本發(fā)明涉及復(fù)合卡拉膠酶及利用該酶制備硒化卡拉膠寡糖的方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前，對(duì)硒作為生命中必需微量元素的認(rèn)識(shí)正日益加深。硒是人體必需的微量元素，被稱為“抗癌之王”，補(bǔ)硒有助于提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)體質(zhì)的功效。同時(shí)硒又是一個(gè)極毒元素，動(dòng)物對(duì)硒的營(yíng)養(yǎng)需要范圍是0.1～0.3ppm，2～10ppm將引起慢性中毒，而超過(guò)10ppm時(shí)會(huì)引起急性中毒以致突然死亡。當(dāng)今人類社會(huì)食物鏈中硒含量在減少，動(dòng)物和人體缺硒病增加，缺硒趨勢(shì)正在加劇。顯然，尋求低毒而生物利用度好的硒化物對(duì)于進(jìn)一步揭示硒的生理功能及其在人類保健事業(yè)上的應(yīng)用是十分有意義的。

在自然界中的硒可分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒。無(wú)機(jī)硒毒性大，不易吸收，生物利用率低，其應(yīng)用受到限制；相對(duì)而言有機(jī)硒毒性低、副作用小，更易被人體吸收，能夠更好地發(fā)揮硒的生理活性。CN1121414C通過(guò)人工合成的方法使無(wú)機(jī)硒和海洋多糖結(jié)合，將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物，已成功制備出新的硒化多糖化合物。該案提供了海藻硒多糖海洋新藥產(chǎn)品及其制備方法，該新藥對(duì)腎衰、血管病和腫瘤具有顯著療效，是低毒甚至無(wú)毒的藥物。其中具有抗病毒、抗HIV、抗腫瘤和提供機(jī)體免疫等廣泛功能的硒化褐藻多糖，硒化殼聚糖和硒化紅藻多糖，其中硒化紅藻多糖卡拉膠還對(duì)淋巴細(xì)胞的分裂有顯著的促進(jìn)作用，具有抑制痛癢病毒復(fù)制作用。

CN1121414C制備的硒化多糖化合物作為我國(guó)唯一海洋硒營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，現(xiàn)已在食品和保健品領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，主要產(chǎn)品是硒化紅藻多糖，即硒化卡拉膠。雖然硒化卡拉膠具有很好的提高機(jī)體免疫力和抗腫瘤作用，且無(wú)毒副作用，但由于其分子量大，生物利用率相對(duì)較低，限制了硒化卡拉膠的應(yīng)用。卡拉膠是從某些紅藻的細(xì)胞壁中提取到的一種由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖交替連接而成的線性硫酸多糖，而卡拉膠降解形成的寡糖具有多種新型生理活性，如抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等功能。與卡拉膠相比，卡拉膠寡糖的生物利用率更高，且具有更多的生理活性。因此，亟需研發(fā)生物利用率高的硒化卡拉膠寡糖。

目前國(guó)外未見(jiàn)硒化卡拉膠寡糖的報(bào)道，國(guó)內(nèi)有一篇關(guān)于硒化卡拉膠寡糖的研究報(bào)道，2014年第9期《化學(xué)與生物工程》發(fā)表的“硒化卡拉膠寡糖的制備及其抑制血管生成作用研究”，該文章由如下方法制備硒化卡拉膠寡糖：在酸性條件下，將亞硒酸鈉、硫酸與卡拉膠進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液減壓濃縮并通過(guò)截留分子量為500的透析袋透析48h，再經(jīng)乙醇沉淀、冷凍干燥，得到硒化卡拉膠寡糖。該化學(xué)方法制備硒化卡拉膠寡糖的反應(yīng)條件不易控制，污染環(huán)境，利用透析袋截留得率低，制備的硒化卡拉膠寡糖硒含量低，在工業(yè)化生產(chǎn)中的難以應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待尋找新的制備硒化卡拉膠寡糖的方式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種復(fù)合卡拉膠酶，該復(fù)合卡拉膠酶可有效的水解硒化卡拉膠，為硒化卡拉膠寡糖的制備提供了一種新的方式。

