本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用，屬于細(xì)胞固定化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)是指果糖基經(jīng)β-2,1糖苷鍵連接而成的聚合度為2～9的功能性低聚糖，屬于食品配料。按結(jié)構(gòu)，低聚果糖可分為蔗-果型和果-果型兩種。工業(yè)上生產(chǎn)低聚果糖主要有兩種方法：以菊粉為原料的酶水解法和以蔗糖為原料的酶轉(zhuǎn)化法。前者所得低聚果糖聚合度范圍較大(DP2-DP9)，屬果-果型；后者所得低聚果糖聚合度范圍較小(DP3-DP6)，屬蔗-果型。研究顯示，動(dòng)物或人體攝食低聚果糖，可改善腸道菌群、減輕便秘癥狀、改善脂質(zhì)代謝、抑制腸道腐敗、促進(jìn)鈣鎂等礦質(zhì)元素的吸收、增強(qiáng)免疫力等。低聚果糖良好的理化特性和生理功效，使其在食品、保健品、飼料等行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。
工業(yè)上以蔗糖為原料生產(chǎn)低聚果糖的方法有微生物液體深層發(fā)酵法、游離酶法和固定化酶法。微生物液體深層發(fā)酵法是一種傳統(tǒng)的方法，其生產(chǎn)工藝成熟，是早期低聚果糖生產(chǎn)上通用的方法，該法設(shè)備投入較大，且微生物菌體只能利用一次；游離酶法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，但酶只能利用一次且酶制劑成本較高；固定化酶法可實(shí)現(xiàn)酶的多次利用，但酶的固定化過(guò)程技術(shù)要求較高，酶經(jīng)固定化后轉(zhuǎn)化蔗糖所得低聚果糖的含量往往低于游離酶。
除上述生產(chǎn)方法外，尚有固定化細(xì)胞法，該法的優(yōu)點(diǎn)是可實(shí)現(xiàn)微生物菌體的重復(fù)利用。相比于固定化酶法，該法省去了酶的提取純化等繁雜的過(guò)程，固定化成本較低。固定化細(xì)胞法生產(chǎn)低聚果糖，國(guó)外有成功的案例，國(guó)內(nèi)鮮有成功應(yīng)用的報(bào)道。
中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104450665A(申請(qǐng)?zhí)?01410720356.2)公布了一種固定紅發(fā)夫酵母及制備新科斯糖(低聚果糖的一種)的方法及應(yīng)用。用海藻酸鈣凝膠包埋紅發(fā)夫酵母，所得固定化顆粒經(jīng)洗滌后，轉(zhuǎn)到殼聚糖溶液中覆膜，所得固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性等得以提高。但是酵母經(jīng)海藻酸鈣包埋后再覆以殼聚糖凝膠，其傳質(zhì)效率降低。
中國(guó)專利文獻(xiàn)CN105112473A(申請(qǐng)?zhí)?01510649367.0)公開了一種低聚果糖——新科斯糖的生產(chǎn)工藝，該法是利用固定化法夫酵母轉(zhuǎn)化蔗糖來(lái)制備新科斯糖。
中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101974508A(申請(qǐng)?zhí)?01010297075.2)公開了一種固定化環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶及其制備方法和應(yīng)用，首先在酶液中加入分子篩，其次加入戊二醛使混合液交聯(lián)，然后經(jīng)海藻酸鈉和氯化鈣的包埋，得到固定化的環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明所制得的固定化環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶具有較高熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性，同時(shí)可采用粗酶液進(jìn)行固定化，大大降低了固定化的成本，所述固定化酶可用于2-O-葡萄糖基抗壞血酸的生產(chǎn)，轉(zhuǎn)化率高達(dá)0.22g·L-1·h-1，轉(zhuǎn)化結(jié)束后產(chǎn)物易于提取，固定化酶也便于回收，還可重復(fù)利用。但由于該專利固定化的目標(biāo)為酶，該酶經(jīng)分子篩吸附與戊二醛交聯(lián)后，再經(jīng)海藻酸鈣凝膠包埋，傳質(zhì)效率降低；且在應(yīng)用過(guò)程中，凝膠顆粒隨著使用次數(shù)的增加會(huì)逐漸變得松軟，給工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)不便。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案如下：
一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
(1)向低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，制得戊二醛質(zhì)量濃度為5～15g/L的混合液，在10～15℃、30～60rpm條件下反應(yīng)6～10h，經(jīng)洗滌，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為300～500g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比0.8～1.2:1混合，將混合后的料液按1:2～5的質(zhì)量比加入到質(zhì)量百分比濃度為2～5％的氯化鈣溶液中，10～15℃硬化10～15h，固液分離，制得固定化細(xì)胞；
所述固定液中含有質(zhì)量百分比濃度為0.5～1.5％的PEG600和質(zhì)量百分比濃度為3～5％的海藻酸鈉。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的低聚果糖產(chǎn)生菌選自黑曲霉或米曲霉。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為5～15g/L。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液，按如下方法制備：
