所述(圖4a和4b)報告基因誘導表達的元件的兩個主要優(yōu)選區(qū)域，即TNFα啟動子的ER1(-1005至-905)(序列10)和ER2(-706至-517)(序列11)，并以單拷貝或多拷貝連接到最小天然啟動子(-120通過TSS，序列3)的上游。TNFα啟動子的另兩個區(qū)域(-234至-120)和(-234和-65)亦分別確認為是可能的增強子區(qū)域3(ER3)和增強子區(qū)域4(ER4)，它們可使用下面所述的策略用于嵌合構建體。超啟動子包含多個(2-10)含有誘導啟動子元件的上述區(qū)域的盒(圖7)。這是通過使用限制性位點插到每引物5′端的合成引物路經(jīng)PCR擴增感興趣區(qū)域獲得的。這些獨特限制性位點側翼在擴增的感興趣基因產(chǎn)物。優(yōu)選地，將PCR擴增的AIG克隆到TNF-(超啟動子下游，代替為天然TNFα啟動子所述的原始構建體(圖5)中的螢光素酶報告基因。
下面概述了構建TNFα超啟動子和提供用于有效定向插入的特定限制性位點(在TNF-α啟動子和研究的AIG選擇元件中沒有這些限制性位點)的接頭序列的方案并描述于圖8方案1步驟1將TNF-α最小啟動子(-120至TSS)插入到pGL3基本(不含啟動子(promoterless))螢光素酶載體(Promega)將用于構建嵌合基因TNFp-AIG的pGL3基本載體的元件陳列于下。_KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.BgIII.HindIII.[熒光素酶].XbaI_使用含有XhoI和BgIII.HindIII位點的引物PCR擴增最小啟動子，從而XhoI在擴增產(chǎn)物5′端而BgIII.HindIII位點在擴增引物3′末端。使用這些相同限制性位點，將片端插入到pGL3基本載體的多接頭中。這一構建體稱為“構建體A1”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI_步驟2使用含有多個限制性位點的引物PCR擴增了增強子片段(ER1或ER2)。產(chǎn)生的片段如下將在5′末端有限制性位點KpnI.AatII.BssHII并在3′末端有限制性位點NsiI.Spel.MluI5′KpnI.AatII.BssHII.(ER1或ER2).NsiI.SpeI.MluI3′。使用KpnI和MluI限制性位點將片段插入到步驟1中產(chǎn)生的“構建件A1”中。此構建體稱為“構建體B1”，如下_KpnI.AatII.BssHII.(ER1或ER2).NsiI.SpeI.MluI.NheI.SmaI.XhoI(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI_步驟3使用含有限制性位點AatII和BssHII的引物擴增了TNFα增強子片段(ER1或ER2)，產(chǎn)生了如下PCR產(chǎn)物5′AatII.(ER 1或ER2).BssHII3′。使用這些相同限制性位點將此片段克隆到“構建體B1”中。此構建體稱為“構建體C1”，如下_KpnI.AatII.(ER1或ER2)，BssHII.(ER1或ER2).NsiI.SpeI.MluI.NheISmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI_步驟4使用含有限制性位點NSiI和SpeI的引物擴增了TNFα增強了片段(ER1或ER2)，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物如下5′NsiI.(ER1或ER2).SpeI3′。使用這些相同限制性位點將此片段克隆到“構建體C1”。此構建體稱為“構建體D1”，如下_KpnI.AatII.(ER1或ER2)，BssHII.(ER1或ER2).NsiI.(ER1或ER2).SpeI.MluI.NheI SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI_步驟5使用含有BgIII和XbaI限制性位點的引物PCR擴增了AIG.1或AIG.2(優(yōu)選但不限于AIG.1和AIG.2；可使用列出的任何AIG)編碼區(qū)域，產(chǎn)生如下片段5′BgIII.(AIG.1或AIG.2).XbaI3′。使用這些相同的限制性位點將此片段插入到“構建體D1”。產(chǎn)生的構建體稱為“構建體E1”，如下_KpnI.AatII.(ER1或ER2)，BssHII.(ER1或ER2).NsiI.(ER1或ER2).SpeI.MluI.NheI SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).[AIG.1或AIG.2].XbaI_可替代的方案2如下方案2步驟1如方案1產(chǎn)生“構建體A1”，如下KpnI.SacI.MluI.NheI SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI步驟2插入另外MCS。
利用商業(yè)途徑合成了提供_Nhel.SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI_的兩互補寡核苷酸(5′磷酸化的)。將這些寡核苷酸退火然后克隆到“構建體A1”的NheI和XhoI位點。產(chǎn)生的構建體稱為“構建體B2”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI_步驟3使用在5′末端含限制性位點SpeI.PvuII及在3′端含限制性位點XhoI的引物擴增了TNF-α增強了片段(ER1或ER2)，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物如下5′SpeI.PvuII.(ER1或ER2).XhoI3′。使用SpeI和XhoI限制性位點將此片段克隆到“構建體B2”。此構建體稱為“構建體C2”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.(ER1或ER2)XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI_步驟4使用在5′末端含有限制性位點AvrII.SpeI及在3′末端含限制性位點PvuII的引物擴增了TVFα增強子片段(ER1或ER2)，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物如下5′AvrII.SpeI.(ER1或ER2).PvuII3′。使用AvuII和PvuII限制性位點將此片段克隆到“構建體C2”。此構建體稱為“構建體D2”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.(ER1或ER2)PvuII.(ER1或ER2)XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[熒光素酶].XbaI這樣，使用這種策略可將至少7個拷貝的增強子區(qū)域(ER1，ER2或ER3，單獨或組合)，每次一個，通過利用一個在前一個上游的限制性位點在選擇的增強子區(qū)域的PCR擴增中加上去。
當加上期望數(shù)目拷貝的增強子區(qū)域后，如方案1步驟5中所述將AIG插入到超啟動子的下游。