本發(fā)明的另一目的在于提供應(yīng)用該復(fù)合卡拉膠酶制備硒化卡拉膠寡糖的方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供由所述方法制備得到的硒化卡拉膠寡糖及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種復(fù)合卡拉膠酶，其中，每克所述復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為2.1×10⁵～1.7×10⁶U的κ(Kappa)型卡拉膠酶、酶活力為6.0×10⁴～4.8×10⁵U的ι(Iota)型卡拉膠酶及酶活力為3.0×10⁴～2.4×10⁵U的λ(Lambda)型卡拉膠酶。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究表明復(fù)合卡拉膠酶具有協(xié)同降解硒化卡拉膠的作用，使得降解更加充分均勻，具有反應(yīng)條件溫和、易于控制、綠色環(huán)保和專一高效等優(yōu)點(diǎn)，所制備的寡糖分子量更加均勻，且其收率遠(yuǎn)高于化學(xué)法和單一酶法制備的硒化卡拉膠寡糖。

優(yōu)選地，根據(jù)不同類型卡拉膠酶的優(yōu)化比例及其成本，本發(fā)明每克復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為2.1×10⁵～8.5×10⁵U的κ型卡拉膠酶、酶活力為6.0×10⁴～2.4×10⁵U的ι型卡拉膠酶及酶活力為3.0×10⁴～1.2×10⁵U的λ型卡拉膠酶。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明所述復(fù)合卡拉膠酶由酶活力為2.7×10⁵～2.7×10⁶U/g的κ型卡拉膠酶原料、酶活力為2.3×10⁵～2.3×10⁶U/g的ι型卡拉膠酶原料及酶活力為2.0×10⁵～2.0×10⁶U/g的λ型卡拉膠酶原料復(fù)配得到；

優(yōu)選地，所述κ型卡拉膠酶原料在20℃～45℃、pH6.0～9.0時(shí)的活性最高；

優(yōu)選地，所述ι型卡拉膠酶原料在15℃～40℃、pH6.0～9.0時(shí)的活性最高；

優(yōu)選地，所述λ型卡拉膠酶原料在25℃～45℃、pH6.0～10.0時(shí)的活性最高。

本發(fā)明所述κ型卡拉膠酶原料、ι型卡拉膠酶原料及λ型卡拉膠酶原料可商購(gòu)或采用現(xiàn)有菌株按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段獲得。將上述量的各類酶在無(wú)菌環(huán)境下按一定的比例使用機(jī)械混配機(jī)混勻即可得到本發(fā)明所述復(fù)合卡拉膠酶。本發(fā)明的復(fù)合卡拉膠酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 25594-2010對(duì)食品工業(yè)用酶制劑的衛(wèi)生要求。其理化性質(zhì)外觀：白色粉末；細(xì)菌總數(shù)<50000個(gè)/g；大腸桿菌<30CFU/g；致病大腸桿菌未檢出；沙門氏菌未檢出。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明所述κ型卡拉膠酶原料、所述ι型卡拉膠酶原料、所述λ型卡拉膠酶原料分別是由產(chǎn)κ型卡拉膠酶菌株、產(chǎn)ι型卡拉膠酶菌株或產(chǎn)λ型卡拉膠酶菌株產(chǎn)生并經(jīng)純化、干燥獲得的。

本發(fā)明所述產(chǎn)κ型卡拉膠酶菌株、產(chǎn)ι型卡拉膠酶菌株及產(chǎn)λ型卡拉膠酶菌株為現(xiàn)有菌株，產(chǎn)生酶的條件，純化以及干燥過(guò)程均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，在此不另行贅述。