I、將菌株接種于活化培養(yǎng)基中，在溫度28～32℃的條件下活化培養(yǎng)66～78h，制得活化菌株；
所述活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，組分如下：
馬鈴薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、瓊脂15～20g、水1000mL，pH自然；
馬鈴薯去皮后切成塊，煮沸30min，紗布過(guò)濾后加入糖及瓊脂，溶化后補(bǔ)水至1000mL，121℃滅菌30min。見沈萍等主編《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第三版(高等教育出版社)215頁(yè)中的配制方法。
II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速40～90rpm、通氣量0.5～2vvm的條件下培養(yǎng)18～24h，制得液體種子；
所述種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4～7％、酵母膏3～5％、玉米粉1～3％，余量水，pH自然；
III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比8～12％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速40～90rpm、通氣量0.5～2vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24～36h，固液分離，制得菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖7～10％、酵母膏2～4％、玉米粉0.5～1％，余量水，pH自然；
IV、將步驟III制得的菌體與工業(yè)用無(wú)鹽水混合，配制成菌體濃度為5～15g/L的低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的洗滌方法為：菌懸液過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩，反復(fù)3～4次。
上述制備方法制得的生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞。
上述生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞在制備低聚果糖中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用，包括如下步驟：
(a)將生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞填料至高徑比為3～6的反應(yīng)柱中，向反應(yīng)柱中泵入質(zhì)量百分比濃度為45～55％的蔗糖溶液進(jìn)行柱式循環(huán)反應(yīng)，控制流量為4～6BV/h、溫度45～55℃、pH 5.0～6.5，制得低聚果糖粗液；
經(jīng)檢測(cè)，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質(zhì)量百分比的56％以上；
(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質(zhì)量濃度為30～35％，經(jīng)離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(a)中，還包括每反應(yīng)3～5天后向蔗糖溶液中補(bǔ)加氯化鈣至質(zhì)量百分比濃度為0.3～0.5％，進(jìn)行再硬化10～30h。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理
發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)菌種包埋前，通過(guò)特定濃度的戊二醛溶液在一定條件下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，可以增強(qiáng)胞內(nèi)果糖基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性；同時(shí)，在固定化細(xì)胞制備過(guò)程中，通過(guò)添加聚乙二醇進(jìn)行造孔，提高了固定化顆粒的傳質(zhì)效率；此外，在固定化細(xì)胞使用過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加氯化鈣，可以保持固定化細(xì)胞顆粒的機(jī)械強(qiáng)度，減少由于固定化顆粒松軟而造成的菌體損失，從而制得固定化細(xì)胞酶活穩(wěn)定性好、傳質(zhì)效率高，連續(xù)使用3個(gè)月，酶活仍在70％以上的固定化細(xì)胞顆粒。
有益效果
1、本發(fā)明首次先采用戊二醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，然后用PEG600造孔和海藻酸鈣凝膠包埋，并在糖化過(guò)程中補(bǔ)充氯化鈣，最后獲得了酶活穩(wěn)定性好、傳質(zhì)效率高、連續(xù)使用3個(gè)月酶活仍高于70％的固定化細(xì)胞；
2、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)酶菌體的重復(fù)利用，減少了菌種培養(yǎng)的次數(shù)，降低了菌種培養(yǎng)過(guò)程中的能耗和原料消耗，從而降低生產(chǎn)成本；
3、本發(fā)明在利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的過(guò)程中，適時(shí)補(bǔ)加鈣離子，可保持固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，防止固定化顆粒變松軟；
4、本發(fā)明制得的低聚果糖液精制工藝簡(jiǎn)單，無(wú)需脫色，只需離交濃縮即可得終產(chǎn)品糖漿，其中低聚果糖的含量(占總固形物)≥56％。
附圖說(shuō)明