通過上面提及的細胞系的瞬時轉(zhuǎn)染測定了嵌合TNFp-AIG基因的誘導表達。通過檢測轉(zhuǎn)染細胞的細胞凋亡，使用商品抗體在Westem印跡中鑒定AIG表達的蛋白以及使用商品化的，良好證明了的特定合成四肽底物鑒定蛋白酶活性，測量了TNFp-AIG基因的表達。
通過瞬時轉(zhuǎn)染相同的細胞測定了嵌合TNFp-AIG基因的誘導表達。轉(zhuǎn)染細胞的FasL的細胞表面表達使用抗-FasL抗體結合經(jīng)間接免疫熒光和測定Fas陽性細胞的細胞凋亡誘導進行了定量。
TNFp-驅(qū)動的報告基因表達的調(diào)節(jié)。TNFα基因3′非翻譯區(qū)在調(diào)節(jié)TNFα生物合成調(diào)節(jié)中起重要作用。它與正常非活性狀態(tài)的TNFα基因的翻譯表達有關。重要的是，當產(chǎn)生TNFα的細胞由外界刺激活化時，這些元素使脫阻抑發(fā)生(Han.J.，et al.，J.Immunology，1991，146，1843-1848；Crawford，F(xiàn).K.，et al.，J.Biol.Chem.，1996，271，2238 3-22390)。
制造的遺傳構建體，將完整的3′非翻譯區(qū)(序列13)插入到由缺失片段即TNFα啟動子的-120，-706和-1005驅(qū)動的螢光素酶基因下游。這些構建體的瞬時表達的結果總結于圖9。
實施例2檢測方案體外方法螢光素酶檢測使用商品化試劑(Promega)確定螢光素酶活性。AIG.1和AIG.2基因表達a)使用抗-CPP32抗體及抗PRAP抗體進行了轉(zhuǎn)染細胞裂解物的Western印跡測定?？?PRAP抗體檢測水解的和未水解的作為CPP32酶反應的PRAP產(chǎn)物。b)CPP32酶檢測此檢測測定CPP32的酶反應及比色或產(chǎn)熒光底物的斷裂。此檢測中使用商品化試劑盒(Clonotech，Pharmingen)。c)轉(zhuǎn)染細胞的細胞凋亡通過碘化丙錠染核(Krishan，A.，J.Cell Biol.，66，1994，188-193)及商品化細胞死亡酶聯(lián)免疫吸附測定(Cell Death Elisa)試劑盒(Boehringer Mannheim)檢測了由AIG.1和AIG.2引起的轉(zhuǎn)染細胞的細胞凋亡。動物模型IL-1誘導關節(jié)炎的兔模型(Pettipher E.R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986，83，8749-8753)將IL-1注射到新西蘭白兔的膝關節(jié)。IL-1的關節(jié)內(nèi)注射造成白細胞劑量依賴性浸潤入關節(jié)腔以及從關節(jié)軟骨喪失蛋白聚糖。
抗原誘導的關節(jié)炎關節(jié)內(nèi)注射抗原(卵清蛋白)到膝關節(jié)誘導白細胞聚集和軟骨降解，非常類似于人的類風濕性關節(jié)炎。注射后的關節(jié)腫脹保持14天。
嚴重聯(lián)合免疫缺陷病(Scid)鼠-人滑膜細胞模型(Houri J.M.，et al.Current Opinions in Rheumatol.，1995，7，201-205；Sack U.，et al.，J.Autoimmunity，1995，9，51-58；Geiler T.，et al.，Arthritis & Rheumatism，1994，37，1664-1671)這些是最近開發(fā)的關節(jié)炎模型，其中將來自RA病人的新鮮滑膜組織與正常人軟骨一起移植到scid鼠皮下，腎被膜下(Geiler T.et al.，Arthritis & Rheumatism，1994，37，1664-1671)，或膝關節(jié)中(Sack U.，et al.，J.Autoimmunity，1995，9，51-58)。移植物的生長具類似關節(jié)炎特征，包括形成高細胞密度的關節(jié)翳組織，骨和軟骨侵蝕，產(chǎn)生多核巨大細胞，以及滑膜成纖維細胞對軟骨的侵蝕。
間接方法用治療基因體外轉(zhuǎn)染滑膜細胞并移植回兔中。通過注射IL-1在這些兔中誘導關節(jié)炎并評價激活后治療基因的表達。嵌合基因的激活誘導的表達在移植細胞中誘導細胞調(diào)亡。
直接方法嵌合基因的關節(jié)內(nèi)注射。可以使用上述的所有基因傳遞方法，包括裸質(zhì)粒DNA，陽離子脂質(zhì)體介導的傳遞。為了使用基于病毒載體的傳遞，將嵌合基因克隆到合適的載體。然后通過刪除這些載體中的真核啟動子修飾載體。然后關節(jié)內(nèi)注射插入到適當載體的治療基因，以評價治療和預防功效。
實施例3選擇不產(chǎn)生TNF-α的體細胞變體用TNFp-AIG嵌合基因體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(THP-1，Jurkat)。在幾輪的刺激后，在表達TNFp-AIG基因的細胞中誘導細胞凋亡，然后收集存活的細胞。構建了這些細胞的cDNA文庫，用于功能性克隆(LegerskiR and PetersonC.，Nature，1992，359，70-73；Jaattela M.，et al.，Oncogene，1995，10，2297-2305)。
實施例4顯性失活(DN)基因的鑒定和表征用TNFp-AIG穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的THP-1和Jurkat細胞進行重復循環(huán)的刺激以激活TNFp-AIG的表達。不表達負調(diào)節(jié)基因的細胞發(fā)生細胞凋亡，而表達顯性失活基因的細胞存活。在這些存活細胞中，DN基因產(chǎn)物與TNFα啟動子反式作用，從而抑制其激活以轉(zhuǎn)錄AIG，最終導致存活表型。使用這些細胞中的聚腺苷酸化mRNA構建了cDNA文庫。通過如描述其它基因的功能性克隆確認了將TNFp-AIG-轉(zhuǎn)染的THP-1或Jurkat細胞從細胞凋亡中拯救的DN基因(Legerski R.and Peterson C.，Nature，1992，359，70-73；Jaattela，M.，al.，Oncogene，1995，10，2297-2305)。
上面的描述是為了教會本技術領域普通技術人員怎樣實踐本發(fā)明，而不是意圖詳細描述熟練技術人員讀了描述后很明顯的那些顯然的改進和變化。然而，我們打算由下面的權利要求定義，在本發(fā)明范圍內(nèi)包括這些明顯的改進和變化。權利要求意圖覆蓋權利要求的組合物和任何順序的步驟，除非文中特別指出的反面，它們能有效滿足它們意圖的目標。
此處引用的文章明顯以參考文獻完整并入本發(fā)明。
