本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種深海沉積物來源羧酸酯酶、其編碼基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂類水解酶包括羧酸酯酶(EC3.1.1.1)和脂肪酶(EC3.1.1.3)，廣泛存在于微生物中，能夠催化酯類化合物的水解和合成。羧酸酯酶主要催化少于10個碳的短鏈?；视?，脂肪酶主要催化大于10個碳的長鏈?；视?。脂類水解酶具有許多優(yōu)良特性，如催化反應(yīng)不需要輔助因子，手型選擇特異性高，擁有較廣的底物譜，以及在有機(jī)溶劑中保持高穩(wěn)定性等。脂類水解酶是工業(yè)生產(chǎn)中重要的催化劑，可廣泛應(yīng)用于手性藥物催化、皮革絹紡原料脫脂、廢水處理、洗滌工業(yè)以及食品加工等方面。

目前已經(jīng)有許多微生物來源的脂肪酶得到了商業(yè)化生產(chǎn)，并在生產(chǎn)生活的各個方面得到應(yīng)用。而羧酸酯酶作為一種重要的工業(yè)用酶，在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用的種類和數(shù)量還十分有限。新型羧酸酯酶資源的挖掘和積累是滿足食品和化工等工業(yè)對羧酸酯酶日益增長需求的必要條件。本發(fā)明運(yùn)用宏基因組構(gòu)建和羧酸酯酶活性篩選的技術(shù)，獲得深海來源新型羧酸酯酶，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的深海來源羧酸酯酶、其編碼基因及其制備方法，該羧酸酯酶可用于酯類降解及其他酯類化合物的生物催化和轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明從太平洋海山深海沉積物宏基因組文庫中，以三丁酸甘油酯作為底物篩選羧酸酯酶活性，獲得一種新的羧酸酯酶DMWf18-558，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

將該羧酸酯酶序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，與之相似性最高的也是宏基因組來源的酯酶，相似性為82％(其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊號為AFB82690)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，羧酸酯酶DMWf18-558屬于脂類水解酶家族中的第IV家族。根據(jù)氨基酸序列推測，羧酸酯酶DMWf18-558的催化中心由絲氨酸、谷氨酸和組氨酸(氨基酸位置為144、238和268)組成，其中絲氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸(氨基酸位置為142至146)組成的保守序列中，因此羧酸酯酶DMWf18-558屬于第IV家族GDSAG亞家族。氧離子洞位于75和76位兩個甘氨酸。綜上所述，DMWf18-558應(yīng)為脂類水解酶第IV家族中的一名新成員。

在不影響酯酶DMWf18-558蛋白活性前提下，可對SEQ ID NO:2所示的遠(yuǎn)離催化中心氨基酸位置(優(yōu)選142-146、238和268氨基酸位置)的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有酯酶DMWf18-558活性的衍生蛋白質(zhì)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)的公知常識，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性是和其功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)的。一般來說，只有發(fā)生在功能結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)突變可能對蛋白質(zhì)的二維和三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響其生物學(xué)活性。而對于發(fā)生在遠(yuǎn)離功能結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選遠(yuǎn)離142-146、238和268位氨基酸位置)的氨基酸位點(diǎn)，由于這一區(qū)域不參與蛋白功能構(gòu)象，因而氨基酸的個別點(diǎn)突變不會對蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響，從而能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。所述的能夠基本保留原蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能是指衍生蛋白質(zhì)具有80％以上的酯酶DMWf18-558的生物學(xué)活性，優(yōu)選具有90％以上的酯酶DMWf18-558的生物學(xué)活性，更優(yōu)選具有95％以上的酯酶DMWf18-558的生物學(xué)活性。

優(yōu)選的酯酶DMWf18-558突變體具有至少與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95％以上的同源性，最優(yōu)選具有至少99％以上的同源性。

同理，本發(fā)明還提供了編碼如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基因序列，其與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致；本發(fā)明還提供對SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除424-438、712-714和802-804位核苷酸外的其他核苷酸進(jìn)行替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶DMWf18-558蛋白生物學(xué)活性的突變體基因。優(yōu)選的酯酶DMWf18-558突變體基因具有至少與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更優(yōu)選具有至少95％以上的同源性，最優(yōu)選具有至少99％以上的同源性。