圖1是實(shí)施例5(糖化過(guò)程中補(bǔ)充氯化鈣)和對(duì)比例2(糖化過(guò)程中不補(bǔ)加氯化鈣)所制得的固定化顆粒糖化15批后浸泡于質(zhì)量濃度為40％的蔗糖溶液中的照片；
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
菌種來(lái)源
實(shí)施例中所述黑曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌BLB-11，保藏號(hào)CGMCC No.2952；米曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌BLB-27，保藏號(hào)CGMCC No.7311。
實(shí)施例1
一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
(1)向黑曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為5g/L，制得戊二醛質(zhì)量濃度為5g/L的混合液，在10～12℃、60rpm條件下反應(yīng)6h，菌懸液過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩，反復(fù)3次，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為300g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比0.8:1混合，將混合后的料液按1:5的質(zhì)量比加入到質(zhì)量百分比濃度為2％的氯化鈣溶液中，13～15℃硬化10h，過(guò)濾，制得固定化細(xì)胞；
所述固定液中含有質(zhì)量百分比濃度為1.5％的PEG600和質(zhì)量百分比濃度為5％的海藻酸鈉。
所述步驟(1)中低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液，按如下方法制備：
I、將菌株接種于活化培養(yǎng)基中，在溫度28℃的條件下活化培養(yǎng)78h，制得活化菌株；
所述活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，組分如下：
馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂15g、水1000mL，pH自然；
II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度30～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速90rpm、通氣量2vvm的條件下培養(yǎng)18h，制得液體種子；
所述種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％、酵母膏5％、玉米粉3％，余量水，pH自然；
III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比8％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速90rpm、通氣量2vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h，固液分離，制得菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖10％、酵母膏3％、玉米粉0.5％，余量水，pH自然；
IV、將步驟III制得的菌體與工業(yè)用無(wú)鹽水混合，配制成菌體濃度為5g/L的低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液。
利用上述制備的固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括如下步驟：
(a)將生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞填料至高徑比為3的反應(yīng)柱中，向反應(yīng)柱中泵入質(zhì)量百分比濃度為55％的蔗糖溶液進(jìn)行柱式循環(huán)反應(yīng)，控制流量為4BV/h、溫度52～55℃、pH 5.0～5.5，糖化組分含量達(dá)標(biāo)后開始下一批糖化；每反應(yīng)3天后補(bǔ)加氯化鈣至質(zhì)量百分比濃度為0.3％，進(jìn)行再硬化，制得低聚果糖粗液；
經(jīng)檢測(cè)，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質(zhì)量百分比的56％以上。
(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質(zhì)量百分比濃度為30～32％，經(jīng)離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。
實(shí)施例2
一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
(1)向米曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為15g/L，制得戊二醛質(zhì)量濃度為15g/L的混合液，在13～15℃、30rpm條件下反應(yīng)10h，菌懸液過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩，反復(fù)4次，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為500g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比1.2:1混合，將混合后的料液按1:2的質(zhì)量比加入到質(zhì)量百分比濃度為5％的氯化鈣溶液中，10～12℃硬化15h，過(guò)濾，制得固定化細(xì)胞；
所述固定液中含有質(zhì)量百分比濃度為0.5％的PEG600和質(zhì)量百分比濃度為3％的海藻酸鈉。
所述步驟(1)中低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液，按如下方法制備：
I、將菌株接種于活化培養(yǎng)基中，在溫度29℃的條件下活化培養(yǎng)75h，制得活化菌株；