序列表(1)一般資料(i)申請人Revati J.Tatake，Steven D.Marlin和Randall W.Barton(ii)發(fā)明名稱通過基因治療炎性細胞的自我調(diào)節(jié)的細胞凋亡(iii)序列數(shù)目13(iv)通訊地址(A)地址Boehringer Ingelheim Corporation(B)街道900 Ridgebury Road，P.O.Box 368(C)城市Ridgefield(D)州Connecticut(E)國家United States of America(F)郵編06877-0368(v)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5″1.44Mb軟盤(B)計算機IBM PC(C)操作系統(tǒng)MS DOS(D)軟件word程序(vi)現(xiàn)在申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎付?B)填表日期同此(D)分類(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?0/038,266(B)填表日期97年2月28日(viii)律師資料(A)名字Robert P.Raymond(B)登記號25089(C)參考/檔案號9/121PCT(ix)通訊資料(A)電話203-789-4865(B)電傳203-791-6183(2)系列資料1(i)序列特征(A)長度1178(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞參照人TNFα啟動子(x)發(fā)表資料(A)作者Takashiba，S.，et al.
(C)期刊基因(Gene)(D)卷131(E)頁307-308(xi)序列描述序列1GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA50GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC100TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG150GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG AGTATCGGGG ACCCCCCCTT200AACGAAGACA GGGCCATGTA GAGGGCCCCA GGGAGTGAAA GAGCCTCCAG250GACCTCCAGG TATGGAATAC AGGGGACGTT TAAGAAGATA TGGCCACACA300CTGGGGCCCT GAGAAGTGAG AGCTTCATGA AAAAAATCAG GGACCCCAGA350GTTCCTTGGA AGCCAAGACT GAAACCAGCA TTATGAGTCT CCGGGTCAGA400ATGAAAGAAG AAGGCCTGCC CCAGTGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT450TCACTCCCCG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT500TCCTGAGGCC TCAAGCTGCC ACCAAGCCCC CAGCTCCTTC TCCCCGCAGA550CCCAAACACA GGCCTCAGGA CTCAACACAG CTTTTCCCTC CAACCCCGTT600TTCTCTCCCT CAAGGACTCA GCTTTCTGAA GCCCCTCCCA GTTCTAGTTC650TATCTTTTTC CTGCATCCTG TCTGGAAGTT AGAAGGAAAC AGACCACAGA700CCTGGTCCCC AAAAGAAATG GAGGCAATAG GTTTTGAGGG GCATGGGGAC750GGGGTTCAGC CTCCAGGGTC CTACACACAA ATCAGTCAGT GGCCCAGAAG800ACCCCCCTCG GAATCGGAGC AGGGAGGATG GGGAGTGTGA GGGGTATCCT850TGATGCTTGT GTGTCCCCAA CTTTCCAAAT NCCCGCCCCC GCGATGGAGA900AGAAACCGAG ACAGAAGGTG CAGCGCCCAC TACCGCTTCC TCCAGATGAG950CTTATGGGTT TCTCCACCAA GGAAGTTTTC CGCTGGTTGA ATGATTCTTT 1000CCCCGCCCTC CTCTCGCCCC AGGGACATAT AAAGGCAGTT GTTGGCACAC 1050CCAGCCAGCA GACGCTCCCT CAGCAAGGAC AGCAGAGGAC CAGCTAAGAG 1100GGAGAGAAGC AACTGCAGAC CCCCCCTGAA AACAACCCTC AGACGCCACA 1150TCCCCTGACA AGCTGCCAGG CAGGTTCT 1178(3)系列資料2(i)序列特征(A)長度1069(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞人TNFα啟動子基因(x)發(fā)表資料(A)作者Takashiba，S.，等(C)期刊Gene(D)卷131(E)頁307-308(xi)序列描述序列2GAGGCCGCCA GACTGCTGCA GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA 50AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT 100ATGGCCACAT GTAGCGGCTC TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG 150AGATGTGACC ACAGCAATGG GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG 200AGTATGGGGA CCCCCCCTTA ACGAAGACAG GGCCATGTAG AGGGCCCCAG 250GGAGTGAAAG AGCCTCCAGG ACCTCCAGGT ATGGAATACA GGGGACGTTT 300AAGAAGATAT GGCCACACAC TGGGGCCCTG AGAAGTGAGA GCTTCATGAA 350AAAAATCAGG GACCCCAGAG TTCCTTGGAA GCCAAGACTG AAACCAGCAT 400TATGAGTCTC CGGGTCAGAA TGAAAGAAGA AGGCCTGCCC CAGTGGGGTC 450TGTGAATTCC CGGGGGTGAT TTCACTCCCC GGGGCTGTCC CAGGCTTGTC 500CCTGCTACCC CCACCCAGCC TTTCCTGAGG CCTCAAGCCT GCCACCAAGC 550CCCCAGCTCC TTCTCCCCGC AGGGACCCAA ACACAGGCCT CAGGACTCAA 600CACAGCTTTT CCCTCCAACC CCGTTTTCTC TCCCTCAAGG ACTCAGCTTT 650CTGAAGCCCC TCCCAGTTCT AGTTCTATCT TTTTCCTGCA TCCTGTCTGG 700AAGTTAGAAG GAAACAGACC ACAGACCTGG TCCCCAAAAG AAATGGAGGC 750AATAGGTTTT GAGGGGCATG GGGACGGGGT TCAGCCTCCA GGGTCCTACA 800CACAAATCAG TCAGTGGCCC AGAAGACCCC CCTCGGAATC GGAGCAGGGA 850GGATGGGGAG TGTGAGGGGT ATCCTTGATG CTTGTGTGTC CCCAACTTTC 900CAAATCCCCG CCCCCGCGAT GGAGAAGAAA CCGAGACAGA AGGTGCAGGG 950CCCACTACCG CTTCCTCCAG ATGAGCTCAT GGGTTTCTCC ACCAAGGAAG1000TTTTCCGCTG GTTGAATGAT TCTTTCCCCG CCCTCCTCTC GCCCCAGGGA1050CATATAAAGG CAGTTGTTGG CACACCCAGC CAGCAGACGC TCCCTC1096(4)系列資料3(i)序列特征