優(yōu)選地，產(chǎn)所述κ型卡拉膠酶菌株為Pseudoalteromonas sp NJ62。

優(yōu)選地，產(chǎn)所述ι型卡拉膠酶菌株為Pseudoalteromonas sp NJ64。

優(yōu)選地，產(chǎn)所述λ型卡拉膠酶菌株為Pseudoalteromonas sp NJ276。

本發(fā)明所述菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ62、菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ64和菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ276屬于交替單胞菌目(Alteromonadales)，交替單胞菌科(Alteromonadaceae)，假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.)。這些菌株均為現(xiàn)有菌株，菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ62、Pseudoalteromonas sp NJ64及Pseudoalteromonas sp NJ276可獲自生物活性物質(zhì)國(guó)家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，這些菌株的現(xiàn)有技術(shù)包括鄭洲，繆錦來(lái)等，汞對(duì)南極細(xì)菌Pseudoalteromonas sp NJ62抗氧化酶活性的影響，海洋科學(xué)進(jìn)展，第23卷增刊，2005年12月；高叢，繆錦來(lái)等，一株高產(chǎn)低溫纖維素酶南極細(xì)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究，化學(xué)與生物工程，第29卷第2期，2012年2月；鄭洲，劉芳明等，南極石油烴降解嗜冷菌的篩選及其降解特性的研究，海洋科學(xué)進(jìn)展，第25卷第3期，2007年7月。如前所述的在20℃～45℃、pH6.0～9.0時(shí)的活性最高可由Pseudoalteromonas sp NJ62菌株產(chǎn)生；在15℃～40℃、pH6.0～9.0時(shí)的活性最高的ι型卡拉膠酶原料可由Pseudoalteromonas sp NJ64產(chǎn)生；在25℃～45℃、pH6.0～10.0時(shí)的活性最高的λ型卡拉膠酶原料可由Pseudoalteromonas sp NJ276產(chǎn)生。采用優(yōu)選菌株可使酶解反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行。

另一方面，本發(fā)明提供一種硒化卡拉膠寡糖的制備方法，其中，所述方法包括使用有效催化量的本發(fā)明所述的復(fù)合卡拉膠酶來(lái)水解硒化卡拉膠。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，本發(fā)明所述方法包括將所述復(fù)合卡拉膠酶按照80～800U/ml的加入量加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～20％的硒化卡拉膠水溶液中，于25～45℃反應(yīng)6h～12h水解硒化卡拉膠，后處理得到所述硒化卡拉膠寡糖。優(yōu)選地，所述后處理包括將水解后的反應(yīng)液加熱煮沸、冷卻、蒸發(fā)得到硒化卡拉膠寡糖濃縮液，然后將該濃縮液通過(guò)3～9重量倍的乙醇沉淀、離心收集沉淀物，干燥得所述硒化卡拉膠寡糖。

具體地，例如用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～20％的硒化卡拉膠溶液，然后按照80～800U/ml的加入量，加入復(fù)合卡拉膠酶溶液，于25～45℃反應(yīng)6h～12h水解硒化卡拉膠，然后加熱煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，置于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，獲得硒化卡拉膠寡糖濃縮液，將獲得的硒化卡拉膠寡糖濃縮液通3～9倍的乙醇沉淀，離心收集沉淀物，然后經(jīng)60℃烘干后得到硒化卡拉膠寡糖。

本發(fā)明制備硒化卡拉膠寡糖的方法為的酶法，與現(xiàn)有技術(shù)化學(xué)制備方法有本質(zhì)的不同。應(yīng)用本發(fā)明所述復(fù)合卡拉膠酶水解硒化卡拉膠使得降解更加充分均勻，具有反應(yīng)條件溫和、易于控制、綠色環(huán)保和專一高效等優(yōu)點(diǎn)，所制備的寡糖分子量更加均勻，且其收率遠(yuǎn)高于化學(xué)法和單一酶法制備的硒化卡拉膠寡糖。

再一方面，本發(fā)明提供一種硒化卡拉膠寡糖，其是由本發(fā)明所述方法制備得到的。優(yōu)選地，所述硒化卡拉膠寡糖的分子量為900～2700Da，優(yōu)選900～1500Da。

再一方面，本發(fā)明提供所述的硒化卡拉膠寡糖作為補(bǔ)硒劑在生產(chǎn)含硒水稻、茶葉或雞蛋中的應(yīng)用。

綜上可知，本發(fā)明對(duì)3種不同類型的卡拉膠酶進(jìn)行復(fù)配，并利用復(fù)配的卡拉膠酶復(fù)合酶降解制備硒化卡拉膠寡糖，不僅具有反應(yīng)條件溫和、易于控制、綠色環(huán)保和專一高效等優(yōu)點(diǎn)，而且其收率遠(yuǎn)高于化學(xué)法和單一酶法制備的硒化卡拉膠寡糖。本發(fā)明制備的硒化卡拉膠寡糖不僅具有硒化卡拉膠多糖的全部生理活性，而且其生物利用率遠(yuǎn)高于硒化卡拉膠多糖，可作為新型的安全高效補(bǔ)硒劑應(yīng)用于富硒雞蛋、茶葉和大米等產(chǎn)業(yè)，開(kāi)拓了海藻硒寡糖應(yīng)用的新領(lǐng)域。