所述活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，組分如下：
馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL，pH自然；
II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃、攪拌轉(zhuǎn)速40rpm、通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)24h，制得液體種子；
所述種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖7％、酵母膏3％、玉米粉1％，余量水，pH自然；
III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比12％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃、攪拌轉(zhuǎn)速40rpm、通氣量0.5vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36h，固液分離，制得菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖7％、酵母膏4％、玉米粉1％，余量水，pH自然；
IV、將步驟III制得的菌體與工業(yè)用無(wú)鹽水混合，配制成菌體濃度為15g/L的低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液。
利用上述制備的固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括如下步驟：
(a)將生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞填料至高徑比為4的反應(yīng)柱中，向反應(yīng)柱中泵入質(zhì)量百分比濃度為45％的蔗糖溶液進(jìn)行柱式循環(huán)反應(yīng)，控制流量為5BV/h、溫度45～48℃、pH 6.0～6.5，糖化組分含量達(dá)標(biāo)后開始下一批糖化；每反應(yīng)4天后補(bǔ)加氯化鈣至質(zhì)量百分比濃度為0.4％，進(jìn)行再硬化，制得低聚果糖粗液；
經(jīng)檢測(cè)，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質(zhì)量百分比的56％以上；
(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質(zhì)量濃度為31～33％，經(jīng)離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。
實(shí)施例3
一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
(1)向黑曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為10g/L，制得戊二醛質(zhì)量濃度為10g/L的混合液，在11～13℃、50rpm條件下反應(yīng)9h，菌懸液過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩，反復(fù)3次，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為400g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比1:1混合，將混合后的料液按1:4的質(zhì)量比加入到質(zhì)量百分比濃度為3％的氯化鈣溶液中，11～13℃硬化14h，過(guò)濾，制得固定化細(xì)胞；
所述固定液中含有質(zhì)量百分比濃度為1％的PEG600和質(zhì)量百分比濃度為4％的海藻酸鈉。
所述步驟(1)中低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液，按如下方法制備：
I、將菌株接種于活化培養(yǎng)基中，在溫度30℃的條件下活化培養(yǎng)72h，制得活化菌株；
所述活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，組分如下：
馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂18g、水1000mL，pH自然；
II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度29～31℃、攪拌轉(zhuǎn)速70rpm、通氣量1vvm的條件下培養(yǎng)22h，制得液體種子；
所述種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖5％、酵母膏4％、玉米粉2％，余量水，pH自然；
III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比9％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度29～31℃、攪拌轉(zhuǎn)速70rpm、通氣量1vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)30h，固液分離，制得菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖9％、酵母膏3％、玉米粉0.5％，余量水，pH自然；
IV、將步驟III制得的菌體與工業(yè)用無(wú)鹽水，配制成菌體濃度為10g/L的低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液。
利用上述制備的固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括如下步驟：
(a)將生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞填料至高徑比為5的反應(yīng)柱中，向反應(yīng)柱中泵入質(zhì)量百分比濃度為50％的蔗糖溶液進(jìn)行柱式循環(huán)反應(yīng)，控制流量為6BV/h、溫度49～52℃、pH 5.5～6.0，糖化組分含量達(dá)標(biāo)后開始下一批糖化；每反應(yīng)5天后補(bǔ)加氯化鈣至質(zhì)量百分比濃度為0.5％，進(jìn)行再硬化，制得低聚果糖粗液；