(A)長度139(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞天然最小TNFα啟動子(xi)序列描述序列3CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100AGGCAGTTGT ATGGCACACC CGCCAGCAGA CGCTCCCTC 139(5)系列資料4(i)序列特征(A)長度904(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞嵌合基因TNFp120 AIG.1(D)其它資料殘基1至139含啟動子序列；殘基140至151，接頭序列，及剩余殘基含AIG.1序列。
(xi)序列描述序列4CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA CGCTCCCTCA GCAGATCCAC 150CATGTCTGGA ATATCCCTGG ACAACAGTTA TAAAATGGAT TATCCTGAGA 200TGGGTTTATG TATAATAATT AATAATAAGA ATTTTCATAA AAGCACTGGA 250ATGACATCTC GGTCTGGTAC AGATGTCGAT GCAGCAAACC TCAGGGAAAC 300ATTCAGAAAC TTGAAATATG AAGTCAGGAA TAAAAATGAT CTTACACGTG 350AAGAAATTGT GGAATTGATG CGTGATGTTT CTAAAGAAGA TCACAGCAAA 400AGGAGCAGTT TTGTTTGTGT GCTTCTGAGC CATGGTGAAG AAGGAATAAT 450TTTTGGAACA AATGGACCTG TTGACCTGAA AAAAATAACA AACTTTTTCA 500GAGGGGATCG TTGTAGAAGT CTAACTGGAA AACCCAAACT TTTCATTATT 550CAGGCCTGCC GTGGTACAGA ACTGGACTGT GGCATTGAGA CAGACAGTGG 600TGTTGATGAT GACATGGCGT GTCATAAAAT ACCAGTGGAG GCCGACTTCT 650TGTATGCATA CTCCACAGCA CCTGGTTATT ATTCTTGGCG AAATTCAAAG 700GATGGCTCCT GGTTCATCCA GTCGCTTTGT GCCATGCTGA AACAGTATGC 750CGACAAGCTT GAATTTATGC ACATTCTTAC CCGGGCTAAC CGAAAGGTGG 800CAACAGAATT TGAGTCCTTT TCCTTTGACG CTACTTTTCA TGCAAAGAAA 850CAGATTCCAT GTATTGTTTC CATGCTCACA AAAGAACTCT ATTTTTATCA 900CTAA 9~(6)系列資料5(i)序列特征(A)長度1490(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞嵌合基因TNFp 706 AIG.1(D)其它資料殘基1至724含啟動子序列；殘基725至736，接頭序列，及剩余殘基含AIG.1序列。(xi)序列描述序列5TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT100TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT150TTCCTGAGGC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG200GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC250GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG300TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC350AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG400GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG450AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT500CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG550AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT600GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC650TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA700CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC750CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA800TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT850GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA900ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT950TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAGGAG CAGTTTTGTT 1000TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 1050ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1100GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1150ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1200GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1250CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1300ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT TGCTGAAACA GTATGCCGAC AAGCTTGAAT 1350TTATGCACAT TCTTACCCGG GCTAACCGAA AGGTGGCAAC AGAATTTGAG 1400TCCTTTTCCT TTGACGCTAC TTTTCATGCA AAGAAACAGA TTCCATGTAT 1450TGTTTCCATG CTCACAAAAG AACTCTATTT TTATCACTAA1490(7)系列資料6(i)序列特征(A)長度1789(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞嵌合基因TNFp1005 AIG.1(D)其它資料殘基1至1023含啟動子序列；殘基1024至1036，接頭序列，及剩余殘基含AIG.1序列。