利用基因克隆技術(shù)，可將克隆到的酯酶DMWf18-558基因連接到合適的載體上，并轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物宿主表達(dá)制備重組酯酶DMWf18-558。合適的原核生物宿主包括各種細(xì)菌如E.coli等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)等，優(yōu)選采用原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli。

合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種可商業(yè)化購買的原核或真核表達(dá)載體，原核表達(dá)載體如pET系列載體，pQE系列載體；酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；動物細(xì)胞表達(dá)載體pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。一個優(yōu)選的例子是將本發(fā)明篩選到羧酸酯酶DMWf18-558的編碼基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a(Novagen)上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出高活性的重組酯酶。

本發(fā)明還提供了羧酸酯酶DMWf18-558或能表達(dá)羧酸酯酶DMWf18-558的宿主菌在工業(yè)上的應(yīng)用，例如可用于催化酯類水解。通過酯酶活力測定表明，羧酸酯酶DMWf18-558或上述能表達(dá)羧酸酯酶DMWf18-558的宿主菌可用于水解短鏈脂肪酸酯，例如C2-C8短碳鏈脂肪酸酯。優(yōu)選的短鏈脂肪酸酯為具有C2-C8短碳鏈的對硝基苯酚酯，例如對硝基苯酚乙酸酯、對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚己酸酯或?qū)ο趸椒有了狨サ?，其中底物為對硝基苯酚己酸?C6)時催化活性最高，酶活達(dá)367U/mg。

羧酸酯酶DMWf18-558催化水解溫度范圍為15～40℃，優(yōu)選為15～35℃；所述水解的pH值為3.0～10.0，優(yōu)選為6.5～9.0。在20℃以下保溫1h，可保持70％以上的殘余酶活；在30℃中保溫1h，可保持50％以上的殘余酶活。本發(fā)明提供的新型羧酸酯酶及其編碼基因在醫(yī)藥制備、食品加工及風(fēng)味改良、廢水處理、洗滌行業(yè)具有重要的應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為純化羧酸酯酶DMWf18-558的聚乙酰胺凝膠電泳分析圖。

圖2為羧酸酯酶DMWf18-558的底物特異性圖。C2：對硝基苯酚乙酸酯；C4：對硝基苯酚丁酸酯、C6：對硝基苯酚己酸酯；C8：對硝基苯酚辛酸酯；C10：對硝基苯酚癸酸酯；C12：對硝基苯酚十二酸酯；C14：對硝基苯酚十四酸酯；C16：對硝基苯酚十六酸酯；定義底物為C6時測定值為100％。

圖3為羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)溫度圖。

圖4為羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)pH圖。

圖5為羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)NaCl濃度圖。

圖6為二價陽離子對羧酸酯酶DMWf18-558活性影響圖。

圖7為有機(jī)溶劑和去垢劑對羧酸酯酶DMWf18-558活性影響圖。

圖8為羧酸酯酶DMWf18-558的溫度穩(wěn)定性圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1羧酸酯酶DMWf18-558編碼基因的獲取

深海沉積物樣品由深?？梢暥喙苋悠鞑杉蕴窖蠛Ｉ竭吘?。宏基因組文庫構(gòu)建采用CopyControl^TM HTP fosmid library production kit(Epicentre Biotechnologies，美國)，宿主菌株為E.coli EPI300(Epicentre Biotechnologies，美國)，載體為pCC2FOS fosmid vector(Epicentre Biotechnologies，美國)。經(jīng)脈沖場電泳檢測，插入片段大小為36～48kb。取10μl文庫菌液稀釋至100μl，涂布于羧酸酯酶篩選平板，30℃培養(yǎng)2天。培養(yǎng)基配方為LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化鈉，pH 7.2)；滅菌后，無菌條件下加入氯霉素，使其終濃度為12.5μg ml^-1。