經(jīng)檢測(cè)，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質(zhì)量百分比的56％以上；
(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質(zhì)量濃度為32～34％，經(jīng)離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。
實(shí)施例4
一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
(1)向米曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為7g/L，制得戊二醛質(zhì)量濃度為7g/L的混合液，在12～14℃、40rpm條件下反應(yīng)7h，菌懸液過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩，反復(fù)4次，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為350g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比0.9:1混合，將混合后的料液按1:3的質(zhì)量比加入到質(zhì)量百分比濃度為4％的氯化鈣溶液中，12～14℃硬化13h，過(guò)濾，制得固定化細(xì)胞；
所述固定液中含有質(zhì)量百分比濃度為1.25％的PEG600和質(zhì)量百分比濃度為4.5％的海藻酸鈉。
所述步驟(1)中低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液，按如下方法制備：
I、將菌株接種于活化培養(yǎng)基中，在溫度31℃的條件下活化培養(yǎng)69h，制得活化菌株；
所述活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，組分如下：
馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂17g、水1000mL，pH自然；
II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm、通氣量0.6vvm的條件下培養(yǎng)23h，制得液體種子；
所述種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖6％、酵母膏4％、玉米粉2％，余量水，pH自然；
III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比10％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃、攪拌轉(zhuǎn)速50rpm、通氣量1.5vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)29h，固液分離，制得菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖8％、酵母膏2％、玉米粉0.75％，余量水，pH自然；
IV、將步驟III制得的菌體與工業(yè)用無(wú)鹽水，配制成菌體濃度為7g/L的低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液。
利用上述制備的固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括如下步驟：
(a)將生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞填料至高徑比為6的反應(yīng)柱中，向反應(yīng)柱中泵入質(zhì)量百分比濃度為48％的蔗糖溶液進(jìn)行柱式循環(huán)反應(yīng)，控制流量為5BV/h、溫度46～49℃、pH 5.8～6.3，糖化組分含量達(dá)標(biāo)后開始下一批糖化；每反應(yīng)4天后補(bǔ)加氯化鈣至質(zhì)量百分比濃度為0.4％，進(jìn)行再硬化，制得低聚果糖粗液；
經(jīng)檢測(cè)，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質(zhì)量百分比的56％以上；
(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質(zhì)量濃度為33～35％，經(jīng)離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。
實(shí)施例5
一種生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：
(1)向黑曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為12g/L，制得戊二醛質(zhì)量濃度為12g/L的混合液，在13～15℃、50rpm條件下反應(yīng)8h，菌懸液過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩，反復(fù)3次，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為450g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比1.1:1混合，將混合后的料液按1:3的質(zhì)量比加入到質(zhì)量百分比濃度為4％的氯化鈣溶液中，13～15℃硬化12h，過(guò)濾，制得固定化細(xì)胞；
所述固定液中含有質(zhì)量百分比濃度為0.75％的PEG600和質(zhì)量百分比濃度為3.5％的海藻酸鈉。
所述步驟(1)中低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液，按如下方法制備：
I、將菌株接種于活化培養(yǎng)基中，在溫度32℃的條件下活化培養(yǎng)66h，制得活化菌株；