(xi)序列描述序列6GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 250GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 300CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT 400CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 650AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 850AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 900GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 950TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA1000CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC1050CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA1100TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT1150GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA1200ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT1250TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAGGAG CAGTTTTGTT1300TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 1350ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1400GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1450ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1500GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1550CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1600ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT GCTGAAACAG TATGCCGACA AGCTTGAATT 1650TATGCACATT CTTACCCGGG CTAACCGAAA GGTGGCAACA GAATTTGAGT 1700CCTTTTCCTT TGACGCTACT TTTCATGCAA AGAAACAGAT TCCATGTATT 1750GTTTCCATGC TCACAAAAGA ACTCTATTTT TATCACTAA 1789(8)系列資料7(i)序列特征(A)長度1008(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞嵌合基因TNFp120 AIG.2(D)其它資料殘基1至138含啟動子序列；殘基139至150，接頭序列，及剩余殘基含AIG.2序列(xi)序列描述序列7CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA100AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA GCTCCCTCAG CAGATCCACC150ATGGCTGGAC CACCTGAGTC AGCAGAATCT ACAGATGCCC TCAAGCTTTG200TCCTCATGAA GAATTCCTGA GACTATGTAA AGAAAGAGCT GAAGAGATCT250ACCCAATAAA GGAGAGAAAC AACCGCACAC GCCTGGCTCT CATCATATGC300AATACAGAGT TTGACCATCT GCCTCCGAGG AATGGAGCTG ACTTTGACAT350CACAGGGATG AAGGAGCTAC TTGAGGGTCT GGACTATAGT GTAGATGTAG400AAGAGAATCT GACAGCCAGG GATATGGAGT CAGCGCTGAG GGCATTTGCT450ACCAGACCAG AGCACAAGTC CTCTGACAGC ACATTCTTGG TACTCATGTC500TCATGGCATC CTGGAGGGAA TCTGCGGAAC TGTGCATGAT GAGAAAAAAC550CAGATGTGCT GCTTTATGAC ACCATCTTCC AGATATTCAA CAACCGCAAC600TGCCTCAGTC TGAAGGACAA ACCCAAGGTC ATCATTGTCC AGGCCTGCAG650AGGTGCAAAC CGTGGGGAAC TGTGGGTCAG AGACTCTCCA GCATCCTTGG700AAGTGGCCTC TTCACAGTCA TCTGAGAACC TGGAGGAAGA TGCTGTTTAC750AAGACCCACG TGGAGAAGGA CTTCATTGCT TTCTGCTCTT CAACGCCACA800CAACGTGTCC TGGAGAGACA GCACAATGGG CTCTATCTTC ATCACACAAC850TCATCACATG CTTCCAGAAA TATTCTTGGT GCTGCCACCT AGAGGAAGTA900TTTCGGAAGG TACAGCAATC ATTTGAAACT CCAAGGGCCA AAGCTCAAAT950GCCCACCATA GAACGACTGT CCATGACAAG ATATTTCTAC CTCTTTCCTG 1000GCAATTGA 1008(9)系列資料8(i)序列特征(A)長度1587(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞嵌合基因TNFp706 