挑取單克隆并打包，對fosmid打包文庫進(jìn)行測序，拼接后預(yù)測開放閱讀框并注釋基因，從中篩選脂類水解酶相關(guān)基因。通過Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對序列與數(shù)據(jù)庫中已知酯酶基因序列的同源性。經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析獲得DMWf18-558編碼基因，大小為909bp，堿基組成為：141A(15.51％)、146T(16.06％)、331C(36.41％)和291G(32.01％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。編碼蛋白大小為302個氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。將該氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，與之相似性最高的羧酸酯酶也為宏基因組，相似性為82％，其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的注冊號為AFB82690。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，羧酸酯酶DMWf18-558屬于脂類水解酶家族中的第IV家族。根據(jù)氨基酸序列推測，羧酸酯酶DMWf18-558的催化中心由絲氨酸、谷氨酸和組氨酸(氨基酸位置為144、238和268)組成，其中絲氨酸位于甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸(氨基酸位置為142至146)組成的保守區(qū)域中，因此羧酸酯酶DMWf18-558屬于第IV家族GDSAG亞家族。而氧離子洞位于75和76位兩個甘氨酸。

綜上所述，DMWf18-558應(yīng)為脂類水解酶第IV家族中的一名新成員。

實(shí)施例2羧酸酯酶DMWf18-558的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建

將本發(fā)明獲得的羧酸酯酶DMWf18-558編碼基因克隆到表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)菌株。基于NCBIORF Finder的ORF分析獲得的酯酶基因的開放閱讀框序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增酯酶全基因的上游引物558F(5’-TCGCGGATCCATGGCGAGTCCACAGCTCC-3’，BamHI)和下游引物558R(5’-ATTTGCGGCCGCCTAGCGTGCGGCGGC-3’，XhoI)，針對打包fosmid文庫PCR擴(kuò)增確認(rèn)基因全長序列。采用酶切克隆的方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，即用BamHI和XhoI雙酶切PCR產(chǎn)物，純化后的片段與經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒pET28a連接，采用CaCl₂轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，卡那霉素抗性篩選陽性克隆。采用質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen，美國)提取陽性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切鑒定，獲得1000bp左右的DNA片段，經(jīng)測序鑒定為羧酸酯酶DMWf18-558編碼基因。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta(DE3)表達(dá)菌株中，構(gòu)建表達(dá)重組菌株。

實(shí)施例3利用重組表達(dá)菌株表達(dá)重組羧酸酯酶DMWf18-558

將構(gòu)建好的3ml重組表達(dá)菌株轉(zhuǎn)接到100ml含有20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6，加入終濃度為0.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)入20℃以150r/min振蕩培養(yǎng)8h。低溫離心收集菌體，重懸于NTA-10溶液(500mM氯化鈉，10mM咪唑，20mM Tris鹽酸，pH 8.0)中，在冰上進(jìn)行超聲波破碎處理。低溫離心收集上清，采用NTA-Ni²⁺親和柱層析純化表達(dá)蛋白。所表達(dá)的重組蛋白含有N端的6×His tag，可親和吸附到層吸柱上，經(jīng)過不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫，收集洗脫液。經(jīng)SDS-PAGE檢測，得到電泳純的重組羧酸酯酶DMWf18-558，分子量36kDa左右(圖1)。用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度，得到約28.9mg/100ml發(fā)酵液的表達(dá)量。

實(shí)施例4重組羧酸酯酶DMWf18-558的活性檢測

利用對硝基苯酚己酸酯法測定純化的羧酸酯酶DMWf18-558活性。具體操作：1ml反應(yīng)體系中包括1mM對硝基苯己酚酸酯，100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)和48ng純酶蛋白(為10μl經(jīng)稀釋的純化酶液)，采用紫外可見光分光光度計(jì)(Beckman DU800型，美國)于25℃條件下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min，使用失活的酶液作為對照用于調(diào)零。一個酶活力單位定義為每分鐘從對硝基苯酚酯催化產(chǎn)生lμmol對硝基苯酚的所需要的酶量。測得的酯酶活性為367U/mg。