所述活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，組分如下：
馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂19g、水1000mL，pH自然；
II、將步驟I制得的活化菌株接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度30～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速80rpm、通氣量1.5vvm的條件下培養(yǎng)19h，制得液體種子；
所述種子培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖6％、酵母膏5％、玉米粉2％，余量水，pH自然；
III、將步驟II制得的液體種子按體積百分比11％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃、攪拌轉(zhuǎn)速60rpm、通氣量0.7vvm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)32h，固液分離，制得菌體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下，均為重量百分比：
蔗糖10％、酵母膏3％、玉米粉0.5％，余量水，pH自然；
IV、將步驟III制得的菌體與工業(yè)用無(wú)鹽水混合，配制成菌體濃度為12g/L的低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液。
利用上述制備的固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括如下步驟：
(a)將生產(chǎn)低聚果糖的固定化細(xì)胞填料至高徑比為4的反應(yīng)柱中，向反應(yīng)柱中泵入質(zhì)量百分比濃度為53％的蔗糖溶液進(jìn)行柱式循環(huán)反應(yīng)，控制流量為4BV/h、溫度50～53℃、pH 5.2～5.7，糖化組分含量達(dá)標(biāo)后開始下一批糖化；每反應(yīng)3天后補(bǔ)加氯化鈣至質(zhì)量百分比濃度為0.3％，進(jìn)行再硬化，制得低聚果糖粗液；
經(jīng)檢測(cè)，低聚果糖粗液中低聚果糖含量占總固形物質(zhì)量百分比的56％以上；
(b)將步驟(a)制得的低聚果糖粗液稀釋至質(zhì)量濃度為33～35％，經(jīng)離子交換脫鹽，濃縮，制得低聚果糖糖漿。
對(duì)比例1
如實(shí)施例5所述的制備方法，不同之處在于：
(1)向黑曲霉低聚果糖產(chǎn)生菌的菌懸液中加入戊二醛，菌懸液的菌體質(zhì)量濃度為12g/L，制得戊二醛質(zhì)量濃度為30g/L的混合液，在13～15℃、50rpm條件下反應(yīng)8h，采用過(guò)篩、重懸、再過(guò)篩的方法，反復(fù)3～4次，制得交聯(lián)菌體；
(2)取步驟(1)制得的交聯(lián)菌體配制菌體濃度為450g/L的交聯(lián)菌體懸液，然后與固定液按質(zhì)量比1.2:1混合，再按1:4的質(zhì)量比加入質(zhì)量百分比濃度為4％的氯化鈣溶液，經(jīng)13～15℃硬化18h，過(guò)濾，制得固定化細(xì)胞；
實(shí)驗(yàn)例1
用實(shí)施例5和對(duì)比例1制備的固定化細(xì)胞開展糖化試驗(yàn)，采用相同的糖化條件和糖化時(shí)間，糖化組分情況見表1：
表1
注：上表中G、F、S、GF2、GF3、GF4分別代表葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖；FOS代表低聚果糖，其等于GF2、GF3、GF4三者的總和。
表1中X代表對(duì)比例1制備的固定化細(xì)胞，Y代表實(shí)施例5制備的固定化細(xì)胞；X或Y后的數(shù)字代表糖化的批次。
上表中數(shù)據(jù)為糖化了15批后的部分批次的數(shù)據(jù)，從上表數(shù)據(jù)可見：同一批次中，X所糖化的組分含量較低(不達(dá)標(biāo))，Y所糖化的組分含量較高；隨著糖化批次的增加，X所糖化的組分含量下降，而Y所糖化的組分含量相對(duì)穩(wěn)定。其可能原因?yàn)椋汗腔D(zhuǎn)移酶位于真菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，戊二醛的加入可將酶穩(wěn)固在膜壁之間。戊二醛作為交聯(lián)劑，在適宜的濃度范圍內(nèi)，有利于酶的穩(wěn)固。戊二醛濃度過(guò)低，對(duì)酶的穩(wěn)固作用較低；濃度過(guò)大，又會(huì)限制酶分子的催化作用，所以X所糖化的組分含量較低。
對(duì)比例2
如實(shí)施例5所述的利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖的方法，不同之處在于，糖化過(guò)程中不補(bǔ)充氯化鈣，即不進(jìn)行再次硬化。糖化15批后與糖化過(guò)程中補(bǔ)充氯化鈣的固定化細(xì)胞相比，情況見圖1：
圖中A指糖化過(guò)程中未補(bǔ)充氯化鈣的固定化顆粒(對(duì)比例2所制得的固定化顆粒)，B指糖化過(guò)程中補(bǔ)加氯化鈣的固定化顆粒(實(shí)施例5所制得的固定化顆粒)。兩種顆粒均為糖化15批后的固定化顆粒且初始重量相等；二者均浸泡在質(zhì)量濃度為40％的蔗糖溶液中。從圖中可見A顆粒大部分處于漂浮狀態(tài)，B顆粒大部分沉于燒杯底部。造成這樣現(xiàn)象的原因是：固定化顆粒在使用工程中，由于鈣離子的流失，導(dǎo)致固定化顆粒變得膨大松軟，密度降低；而經(jīng)常補(bǔ)加鈣離子的固定化顆粒，結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，較為緊實(shí)，與剛制備出來(lái)的時(shí)候相當(dāng)，密度較大，故沉于燒杯底部。值得注意的是，固定化顆粒變得膨大松軟后，所固定的細(xì)胞易于逃離出來(lái)，從而導(dǎo)致固定化顆粒酶活降低，糖化時(shí)間延長(zhǎng)，固定化顆粒使用批次減少；而經(jīng)常補(bǔ)加鈣離子可有效解決這一問(wèn)題。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。