AIG.2(D)其它資料殘基1至724含有啟動子序列；殘基725至736，接頭序列，及剩余殘基含AIG.2序列(xi)序列描述序列8TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT TCTCCCCGCA 200GGGACCCAAA CACAGGCCTC AGGACTCAAC ACAGCTTTTC CCTCCAACCC 250CGTTTTCTCT CCCTCAAGGA CTCAGCTTTC TGAAGCCCCT CCCAGTTCTA 300GTTCTATCTT TTTCCTGCAT CCTGTCTGGA AGTTAGAAGG AAACAGACCA 350CAGACCTGGT CCCCAAAAGA AATGGAGGCA ATAGGTTTTG AGGGGCATGG 400GGACGGGGTT CAGCCTCCAG GGTCCTACAC ACAAATCAGT CAGTGGCCCA 450AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 500CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 750TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 800TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 850AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 900CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT GACATCACAG GATGAAGGAG 950TACTTGAGGG TCTGGACTAT GTGTAGATGT GAAGAGAATC GACAGCCAGG1000ATATGGAGTC AGCGCTGAGG GCATTTGCTA CCAGACCAGA GCACAAGTCC1050TCTGACAGCA CATTCTTGGT ACTCATGTCT CATGGCATCC TGGAGGGAAT1100CTGCGGAACT GTGCATGATG AGAAAAAACC AGATGTGCTG CTTTATGACA1150CCATCTTCCA GATATTCAAC AACCGCAACT GCCTCAGTCT GAAGGACAAA1200CCCAAGGTCA TCATTGTCCA GGCCTGCAGA GGTGCAAACC GTGGGGAACT1250GTGGGTCAGA GACTCTCCAG CATCCTTGGA AGTGGCCTCT TCACAGTCAT1300CTGAGAACCT GGAGGAAGAT GCTGTTTACA AGACCCACGT GGAGAAGGAC1350TTCATTGCTT TCTGCTCTTC AACGCCACAC AACGTGTCCT GGAGAGACAG1400CACAATGGGC TCTATCTTCA TCACACAACT CATCACATGC TTCCAGAAAT1450ATTCTTGGTG CTGCCACCTA GAGGAAGTAT TTCGGAAGGT ACAGCAATCA1500TTTGAAACTC CAAGGGCCAA AGCTCAAATG CCCACCATAG AACGACTGTC1550CATGACAAGA TATTTCTACC TCTTTCCTGG CAATTGA 1587(10)系列資料9(i)序列特征(A)長度1894(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞嵌合基因TNFp1005 AIG.2(D)其它資料殘基1至1024含啟動子序列；殘基1025至1036，接頭序列，及剩余殘基含AIG.2序列(xi)序列描述序列9GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT100AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC150GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC200CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG250GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT300CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG350AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT400CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT450TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG500GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC550GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG600TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC650AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG700GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG750AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT800CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG850AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT900GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC950TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 1000CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 1050TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 1100TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 1150AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 1200CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT TGACATCACA GGGATGAAGG 1250AGCTACTTGA GGGTCTGGAC TATAGTGTAG ATGTAGAAGA GAATCTGACA 1300GCCAGGGATA TGGAGTCAGC GCTGAGGGCA