具體實(shí)施方式

為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中，各原始試劑材料均可商購(gòu)獲得，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照儀器制造商所建議的條件。

以下實(shí)施例或?qū)Ρ壤械摩?卡拉膠酶原料、ι-卡拉膠酶原料、λ-卡拉膠酶原料分別由菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ62、菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ64和菌株P(guān)seudoalteromonas sp NJ276(Pseudoalteromonas sp NJ62菌株、Pseudoalteromonas sp NJ64及Pseudoalteromonas sp NJ276菌株均獲自生物活性物質(zhì)國(guó)家海洋局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)培養(yǎng)得到的三種卡拉膠酶，經(jīng)硫酸銨沉淀、脫鹽、離子交換層析等步驟純化，具體步驟為：

分別將產(chǎn)κ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶和λ-卡拉膠酶的Pseudoalteromonas sp NJ62菌株、Pseudoalteromonas sp NJ64及Pseudoalteromonas sp NJ276菌株南極低溫菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基為2216E液體培養(yǎng)基，15℃震蕩培養(yǎng)60h。發(fā)酵液9800×g離心10min，上清液為卡拉膠酶粗酶液；2216E液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，陳海水配制；固體培養(yǎng)基是在富集培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂粉。

卡拉膠酶的分離純化：分別將獲得的含有κ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶和λ-卡拉膠酶的上清液，在冰浴中緩慢逐步加入硫酸銨至30％飽和度，邊加邊攪拌，加完后再繼續(xù)攪拌1h，4℃靜置5h；然后，4℃下12000×g離心20min，取上清液，繼續(xù)加入硫酸銨至90％飽和度，邊加邊攪拌1h，置于4℃冰箱中靜置過(guò)夜；4℃下12000×g離心20min，取沉淀，用pH8.0的Tris-HCl(0.05mol/L)-緩沖液溶解，透析。透析后的溶液上樣于DEAE Sepharose Fast Flow進(jìn)行離子交換層析，層析用的緩沖液體系A(chǔ)液為0.05mol/L pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉(PBS)緩沖液，B液為含有117g/L NaCl的0.05mol/L pH7.0的PBS，進(jìn)行梯度洗脫，流速為進(jìn)行梯度洗脫，分部收集洗脫液，測(cè)定個(gè)組分酶活力。將得到的活性組分超濾濃縮后進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，填料為Superdex G75，用含有0.15mol/L NaCl的pH7.0的PBS(0.05mol/L)緩沖液平衡，以平衡液洗脫，以上操作均在4℃進(jìn)行，將收集的活性部分真空冷凍干燥，獲得κ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶和λ-卡拉膠酶。用DNS法測(cè)定卡拉膠酶活力，其純酶比活力分別為2742、2336及2075U/mg。酶活力定義為：每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

實(shí)施例1

硒化卡拉膠寡糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)復(fù)合卡拉膠酶的組成：κ-卡拉膠酶原料7重量份、ι-卡拉膠酶原料2重量份、λ-卡拉膠酶原料1重量份。在無(wú)菌環(huán)境下按一定的比例混勻。外觀為白色粉末；細(xì)菌總數(shù)<50000個(gè)/g；大腸桿菌<30CFU/g；致病大腸桿菌未檢出；沙門氏菌未檢出。經(jīng)DNS(二硝基水楊酸)法測(cè)試，每克所述復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為5.7×10⁵U的κ型卡拉膠酶、酶活力為1.4×10⁵U的ι型卡拉膠酶及酶活力為6.0×10⁴U的λ型卡拉膠酶。

(2)利用復(fù)合卡拉膠酶水解硒化卡拉膠：用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的硒化卡拉膠溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入復(fù)合卡拉膠酶溶液，于35℃反應(yīng)9h水解硒化卡拉膠，然后加熱煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，置于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，獲得硒化卡拉膠寡糖濃縮液。