實(shí)施例5重組羧酸酯酶DMWf18-558底物特異性分析

羧酸酯酶DMWf18-558的底物特異性分析采用體系：100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)，1mM底物，加入48ng純酶蛋白，在25℃下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min。測定采用的底物為：對硝基苯酚乙酸酯(C2)，對硝基苯酚丁酸酯(C4)，對硝基苯酚己酸酯(C6)，對硝基苯酚辛酸酯(C8)，對硝基苯酚癸酸酯(C10)，對硝基苯酚十二酸酯(C12)，對硝基苯酚十四酸酯(C14)和對硝基苯酚十六酸酯(C16)。經(jīng)測定表明，羧酸酯酶DMWf18-558對?；兼溳^短或較長的對硝基苯酚酯(C2、C4、C6、C8、C10、C12和C14)具有催化活性，其中底物為對硝基苯酚已酸酯(C6)時催化活性最高，較難水解對硝基苯酚十六酸酯(C16)(圖2)。結(jié)果表明，羧酸酯酶DMWf18-558對?；兼溳^短脂類物質(zhì)具有較高的催化活性，并且對于短鏈脂類的水解活力優(yōu)于長鏈脂類。

實(shí)施例6重組羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)條件分析

羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)溫度在15～60℃范圍內(nèi)測定。具體操作為：100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)，1mM對硝基苯酚己酸酯，加入48ng純酶蛋白，分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃條件下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min。測定結(jié)果表明羧酸酯酶DMWf18-558的反應(yīng)溫度范圍為15～40℃，最適反應(yīng)溫度25℃(圖3)。

羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)pH在3.0～10.0范圍內(nèi)測定。具體操作為：在不同pH緩沖液中加入1mM對硝基苯酚己酸酯和48ng純酶蛋白，在25℃下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₃₄₈2min。測定使用的緩沖液為：100mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.0～6.0)，100mM磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)，100mM Tricine緩沖液(pH 7.5～9.0)和100mM 2-環(huán)己胺基乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0～10.0)。測定結(jié)果表明，羧酸酯酶DMWf18-558在pH 3.0～10.0范圍內(nèi)具有活性，最適反應(yīng)pH為9.0(圖4)。

羧酸酯酶DMWf18-558最適反應(yīng)的NaCl濃度在0.5～5M范圍內(nèi)測定。具體操作為：100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)，1mM對硝基苯酚己酸酯，加入48ng純酶蛋白，分別在0.5、1、2、3、4和5M NaCl條件下，在25℃下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min。測定結(jié)果表明羧酸酯酶DMWf18-558的NaCl反應(yīng)濃度范圍為0.5～3M，最適反應(yīng)濃度為0.5M(圖5)。

實(shí)施例7重組羧酸酯酶DMWf18-558酶學(xué)穩(wěn)定性分析

二價陽離子對羧酸酯酶DMWf18-558活性影響的測定具體操作為：在反應(yīng)體系中分別加入10mM Co²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Ba²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，測定酶活性。測酶活體系為：100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)，1mM對硝基苯酚己酸酯，48ng純酶蛋白，于25℃下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min。測定結(jié)果表明，所添加的金屬離子可抑制羧酸酯酶DMWf18-558的活性,但其活性仍保持在40％以上，在Mg²⁺存在下相對活性保持80％以上(圖6)。

有機(jī)溶劑和去垢劑對羧酸酯酶DMWf18-558活性影響的測定具體操作為：在反應(yīng)體系中分別加入15％(v/v)有機(jī)溶劑(異丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺)和1％去垢劑(w/v或v/v)(SDS、吐溫20、吐溫80和Triton X-100)，測定酶的活性。測活體系為：100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)，1mM對硝基苯酚己酸酯，48ng純酶蛋白，于25℃下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min。測定結(jié)果表明，SDS和Tween 80可抑制羧酸酯酶DMWf18-558的活性(相對活性<10％)，而在乙腈二甲基亞砜和Tween 20存在條件下，DMWf18-558仍能保持較強(qiáng)活性(>50％；圖7)。

羧酸酯酶DMWf18-558活性的熱穩(wěn)定性測定具體操作為：將酶置于10、20、30、40、50和60℃下保溫1h，測定酶的活性。測活體系為：100mM Tricine緩沖液(pH 9.0)，1mM對硝基苯酚己酸酯，48ng純酶蛋白，于25℃下連續(xù)測定吸光值A(chǔ)₄₀₅2min。測定結(jié)果表明，羧酸酯酶DMWf18-558在20℃以下保溫1h，可保持70％以上的殘余酶活；在30℃中保溫1h，可保持50％以上的殘余酶活(圖8)。