TTTGCTACCA GACCAGAGCA 1350CAAGTCCTCT GACAGCACAT TCTTGGTACT CATGTCTCAT GGCATCCTGG 1400AGGGAATCTG CGGAACTGTG CATGATGAGA AAAAACCAGA TGTGCTGCTT 1450TATGACACCA TCTTCCAGAT ATTCAACAAC CGCAACTGCC TCAGTCTGAA 1500GGACAAACCC AAGGTCATCA TTGTCCAGGC CTGCAGAGGT GCAAACCGTG 1550GGGAACTGTG GGTCAGAGAC TCTCCAGCAT CCTTGGAAGT GGCCTCTTCA 1600CAGTCATCTG AGAACCTGGA GGAAGATGCT GTTTACAAGA CCCACGTGGA 1650GAAGGACTTC ATTGCTTTCT GCTCTTCAAC GCCACACAAC GTGTCCTGGA 1700GAGACAGCAC AATGGGCTCT ATCTTCATCA CACAACTCAT CACATGCTTC 1750CAGAAATATT CTTGGTGCTG CCACCTAGAG GAAGTATTTC GGAAGGTACA 1800GCAATCATTT GAAACTCCAA GGGCCAAAGC TCAAATGCCC ACCATAGAAC 1850GACTGTCCAT GACAAGATAT TTCTACCTCT TTCCTGGCAA TTGA1894(11)系列資料10(i)序列特征(A)長度123(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞TNFα啟動子增強子區(qū)域1(ER1)(xi)序列描述序列10GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC 50TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG 100GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATG 123(12)系列資料11(i)序列特征(A)長度190(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞TNFα啟動子增強子區(qū)域2(ER2)(xi)序列描述序列11TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT100TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT150TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT 190(13)系列資料12(i)序列特征(A)長度223(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/關鍵詞多克隆位點(D)其它資料遺傳工程多克隆位點，遺傳工程操作到-120pGL3構建體中最小TNFα啟動子上游。
(xi)序列描述序列12GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCGCG GATATCTTAA GACGTCCTAG 50GACTAGTCAG CTGCTCGAGC CGCTTCCTCC AGATGAGCTC ATGGGTTTCT100CCACCAAGGA AGTTTTCCGC TGGTTGAATG ATTCTTTCCC CGCCCTCCTC150TCGCCCCAGG GACATATAAA GGCAGTTGTT GGCACACCCA GCCAGCAGAC200GCTCCCTCAG CAGATCTAAG CTT 223(14)系列資料13(i)序列特征(A)長度787(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型(A)描述DNA(ix)特征
(A)名字/關鍵詞TNFα(不翻譯區(qū)域(xi)序列描述序列13TCTAGAGGAG GACGAACATC CAACCTTCCC AAACGCCTCC CCTGCCCCAA 50TCCCTTTATT ACCCCCTCCT TCAGACACCC TCAACCTCTT CTGGCTCAAA100AAGAGAATTG GGGGCTTAGG GTCGGAACCC AAGCTTAGAA CTTTAAGCAA150CAAGACCACC ACTTCGAAAC CTGGGATTCA GGAATGTGTG GCCTGCACAG200TGAAGTGCTG GCAACCACTA AGAATTCAAA CTGGGGCCTC CAGAACTCAC250TGGGGCCTAC AGCTTTGATC CCTGACATCT GGAATCTGGA GACCAGGGAG300CCTTTGGTTC TGGCCAGAAT GCTGCAGGAC TTGAGAAGAC CTCACCTAGA350AATTGACACA AGTGGACCTT AGGCCTTCCT CTCTCCAGAT GTTTCCAGAC400TTCCTTGAGA CACGGAGCCC AGCCCTCCCC ATGGAGCCAG CTCCCTCTAT450TTATGTTTGC ACTTGTGATT ATTTATTATT TATTTATTAT TTATTTATTT500ACAGATGAAT GTATTTATTT GGGAGACCGG GGTATCCTGG GGGACCCAAT550GTAGGAGCTG CCTTGGCTCA GACATGTTTT CCGTGAAAAC GGAGCTGAAC600AATAGGCTGT TCCCATGTAG CCCCCTGGCC TCTGTGCCTT CTTTTGATTA650TGTTTTTTAA AATATTTATC TGATTAAGTT GTCTAAACAA TGCTGATTTG700GTGACCAACT GTCACTCATT GCTGAGCCTC TGCTCCCCAG GGGAGTTGTG750TCTGTAATCG CCCTACTATT CAGTGGCGAG ATCTAGA 78權利要求
1.一種嵌合基因，含有至少一個連接到一個功能拷貝的最小TNFα啟動子并進一步連接到至少一個拷貝的細胞凋亡誘導基因的TNFα啟動子增強子，其中由TNFα啟動子驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達。
2.依據(jù)權利要求1的基因，其中增強子對啟動子的連接和啟動子對細胞凋亡誘導基因的連接是從包括直接連接，遠端連接，鄰近連接及其組合的組中選擇的。
3.依據(jù)權利要求1的基因，包含2個或更多拷貝的TNFα啟動子增強子。
4.依據(jù)權利要求1的基因，其中TNFα啟動子增強子是序列10或序列11，或其功能性片段或變體。
5.依據(jù)權利要求1的基因，其中TNFα啟動子選自含有序列1，序列2，序列3，及其功能性片段或變體的組中。
6.依據(jù)權利要求1的基因，其中細胞凋亡誘導基因選自含有caspase-1，caspase-2，caspase-3，caspase-4，caspase-5，caspase-6，caspase-7，caspase-8，caspase-9，caspase-10，粒酶A，粒酶B，F(xiàn)as配體，及其任何的功能性片段，變體，和混合物的組中。