(3)利用乙醇分級(jí)沉淀制備不同分子量的硒化卡拉膠寡糖：將獲得的硒化卡拉膠寡糖濃縮液通過(guò)5重量倍的乙醇沉淀，離心收集沉淀物，然后經(jīng)60℃烘干后得到硒化卡拉膠寡糖；制備的硒化卡拉膠寡糖收率為81％，分子量為900～1500Da。

實(shí)施例2

硒化卡拉膠寡糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)復(fù)合卡拉膠酶的組成：κ-卡拉膠酶原料8重量份、ι-卡拉膠酶原料1重量份、λ-卡拉膠酶原料1重量份。在無(wú)菌環(huán)境下按一定的比例混勻。外觀為白色粉末；細(xì)菌總數(shù)<50000個(gè)/g；大腸桿菌<30CFU/g；致病大腸桿菌未檢出；沙門氏菌未檢出。經(jīng)DNS法測(cè)試，每克所述復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為6.5×10⁵U的κ型卡拉膠酶、酶活力為6.9×10⁴U的ι型卡拉膠酶及酶活力為6.0×10⁴U的λ型卡拉膠酶。

(2)利用復(fù)合卡拉膠酶水解硒化卡拉膠：用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的硒化卡拉膠溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入適量的復(fù)合卡拉膠酶溶液，于30℃反應(yīng)9h水解硒化卡拉膠，然后加熱煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，置于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，獲得硒化卡拉膠寡糖濃縮液。

(3)利用乙醇分級(jí)沉淀制備不同分子量的硒化卡拉膠寡糖：將獲得的硒化卡拉膠寡糖濃縮液通過(guò)5重量倍的乙醇沉淀，離心收集沉淀物，然后經(jīng)60℃烘干后得到硒化卡拉膠寡糖；制備的硒化卡拉膠寡糖收率為76％，分子量為900～1800Da。

實(shí)施例3

硒化卡拉膠寡糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)復(fù)合卡拉膠酶的組成：κ-卡拉膠酶原料6重量份、ι-卡拉膠酶原料2重量份、λ-卡拉膠酶原料2重量份。在無(wú)菌環(huán)境下按一定的比例混勻。外觀為白色粉末；細(xì)菌總數(shù)<50000個(gè)/g；大腸桿菌<30CFU/g；致病大腸桿菌未檢出；沙門氏菌未檢出。經(jīng)DNS法測(cè)試，每克所述復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為4.9×10⁵U的κ型卡拉膠酶、酶活力為1.4×10⁵U的ι型卡拉膠酶及酶活力為1.2×10⁵U的λ型卡拉膠酶。

(2)利用復(fù)合卡拉膠酶水解硒化卡拉膠：用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的硒化卡拉膠溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入適量的復(fù)合卡拉膠酶溶液，于30℃反應(yīng)9h水解硒化卡拉膠，然后加熱煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，置于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，獲得硒化卡拉膠寡糖濃縮液。

(3)利用乙醇分級(jí)沉淀制備不同分子量的硒化卡拉膠寡糖：將獲得的硒化卡拉膠寡糖濃縮液通過(guò)5重量倍的乙醇沉淀，離心收集沉淀物，然后經(jīng)60℃烘干后得到硒化卡拉膠寡糖；制備的硒化卡拉膠寡糖收率為73％，分子量為900～2100Da。

實(shí)施例4

硒化卡拉膠寡糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)復(fù)合卡拉膠酶的組成：κ型卡拉膠酶原料3重量份、ι型卡拉膠酶原料4重量份、λ型卡拉膠酶原料3重量份。在無(wú)菌環(huán)境下按一定的比例混勻。外觀為白色粉末；細(xì)菌總數(shù)<50000個(gè)/g；大腸桿菌<30CFU/g；致病大腸桿菌未檢出；沙門氏菌未檢出。經(jīng)DNS法測(cè)試，每克所述復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為2.4×10⁵U的κ型卡拉膠酶、酶活力為2.8×10⁵U的ι型卡拉膠酶及酶活力為1.8×10⁵U的λ型卡拉膠酶。