7.依據(jù)權利要求6的基因，其中細胞凋亡誘導基因選自含有caspase3，caspase4，caspase5，粒酶B及其任何的功能性片段，變體，和混合物的組中。
8.依據(jù)權利要求1的基因，選自含有序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9及其功能性片段或變體的組中。
9.依據(jù)權利要求1的基因，選自含有序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9及其功能性片段或變體的組中，其中TNF α基因的3′UTR連接到細胞凋亡誘導基因的下游。
10.含有依據(jù)權利要求1基因的藥物組合物。
11.含有依據(jù)權利要求9基因的藥物組合物。
12.在病人中治療炎性疾病的方法，包含通過向細胞中引入依據(jù)權利要求1的嵌合基因在病人炎性細胞或炎癥部位細胞中誘導細胞凋亡的步驟。
13.依據(jù)權利要求12的方法，其中細胞凋亡的誘導在病人中不誘導炎性反應。
14.依據(jù)權利要求12的方法，其中炎性細胞是TNFα產(chǎn)生細胞。
15.依據(jù)權利要求12的方法，其中炎性疾病選自包括類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，急性熱病性多神經(jīng)炎，局限性回腸炎，潰瘍性結腸炎，銀屑病，移植物對抗宿主疾病，紅斑狼瘡，胰島素依賴性糖尿病，銀屑性關節(jié)炎，結節(jié)病，過敏性肺炎，類風濕性脊椎炎，賴特綜合征，及全身性硬皮病的組中。
16.依據(jù)權利要求15的方法，其中炎性疾病是類風濕性關節(jié)炎。
17.一種嵌合基因，包含2至10盒的連續(xù)到至少一個拷貝的最小TNFα啟動子的TNFα啟動子增強子，及至少一個拷貝的選自包括caspase3，caspase4，caspase5，粒酶B及其任何功能性片段，變體和混合物的組中的細胞凋亡誘導基因，其中由TNF啟動子驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達。
18.包含依據(jù)權利要求17的基因的藥物組合物。
19.通過向細胞中引入依據(jù)權利要求17的嵌合基因在產(chǎn)生TNFα炎性細胞中誘導細胞凋亡的方法。
20.治療病人炎性疾病的方法，包括通過向細胞中引入依據(jù)權利要求17的嵌合基因在炎性細胞或炎癥部位細胞中誘導細胞凋亡，而不在病人中引起炎性反應。
21.構建包含至少一個連接到一個功能性拷貝的最小TNFα啟動子并進一步連接到至少一個拷貝的細胞凋亡誘導基因的TNFα啟動子增強子的嵌合基因的過程，其中由TNFα啟動子驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達，包含步驟(a)使用含有TNFα啟動子的缺失構建體的引物通過聚合酶鏈式反應擴增TNFα啟動子；(b)將步驟(a)中獲得的PCR擴增的基因克隆到報告基因上游；(c)在至少一種產(chǎn)生TNFα的細胞系中測定步驟(b)中獲得的構建體的組成型和誘導表達；(d)選擇負責報告基因在細胞系中表達的TNFα啟動子；并或者(e)PCR擴增增強報告基因表達的TNFα啟動子區(qū)域以獲得增強子并連接至少一個拷貝的增強子到啟動子上游；或者(f)通過用細胞凋亡誘導基因缺失構建體代替報告基因?qū)⒅辽僖粋€拷貝的前域缺失的細胞凋亡誘導基因插入TNFα啟動子下游以得到嵌合基因或(g)PCR擴增TNFα-3′UTR并連接到報告基因下游，或這些步驟的任何組合。
22.依據(jù)權利要求21的方法，其中將2或更多拷貝的增強子插入到啟動子上游。
23.依據(jù)權利要求21的方法，其中報告基因是螢光素酶。
24.依據(jù)權利要求21的方法，其中的增強子含序列10或序列11。
25.依據(jù)權利要求21的方法，其中前域缺失的細胞凋亡誘導基因選自包括caspase3，caspase4，caspase5，粒酶B，及其功能性片段和變體的組中。
27.依據(jù)權利要求21的方法，產(chǎn)生選自含序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9及其功能性片段或變體的組中的基因。
28.依據(jù)權利要求21的方法，其中用于檢測構建體的細胞系選自包括T類成淋巴細胞，骨髓單核細胞，單核細胞，成纖維細胞，和培養(yǎng)的人滑膜細胞。
29.一種嵌合基因包括(a)至少一個連接到一個功能拷貝的最小啟動子的啟動子增強子，條件是啟動子是在炎性細胞或炎癥部位細胞中激活的基因或基因組合，以及(b)進一步連接到至少一個拷貝的細胞凋亡誘導基因，其中由該啟動子驅(qū)動細胞凋亡誘導基因的表達，并且啟動子選自包括細胞因子，白細胞介素及其受體，細胞粘附分子及其配體，趨化因子及其受體，促炎酶，及其混合物的組中。
31.依據(jù)權利要求29的基因，其中啟動子選自包括TNFβ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，GM-CSF，干擾素γ，其功能性片段和變體，以及其任何混合物的組中。
32.依據(jù)權利要求29的基因，其中啟動子選自含有選擇蛋白，整聯(lián)蛋白，ICAM-1，V-CAM，其功能片段和變體，和其任何混合物。
33.依據(jù)權利要求29的基因，其中啟動子選自含有MIP-1α，MIP-1β，MCP1-4，RANTES，Mig，NAP2，IP10，Groα-γ，其功能性片段和變體，以及其任何混合物的組中。
34.依據(jù)權利要求29的基因，其中啟動子選自包括COX-2，iNOS，磷脂酶，蛋白酶，其功能性片段和變體，以及其任何混合物的組中。
35.依據(jù)權利要求29的基因，其中增強了對啟動子的連接和啟動子對細胞凋亡誘導基因的連接選自包括直接連接，遠端連接，鄰近連接，及其組合的組中。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過向細胞中引入含有在炎癥中由活性的誘導基因的啟動于驅(qū)動的細胞凋亡誘導基因(AIG)和炎癥細胞靶向的啟動子增強子的嵌合基因,在活性炎癥細胞或炎癥部位細胞中治療性誘導細胞凋亡。在一個實施方案中,嵌合基因含有至少一個與最小腫瘤壞死因子α(TNFα)啟動子功能拷貝結合的TNFα啟動子增強子并進一步與至少一個拷貝的細胞凋亡誘導基因結合,其中基因的表達是由TNFα啟動于驅(qū)動的。結合可以是直接的,在遠側的,鄰近的或其組合。細胞凋亡誘導基因的例子包括caspase 3,caspase 4,caspase 5,粒酶B等。TNFp－AIG嵌合基因只在產(chǎn)生炎性細胞因子,TNFα的細胞中表達是有利的。此外,TNFp－AIG嵌合基因亦螫合誘導TNFp轉(zhuǎn)錄因子,從而降低內(nèi)源TNFα的產(chǎn)生。本發(fā)明亦涉及制造和使用自我調(diào)節(jié)細胞凋亡嵌合基因及含有它們用于治療炎癥疾病的藥物組合物。
文檔編號A61K48/00GK1249688SQ98802960
公開日2000年4月5日 申請日期1998年2月27日 優(yōu)先權日1997年2月28日
發(fā)明者雷瓦蒂·J·塔塔克, 史蒂文·D·馬林, 蘭德爾·W·巴頓 申請人:貝林格爾·英格海姆藥物公司