(2)利用復(fù)合卡拉膠酶水解硒化卡拉膠：用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的硒化卡拉膠溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入適量的復(fù)合卡拉膠酶溶液，于35℃反應(yīng)9h水解硒化卡拉膠，然后加熱煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，置于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，獲得硒化卡拉膠寡糖濃縮液。

(3)利用乙醇分級(jí)沉淀制備不同分子量的硒化卡拉膠寡糖：將獲得的硒化卡拉膠寡糖濃縮液通過(guò)5重量倍的乙醇沉淀，離心收集沉淀物，然后經(jīng)60℃烘干后得到硒化卡拉膠寡糖；制備的硒化卡拉膠寡糖收率為71％，分子量為900～2700Da。

對(duì)比例1

本對(duì)比例以本發(fā)明的復(fù)合卡拉膠酶以及單一卡拉膠酶對(duì)比研究其效果，具體地：

本對(duì)比例采用復(fù)合卡拉膠酶制備硒化卡拉膠寡糖的方法包括以下步驟：

(1)復(fù)合卡拉膠酶的組成：κ-卡拉膠酶原料7重量份、ι-卡拉膠酶原料2重量份、λ-卡拉膠酶原料1重量份。在無(wú)菌環(huán)境下按一定的比例混勻。外觀為白色粉末；細(xì)菌總數(shù)<50000個(gè)/g；大腸桿菌<30CFU/g；致病大腸桿菌未檢出；沙門氏菌未檢出。經(jīng)DNS法測(cè)試，每克所述復(fù)合卡拉膠酶含有酶活力為5.7×10⁵U的κ型卡拉膠酶、酶活力為1.4×10⁵U的ι型卡拉膠酶及酶活力為6.0×10⁴U的λ型卡拉膠酶。

(2)利用復(fù)合卡拉膠酶水解硒化卡拉膠：用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的硒化卡拉膠溶液，然后按照300U/ml的加入量，加入適量的復(fù)合卡拉膠酶溶液，于35℃反應(yīng)9h水解硒化卡拉膠，然后加熱煮沸10min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，置于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，獲得硒化卡拉膠寡糖濃縮液。

(3)利用乙醇分級(jí)沉淀制備不同分子量的硒化卡拉膠寡糖：將獲得的硒化卡拉膠寡糖濃縮液通過(guò)5重量倍的乙醇沉淀，離心收集沉淀物，然后經(jīng)60℃烘干后得到硒化卡拉膠寡糖；制備的硒化卡拉膠寡糖收率為81％，分子量為900～1500Da。

本對(duì)比例分別采用單一卡拉膠酶的制備硒化卡拉膠寡糖的方法與前述采用復(fù)合卡拉膠酶制備硒化卡拉膠寡糖的方法相同，唯一不同之處在于分別以κ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶及λ-卡拉膠酶替代復(fù)合卡拉膠酶，酶添加量也相同；反應(yīng)條件及結(jié)果如下表1所示：

表1

實(shí)施例5

硒化卡拉膠寡糖的應(yīng)用，包括以下內(nèi)容：

(1)制備富硒大米，將制備的硒化卡拉膠寡糖作為一種安全高效補(bǔ)硒劑添加到水稻中，生產(chǎn)富硒大米。將制備的硒化卡拉膠寡糖配成0.5％的水溶液，葉面噴施在水稻，從而生產(chǎn)出富硒大米；或?qū)⑽ɡz寡糖作為肥料施于稻田中，生產(chǎn)出富硒大米。

(2)制備富硒茶葉，將制備的硒化卡拉膠寡糖作為一種安全高效補(bǔ)硒劑添加到茶樹(shù)中，生產(chǎn)富硒茶葉。將制備的硒化卡拉膠寡糖配成0.1％的水溶液，葉面噴施在茶樹(shù)上，從而生產(chǎn)出富硒茶葉；或?qū)⑽ɡz寡糖作為肥料施于茶園中，生產(chǎn)出富硒茶葉。

(3)制備富硒雞蛋，將制備的硒化卡拉膠寡糖作為一種安全高效補(bǔ)硒劑添加到蛋雞飼料中，生產(chǎn)富硒雞蛋。將制備的硒化卡拉膠寡糖按照0.5wt％添加到蛋雞飼料中，從而使蛋雞生產(chǎn)出富硒雞蛋。

最后說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。